JPS59109200A

JPS59109200A - 尿酸測定試薬

Info

Publication number: JPS59109200A
Application number: JP22101582A
Authority: JP
Inventors: Itoshi Omori; 大森　五十士; Kazunobu Tanno; 和信丹野
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Resonac Corp
Priority date: 1982-12-15
Filing date: 1982-12-15
Publication date: 1984-06-23

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はフローインジェクション（連続流れ）分析法に
適した尿酸測定試薬に関する。

さらに詳しくは１本発明は、フローインジェクション分
析法１１Ｃｓいて、試料と試薬の反応状態を吸″＃、Ｉ
更の測定により行ない、しかも核吸光ｊｔを三波長で測
定し、吸光度の差を記録ｒることにより、尿酸の量を測
定する方法に適した尿酸測定試薬に関する。

近年、細管中の連続的な液体の流れの中に。

試薬及び試料を注入（インジェクト）シ、試料と試薬が
細管の中を移動する間に試薬と試料が混合され１反応し
、この状態を適当な検出器（吸光度測定装置）で検出し
、目的成分を定量するフローインジェクション分析法が
発達してきた〔ジエイ・ルツイカ（Ｊ、　Ｒｕｚｉｃｋ
ａ）、イー・エッチ＋ハンセン（Ｅ、　Ｉ−Ｔ、　ｆ（
ａｎｓｅｎ）著：アナリテイ力・シミ力・アクタ（Ａｎ
ａｌ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ）。

第１０６巻第２０７頁（１９７９）１．この方法ではキ
ャリアとして、試薬を流ｒこともできるが、水又は緩衝
液を流すことができれば経済性の祖で大きな利壱がある
。しかしながらキャリアとして水又は緩衝液を使った場
合、フローセル中での反応の状態を比色的に検出する（
吸光度を測定する）ときに、水又は緩衝液と試薬あるい
は水又は緩衝液と試料の屈折率の差に起因する見かけの
吸光度の変化（いわゆるゴースト）が生じ、これが大き
な障害となって、正確な測定値が得られない。

この難点を解消する有効な手段の一つは、検出波長を一
波長ではなく三波長（主波長と副波長）とすることであ
る。この場合、　　にＭｉ：ゴーストの影響を小さくす
るために主波長における吸光度から副波長における吸光
度を差し引いた値が記録針により記録され、この値をも
とに検量線の作成および尿酸量の決定がなされる。

そこで１例えば血清中の尿酸を、公知の尿酸測定試薬（
色原体、ウリカーゼ、パーオキシダーゼおよびｐＨ緩衝
剤を含む）を用いて、上記のフローインジェクション法
で測定しようとする場合、測定波長は尿酸と試薬の反応
生成物の極大吸収（５５０ｎｍ付近、赤〜赤宵色）を主
波長に選び、血清中にほとんど吸収のない長波長側（例
えば６６　Ｑｎｌｎ、　７００ｎＩｎ　）を副波長トシ
テ測定することが推奨される。しかしながら、第１図に
尿酸測定試薬の波長に対する吸＃、ＩＷ曲線を示ｔが、
これより明らかなように可視領域でほとんど吸収がない
にもかかわらず、公知の尿酸測定試薬を用いてフローイ
ンジェクション法で分析しようとすると記録計に記録さ
れるピークがプラス側及びマイナス側に変化し、しかも
。

ピーク数が２以にになる不都合が生じる。第２図に１種
々の濃度の尿酸を含む水溶液を上記フローインジェクシ
ョン法で分析した結果を示す。

第２図において、吸光度は、主波長５４６０ｍの吸光度
から副波長６５Ｑｎｍの吸光度を差し引いた値である。

曲線１．２．３．４．５および６は。

それぞれ、尿酸Ｏｍ９／ｄ１．２ｍ９７ｄ１．４ｍ９／
ｄｌ。

６ｍ９７ｄｅ、　　８１ｎ９／ｄｉおよび１０１Ｑ＃Ｊ
に関する結果であり、各サンプルおよび試薬の注入時へ
は、各曲線の開始時である。第２図右下に時間スケール
１分を示す。

第３図は第２図の各測定におけるピーク高さく主波長の
吸光度から副波長の吸光度を差し引いた値）と尿酸の濃
度の関係をグラフに表わしたもので１通常検量線として
使用できるものであるが、第３図から明らかなように検
−ｉ゛線は。

尿酸が低濃度範囲で直線性からのズレが大きい。

これは試薬とキャリアの屈折率の差に起因する吸光度の
変化（いわゆるゴーストピーク）が試別と試薬のあいだ
の反応生成物の吸光度変化に加算されているからにほか
ならない。従って。

検を線を直線に近似して試料中の尿酸を測定しようとす
ると尿酸が低濃度範囲の試料は実際よりも低めに測定さ
れる。

本発明は、このような問題点を解決するものであり、ピ
ークがプラス側及びマイナス側に変化しないような試薬
組成について研究した結果。

特定の色素を添加した尿酸測定試薬を用いれば。

プラス側及びマイナス側に変化するピークはなくなり、
試、１中の尿酸を測定できることがわかり１本発明を完
成するに至ったっすなわち１本発明は２色原体、ウリカーセ。

パーオキシダーゼ、ｐＨ緩衝剤および主波長の吸光度が
副波長の吸−Ｊｔ、度よりも光路長１０闘当り０．０１
〜１高くなるように色素を含有してなる尿酸測定試薬に
関する。

本発明の尿酸測定試薬は試料（例えば血清や尿のような
生物の体液）中の尿酸を測定するだめの分析に使用され
る。この分析は次式に基づいている。

＝５＝試料中の尿酸濃度はキノン化合物の生成に伴う赤〜赤ｗ
色（極大吸収波長５５００ｍ付近）の吸光度を三波長（
主波長と副波長）で測定し。

主波長の吸光度から副波長の吸光度を皓し引いた値の増
加量を測定することによって決定される。

本発明に使用される上記色素としては、測定波長で吸収
のある化学物質ならば何でもよいが。

好ましくは赤色ないしは春宵色波長で測定するため、赤
色あるいは青色色素がよく、このよう＆もの、！：して
アマランス、エリスロシン、ニューコクシン、フロキシ
ン、ローズベンガル、アシッドレッド、フェノールフタ
レイン、エバンスブルー、ブリリアントブルーＦＣＦ　
、インジゴカーミン、アシッドバイオレット６Ｂなどが
あるが、試薬と尿酸の反応を妨害せず、かつ尿酸測定試
薬に添加する色素自体が安定で、退色し一６一ないものであれば、その種類は重要ではない。

本発明に使用される色素の使用量は副波長での吸光度よ
りも主波長における吸光度がセルの光路長１０１１１１
当り、０．０１〜１．好ましくは０．０５〜０．５大き
くなるような量である。色素の濃度がこれより小さいと
、第２図の曲線１に示されるようなプラス側及びマイナ
ス側に変化するピークがあられれ、またこれより大きい
と検出器のノイズが大きくなり、正確な尿酸の測定が不
可能となる。

本発明に使用される色原体は第１及び第２の成分から成
る。

第１の成分としては、４−アミノアンチビリｙ、　３−
）　チル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンなどがあ
る。第２の成分としてはフェノール、ｐ−クロルフェノ
ール、２＋４−ジクロルフェノールなどのフェノール及
びその誘導体。

Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、３−メチル−Ｎ−エチル−
Ｎ−ヒドロキシエチルアニリンナトのア二ＩＪン誘導体
などがある。色原体の厳密な濃度は重装ではないが試薬
１１あたり第１の成分および第２の成分それぞれ好まし
くは０．１〜５ミリモル、特に好ましくは約０５ミリモ
ル存在させる。

ウリカーゼとしては、動物起源のもの、植物起源のもの
、微生物起源のものなどがある、ウリカーゼの厳密な重
要は重要ではないが、試薬１１あたり好ましくは５０〜
５００単位、特に好ましくは約２００単位存在させる。

パーオキシダーゼとしては植物（西洋ワサビなど）起源
のもの、微生物起源のものなどがある。パーオキシダー
ゼの厳屑な濃度は重要ではないが試薬１１あたり好まし
くは１００〜４０００単位、特に好ましくは約１０００
単位存在させる。

なおウリカーゼおよびパーオキシダーゼの使用量は少な
すぎると反応が十分に完結せず、また多すぎると経済性
の面で高価となる。

ｐＨ緩衝剤としてはリン酸塩（−水素リン酸塩と二水素
リン酸塩の組合せ、塩としてはＮａ塩。

■（塩等がある）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタンと塩酸の、組合せ、ピペラジン−Ｎ。

Ｎ′−ビス−〔２−エタンスルホン酸〕と水酸化す）　
ＩＪウムの組合せ等がある。ｐ　Ｈ緩衝剤は、試料と試
薬を十分反応させるため試薬のｐＨが６〜８になるよう
に添加するのが好ましい。その厳密な濃度は重要でない
が、緩衝作用を有する成分は試薬ＩＩあたり１０〜２０
０　ミＩＪモル存在させるのが軽重しい。

本発明の尿酸４１１１定試薬には、Ｍ立ち防ＩＩ；のた
めに非イオン界面活性剤を加えてもよい。加えるときは
試薬１１あたり０．１〜５ψ使用されるのが好ましい。

本発明の尿酸測定試薬は、水溶液として使用されるが、
用時に、ウリカーゼ、パーオキシダーゼ及び色原体の第
１の成分をこれら以外の成分を予め溶解した水溶液に添
加して調整し、使用するのが好ましい。

本発明の尿酸測定試薬を使用して、尿酸を測定をする場
合、吸光度の測定波長は、適宜決定−〇− すればよいが、主波長として赤〜赤青色極大吸収波長で
ある５５Ｑｎｍ付近を採用するのが好ましい。副波長と
して主波長より大きく９例えば６６０ｎｍ、７００ｎｍ
等の波長が採用される。

次に９本発明の実施例を示す。

実施例１精製水１１にリン酸−力１１ウム６．２！２．　　リン
酸二カリウム９．５５’、４−アミノアンチピリン０５
ハリモル、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエ
チルアニリン０．３ミリモル、ウリカーゼ２００単位、
パーオキシダーゼ１０００学位、アマランス１．４ｍ９
および非イオン界面活性剤（トリトンｘ−ｉｏｏ、　ロ
ーム・アンド・ハース社商品名）　０．２５ｇを溶解し
、試薬とした。この試薬のｏＴ視郡部吸収スペクトル第
４図に示した。

この試薬を使用して尿酸の測定を行なった。第５図に、
この測定に用いたフローインジェクション分析装置の模
式図を示す。送液ポンプ（ピストンポンプ）７により導
管８にギヤリアとしての水が送液される。導管８は途中
に、サンプル添加装１０− 置９を有する導管１０および試薬添加装置１１を有する
導管１２に分かれ、これらの導管は反応管１３に合流す
る。反応管１３は分光光度計１４に導かれ、ここで試薬
と試料の反応状態が三波長（主波長５４６０ｍと副波艮
６６０１１１１１）により吸光度として測定される。な
お９図示しないが反応管１３は恒温槽内に保持され１分
光光度計１４には。

溶出時間に対する吸光度（主波長の吸光度から副波長の
吸光度を差し引いた値）が記録される記録計が連結され
る。なお３分光光度計のセルの光路長はｌ□ｍ＋Ｉ＋で
ある。従って第４図より明らかなように、光路長１０ｍ
ｍ当り主波長の吸光度は副波長の吸光度より約０．０４
大きい。

試料１０μぎおよび試薬２００μｅを同時に注入し。

注入後２分間分光光度ぼｔ内のフローセルでの反応状態
を主波長５４５ｎｌｎ、副彼長６６０ｎｍでモニターす
る。試料液としては１００ｍ１当り、尿酸Ｏ＋ｎ９゜２
ダ、４〜，６ダ、８ｆｖおよび１０ダをぎむ水溶液を使
用した。各試料の測定結果を第６図に示した。第６図は
、各測定におけるピーク高さく主波長の吸光度から副波
長の吸光度を差し引いた値）と尿酸濃度の関係が直線関
係にあることを示す。

第６図は検量線として使用できる。

実施例２人の血清４０例について、実施例１と同様に測定し、尿
酸を測定した結果と、従来技術の用手法〔金井泉、金井
正光［臨床検裔法提要１　（改訂第２８版、金原出版株
式会社）■−４３ページ制載の方法］による結果を比較
した。両方法の相関係Ｍｒｌは０．９９２で１回帰直線
はｙ（本発明の試薬を用いたフローインジェクション分
Ｉｆｆ法）＝１．００Ｘ（用手法）−０，２であった。

両方法の相関図を第７図に示す。

実施例３アマランス１．４　Ｉｎ９の代すにエバンスブルー３〜
を用いた以外は実施例１と同様な方法で尿酸の測定を行
なった。

尿酸の濃度とピーク高さの測定結果（検喝−線）を第８
図に示す。

本発明によれば、三波長により吸光度を測定するフロー
インジエクノヨン分析法で尿酸を分析するとき、プラス
測及びマイナス側に変化するピークが出現せず、かつピ
ークが２以上に分かれることもない。従って記録計によ
って記録されるフローパターン（溶出時間に対する主波
長の吸光度から副波長の吸光度を差（〜引いた値の曲線
）からピーク高さあるいはピーク面積を求めれば、試料
中の尿酸の濃度を正確に測定できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は公知の尿酸測定試薬の町祝部吸収スペクトル、
第２図は公知の尿酸測定試薬を用い。フローインジェクション法で尿酸水溶液を分析したとき
のフローパターン、第３図は第２図から得た検１線、第
４図は本発明による尿酸測定試薬の可視部吸収スペクト
ル、第５図はフローインジェクション分析装置の模式図
、第６図は実施例１において得た検量線および第７図は
実施例２において人の血清４ｏ検本全、従来技術の用手
法で分析した結果と９本発明による試薬を使用してフロ
ーインジエクンヨン分析法で分１３− 析した結果、第８図は実施例３において、尿酸の濃度と
ピーク高さの関係を表わした検量線を示す。符号の説明７・・・送液ポンプ　　　　　８・・・導管９・・・サ
ンプル添加装置ｔ　　１０・・・導管１１・・・試薬添
加装置　　　１２・・・導管１３・・・反応管　　　　
　　　１４・・・分光光度計１４− 第７　口 ↑

Claims

【特許請求の範囲】１、色原体、ウリカーゼ、パーオキシダーゼ。ｐＨ緩衝剤および主波長の吸光度が副波長の吸光度より
も光路長１０ｆｌ当り０．０１〜１高くなるように色素
を含有してなる尿酸測定試薬。