JPS59102392A - 熱安定性を有するヒト尿キニノゲナーゼ水溶液の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 カリクレインは咄乳動物の血清、尿、１ｊ鞘藏、顎下腺
、腎臓なとの各種１藏器に広く分布している一種のたん
自分解酵素であるが、血漿中のキニノーゲン（こ作用し
てポリペプチドの一種カリンンを遊離する。このものが
平滑筋収縮作用、血圧降下作用、血流増加作用なとの生
理活性を顕わすので、特に豚膵臓カリクレインは可成り
古くから高血圧症、動詠硬化症、狭心症、更年期障害な
との医薬品として利用されている。しかしこのような異
種動物たん白に由来する薬剤を非径口的に人に投与する
と免疫反応による副作用のおそれがある。ヒト尿カリク
レインは原料尿の入手困難や含量が低いことなどで製造
原価が高くなるという理由から現在医薬品に利用されて
いないが、豚カリクレインと異なり抗体反応のおそれが
なく注射剤として副作用のない効果の適確な医薬品とし
ての開発か期待されている。

ヒト尿カリクレインは他の糖たん白質と同じように熱に
対する抵抗性が懸念されるが、強酸性又は強アルカリ性
では比較的低温度で失活する。しかしながら、本発明者
らの研究により弱酸性乃至弱アルカリ性では比較的熱に
強いことが明らかにされた（特願昭５７−１．１９［）
００月、特願昭５７−ＬＬ３３６４号）。本発明者らは
さらにヒト尿カリクレインの水製注射剤を開発する目的
でヒトカリクレイン注射剤用安定剤の研究を行なった。

その結果第１表に示すように多数の検体の中からクエン
酸ナトリウムが抜ＲＹの成績を示（−１優秀なカリクレ
イン熱安定剤となり得ることを知った。）第１表ヒ１〜
尿カリクレイン水溶液安定剤スクリーニング［０，９％
ＮａＣ１添加リン酸緩衝液（ｐＨ７，ｔ））にカリクレ
イン３ＩＩＪ／ｒｒｒｅを溶解し、安定剤添加、７０℃
、７日間保存」（表中において以下の略称を用いた） 日局：日本薬局方 食添：食品添加物公定書 枡原基：化わ１：品原料基準 ＵＳＰ：アメリカ薬局方 和光：和光ヤＬ桑■製 そこでクエン酸すトリウムに的を絞り、実施例に示すよ
うに加熱温度を６０°、６５°、７０°に設定し、クエ
ン酸す］・リウム無添加及Ｏ・添加時におけるヒト尿カ
リクレイン水溶液のカリクレイン活性の残存率について
祥細な実験を行ない極めて興味ある成績を得た（実施例
参照）が、その結果を総括するとつきのようである。

ヒト尿カリクレイン水溶液をそのま＼６０°〜６５′Ｃ
に加熱すると約１週間でカリクレイン活性は５０〜２０
６２まで低下するが、これにクエン酸ナトリウムを適当
量添力１１するに記の条件で９０％以」−の活性が保持
される。従ってヒトカリクレイン水性注射液にクエン酸
ナトリウムを添加することにより、その形で殺ウィルス
、間、玖誠菌なとの加、私操作を行なうことが可能にな
った。また以上の実験は１１：、射薬としての加速試験
、昨酷試験と考えることかでき室温における長期保存も
可能にしたものである。

本発明はこれらの知見に基づくもので、ヒト尿カリクレ
インの水溶液にクエン酸塩を溶存させることを特徴とす
る熱安定性を有するヒト尿カリクレイン水溶液の製造法
である。

クエン酸塩としては水溶性塩が用いられ、また水溶液を
たとえば注射用に供するためには薬学的に許容されうる
塩が用いられる。その例としては、クエン酸すトリウム
、クエン酸カリウムが挙げられる。これらは所望により
中性塩もしくは酸性塩として溶存させることができ、塩
の形で水溶液に加えてもよく、また、たとえは遊離のク
エン酸を水溶液加え次いて中和して水溶液中で塩を形成
させてもよい。

溶存するクエン酸塩の水溶液中における濃度は約１−５
％程度が好ましい。

ヒト尿カリクレイン水Ｉ溶液中にはクエン酸塩以外に、
必要に応じて、塩化ナトリウムのような浸透圧整剤なと
を加えてもよい。

以下に示す実施例においては理解を容易にするために本
発明の態様か対照（クエン酸塩無添加）と比較して説明
される。。

実施例１ １実験材料 ン１）クエン酸ナトリウム（Ｎａ５Ｃ６）１５０７・２
Ｈ２０）各０．１．２．２．４．３．６．４１．８．６
．０％の水溶液をつくる。０，１２，２．４％のクエン
酸すｌ・リウム液の浸透ＩＺＥ比は１．０以下であるの
てこれらの液にそれぞれ０６８％、０３７％、００９％
の塩化すトリウムを加えて浸透圧比が１．０になるよう
にした。３．６、４．８、６．０％の液は浸透圧比か１
０を超過しているので塩化ナトリウムは加えないく） １〕）ヒ］・尿カリクレイン水溶液（１７３，４ＫＵ／
ｎ＋Ｃ）２、６ｍｅにａ）の各濃度のクエン酸ナトリウ
ム液１２、４ｒＪすツヲ加吃、ヒト尿カリクレイン：３
０ＫＩＪ／ｍｅ＋クエン酸ナトリウムＯ〜５％の溶液を
得、各溶液をｌ〃ｌ（のアンプルに０．５ｍｅずつ分注
、閉管して検体上する３、 ２実験方法 以下の４種類の温度および時間の条件を設定して実験し
、実験前、実験後の各検体のカリクレイン活性を測定し
、実験前の検体の活性を１００％とし実験後の検体の活
性残存率を計算した。

３測定法 カリクレイン活性の測定はＭＣＡ基質氷解活性法（註）
で行なった。基質としてプロリン−フェニールアラニン
−アルギニン−メチル・クマリンアマイドを用いた。。

μｌを加え、これを３７゛Ｃて５分間プレインキユヘー
トし、これにサンプル液の２００倍希釈液を１００／Ｉ
Ｉ！加え１０分間インキユベーした後、水冷して１０％
酢酸２０７１１を加えて分光蛍光々変態（機種ＲＦ−５
１０島津製）にかけ波長３８０ｎｍて励起し４６０ｎｍ
の蛍光々度を測定する。スタンタートとして５ｎＭ−ア
ミノメチルクマリンを第４表ヒト尿カリクレイン熱安定
性（７０°Ｃ９６時間） 以上の結果から次のように結論される１、＋１１６０°
Ｃに１週間保存した場合、クエン酸ナトリウム無添加で
はカリクレインの活性は５０％近くまで低下するが、ク
エン酸ナトリウムを１〜５％添加したものでは９０〜９
８％の残存率を示し、本条件ではクエン酸ナトリウムを
添加することは極めて有効である。

＋２１６５”Ｃに保存した場合、クエン酸ナトリウム無
添加ではカリクレインの残存率は１日間で６０％以下５
日間で２０％１０日間では１０％近くまで低下するが、
クエン酸ナトリウムを１〜５％添加したものは１日間で
９５〜９８％以」二、５日間で７５〜８８％、ｌＯ日日
間６０〜８５％の残存率を示しクエン酸ナトリウムが非
常に有効に作用していることが分る。

（３）加温７０°Ｃの場合、クエン酸ナトリウム無添加
ては残存率は２時間で約７０％に、４時間で約６０％に
、６時間では５０％まで低下する。クエン酸ナトリウム
を添加すると残存率は２時間で８０〜８５％に、４時間
で７０〜７８％に、６時間で７０〜７５％に低下するが
、無添加に比してクエン酸ナトリウムが有効に働いてい
ることが分る５、実施例２ 実験材料 １）クエン酸カリウム（Ｋ３Ｃ６Ｈ５０７・Ｈ２Ｑ和光
純薬製）４・、０％の水溶液をつくる。この溶液の浸透
圧比は略１０であるので塩化す）ＩＪウムを加えない。

ヒト尿カリクレイン溶Ｈ（１７，４ＫＵ、Ａｎｅ）２．
６ｍｅに上記クエン酸カリウム液Ｌ２．４ｍｅを加える
。

この溶液はクエン酸ナトリウム３．０％液と同一のクエ
ン酸イオンを含有する。この溶液をｌｍｅのアンプルに
（１，５ｍｅずつ分注、閉管して検体とする。

２）クエン塩無添加及びクエン酸ナトリウム３％添加カ
リクレイン液は実施例１と同様にしてつくる。

実験方法及び測定は実施例１の７０°Ｃ加温の場合と同
様に行なった。結果は第５表に示すとおりカリクレイン
水溶液にクエン酸カリウムを３３％添加した液はクエン
酸ナトリウムを３．０％添加した液と同様に無添加のカ
リクレイン液に比して著しい熱安定性を示した。

第５表 （註） 実施例におけるヒト尿カリクレインの単位は、本発明者
等がヒト尿から抽出精製したヒト尿カリクレインを血管
拡張測定法（ｊｏｕｒｎａｅｏｆＢｉｏｃｂｅｍｉｓｔ
ｒｙ、５８．２０１（１９６５））により単位を決定し
、これを標準品として蛍光合成基質法（ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｊ３Ｊ１４９５（１９７
７））により測定した。

【図面の簡単な説明】

第１図は６０℃、１週間、第２図は６５°Ｃ，１０日間
、第３図は７０”Ｃ，ｆｉ待時間加熱試１ｋｌこお番す
るヒト尿カリクレイン水溶液中のカリクレインの残存率
を示すグラフである。 代理人弁理士性内臭 第１図 ’／Ｔ−ン西ＥＪト’）’）Ａ○ｏ％、・／’１ｍ、Ａ
２％、ロ３％、■４％、△５’Ａ第２図 ０ＩＩ）Ｉ クエン酸ナトリウム○Ｏ％、・１％、ム２ヅヘロ３豹■
４％、Δ５％手続宥■Ｊ上−出（自発） 昭和５８年ｊ）］１１３ 日訂庁長官殿 １、事件の表示昭和５１年特Ｗ［願第２１２５３２号２
、発明の名称 熱安定性をイｍｌるヒ１−尿）Ｊリフレイン水溶液の製
造法 ３、補正をりる者 事ｆ′１−どの関係特ｎ出願人 住所兵沖県神戸市東灘区御影木町３」目４番２０号 名称日木ケミカルリリーチ株式会社 代表貨芦１）信 ４、代理人 ５、補正の対象代理権をＶＬづる出面及び明細補正の内
容 明細古第３頁第６行の「■Ｕ」をｒＫＵ−１に訂正づる
。 同第５〕頁第９ｈの１旧１を［詳細」に訂正、同頁干か
ら６ｔ７１］の「添加づる」と１−上記の１の間に「ど
」を押入りる。 同第６頁下１）Ｓｌら７行目の「水溶液加え」を「水溶
液に加え」に８１正し、同頁未行の［避圧」と「整剤」
の間に口１を挿入する。 同第１１與第７行く第４表中、クエン酸す１ヘリウム１
％、６時間の欄）のｒ４３８６０Ｊを［４３８，６０Ｊ
に訂正づる。 以上 手続補正書（ｌ−醗） 昭和５８年／７月３０日 斗Ｎ許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５７年？４＋’ｌｌ１ｊ１を第２］２５３２シじ事
件との関係９、・ｌ’＋ｊ’ｌ出願人出願人用１兵１小
県神戸山東灘区御影本町３丁１１４番２０−Ｑ名［ｊ１
１本ケミソ、ルリづ一チ株式会ｔ１５、ｉｌｉｉＥＱ’
、ゝの［］付昭和年月日拒絶理由通知 （発送日、昭和年月日イ」） 別紙の；ｎｊ１１ 明細書第１４頁下から２行目と３１？」［］の間に次の
記載を挿入する。 実ｆｉ１列３ 実施例１に倣いヒト尿カリクレイン溶液にクエン酸ナト
リウム０．１〜１．０％（及びゼラチン０．１％）を添
加してヒト尿カリクレイン溶２ｆＶｃ７１する熱安定性
及び経時変化について実験した。 実験倒斜 ヒト尿カリクレイン３０ＫＵ／ｍＺの溶液にクエン酸す
トリウム０．１％、０．２５％、０５％、１０％を添加
し、ざらに塩化ナトリウムで浸透圧を１．０とＬ５これ
らの溶液を１ｍｌのアンプルＫＯ，５ｍｌずつ封入して
試料とした。 実験方法 湿度を室温、５０℃、６０℃に、時間を０〜９０日の条
件を設定し実験前の活性を１００％とし、−宇時間後の
活性残存率を測定した。 測定法 実施例１と同しくＭＣＡ基質水１１ｒｌ活性法で行なっ
た０ ′ノ（験結束 クエン酸ナトリウｌｘＱ、］〜１．０％を添加したヒト
尿カリクレイン液の熱安定性の実験結果は第６〜８表に
示Ｌｌｅ。 １記の各表から次のように結論される。／（１）室温で
９０１−１保仔した場合、安定剤／（（Ｃ添加ても３０
１１で９２．４％、６０１」で９１．１％、９０目で９
２３％の残存率でかなり安定であるか、クエン酸すｌ・
リウム０．１〜１．０％を添加しｋものは９゜［ｊで平
均９３．６％で室温では添加剤の活性安定効果はは々ん
と見られなかった。 （２）５０℃で９０ＥＩ間保存した場合、安定剤無添加
の２き、残存率は３０目で９８６９％、６０日で８３．
９％、９０にＩで７８．０％とカリクレイン活性は低ド
するか、クエン酸ナトリウム０．１〜１０％添廂すると
３０［１で９８．５％以１−１６０［ＩＴ９３．８％以
１−１９０［１では９３５〜９９．２％となり、添１川
占１１の郊Ｊ’Ａ’、１１１１Ｊド）かである。 ｆ：３１Ｂ＋１℃で６０１１保存した場合、無添加では
残＋’？’ｌｉ、、ｔ７１１−ｃ７６％、１４日で４２
％、３０１ＥＪＴ３９％、６０日では２．７８％と活性
は日と共に減少１６０Ｆｌではほとんど活性がなくなる
。ところがクエン酸ナトリウム０．１〜１．０％添加す
ると１４日までは活性はほとんど１００％保持智ね、３
０日で残存率６５〜７７％になる。以上の結果の々おリ
ヒト尿カリクレイン溶液にクエン酸ナトリウム０．１〜
１．０％を添加した場合、室温、９０日では添加剤の有
無に有意差はないか、５０℃、６０℃に温度上げて加速
試験を行えばクエン酸す）ＩＪウムの添加により有為に
安定化効果か認められる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ヒト尿カリクレインの水溶液にクエン酸塩を溶存させ
   ることを特徴とする熱安定性を有するヒト尿カリクレイ
   ン水溶液の製造法。 ２クエン酸塩を約１−５％の濃度で溶存させる特許請求
   の範囲第１項記載の製造法。 ３クエン酸塩がクエン酸ナトリウムもしくはカリウムで
   ある特許請求の範囲第１項または第２項記載の製造法。