JPS59125065A - 固相免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、固相免疫測定法、特に不溶性の支持体に結合
されたアルデヒド／蛋白質複合体を用いる固相免疫測定
の改良法を調製する方法に関する。本発明はまた、免疫
測定の操作法および在来の放射免疫測定法、酵素−免疫
測定法および螢光免疫測定法を用いてもよい免疫測定用
「キット」に関する。

同相免疫測定法のために多くの方法が提案されてきた。

これらの方法は能動的および受動的吸着の両方の技術を
用いてき几。受動的技術の一つは米国特許第３．６４６
，５４６号明細書中に開示されており、その方法中にお
いて試験管のような水不溶性材料の内表面が蛋白質と接
触せしめられ、その場合表面は受動的吸゛着により被覆
される。被覆された試験管は次に標識付物質の既知量の
存在下において測定されるべき物質を含有する水性の試
料と接触せしめられる。この操作法は本来は成功をもた
らすが、受動的に被覆された蛋白質において典型的に発
生する短所は測定のためのインキュベーション中に脱着
されやすくその結果測定値が不同になることである。

受動的吸着に伴うこのような難点を能動的吸着技術によ
り克服する企てがなされた。この後者の技術は蛋白質を
固体の支持体に結合させるために共有結合剤の使用を第
−義的に包含している。このような技術の一つはＢａｒ
ｒｅｔ氏による米国特許第４，００１，５８５号明細書
中に開示されており、そこでは生物体物質が脂肪族アミ
ンまたはジアミンによる前処理を受けたかまたは受けな
いで予め内表面をグルタルアルデヒドで被覆されたプラ
スチック材料に共有結合せしめられる。Ｂａｒｒｅｔｔ
氏は、プラスチック表面におけるアルデヒド物質の自己
重合に続いて蛋白質が活性の未反応アルデヒド基とシッ
フ反応塩基型に結合することによｐ共役結合が達成され
ると主張している。

他の方法はＰａｒｓｏｎｓ氏に付与された能動的吸着技
術を実施する米国特許第４，０６９，５５２号明細書中
に記述されている。Ｐａｒｓｏｎｓ氏は低力価の抗血清
を交差結合せしめて分子量の増大した蛋白質構造を形成
することにより調製された固相免疫吸着剤を開示してい
る。一般的に最適の結果を得るために望まれる交差結合
の程度は、交差結合されない出発物質すなわち交差結合
されない抗体または結合性蛋白質の分子量の２〜５倍で
ある。交差結合された低力価の材料は、ついで試験管の
ような水不溶性重合体材料の表面に吸着せしめられる。

眼差反応ｈｐＨｓ〜１０において実施される。Ｐａｒｓ
ｏｎｓ氏はこの臨界的ｐＨにおいて抗血清を重合体材料
の表面に接触せしめる前にグルタルアルデヒドのよりな
二管能性の試薬を用いて交差結合操作を実施することを
開示している。

同相免疫測定を用意するにあタリ、予期しない方法が発
見されたが、それには当初の結合性蛋白質の交差結合を
もたらしたりまたは当初の結合性蛋白質の分子量増大を
もたらすことのないアルデヒドで予め処理した蛋白質を
用いる。

本発明によりアルデヒド化合物が用いられる場合には、
高力価抗血清の結合促進が達成される。

さらに特定的には、本発明は特異的結合性蛋白質を精製
し、その蛋白質の疎水性をその蛋白質の交差結合あるい
は重合を伴なうことなく増強するためにアルデヒドと反
応させ、その増強された疎水性を有する特異的結合性蛋
白質を緩衝液の存在下で不溶性支持体の表面と接触させ
てその表面に特異的結合性蛋白質を結合せしめ、またそ
の固相表面から結合されない蛋白質を除去することより
なる固相免疫測定を調製する方法に関する。

添付図面において、第１図は実施例４中に記述されてい
るアルデヒドとの反応前の特異的結合性蛋白質の分子量
特性を示す。第２図は実施例４中に記述されているアル
デヒドとの反応後の特異的結合性蛋白質の分子量特性を
示す。

本明細書で用いられる場合の「％異的結合性蛋白質」な
る語は血清蛋白質の一部を意味し、それはまたガンマ、
グロブリンまたは免疫グロブリンともよばれ、そしてそ
れらは抗体、抗原または不完全抗原と特異的に反応する
。特異的結合性蛋白質の大部分はＩｇＧとして仰られる
亜群に属するが、他の亜群は工ｇＡｓ　　１８Ｍ１工ｇ
Ｄ１および工ｇＥとよばれる。この語はまたある種の抗
原を認識するある種の結合性蛋白質たとえばチロキシン
に対抗するチロキシン結合性蛋白質を包括して用いられ
る。本明細書に用いられる「キット」なる語は測定用試
験管および免疫測定を実施するに必要な教示をも含めて
化学薬品のすべてまたは一部の集成を意味する。

本発明の方法に用いられる特異的縮合性蛋白質は、予め
精製されたいかなる抗血清でもよい。

好適には特異的結合性蛋白質は、不溶性の支持体に結合
せしめられたときに特異的結合性蛋白質中の有効成分の
特異的免疫グロブリン効率を増大せしめつつ他方非免疫
グロブリン画分の非特異的結合を減少せしめるように精
製される。

必須的でない両分を除去するために特異的結合性蛋白質
を精製するには在来のどの精製法を用いてもよい。この
ような精製操ヂ１は、好適には血清アルブミンα−１お
よびα−２を残余の混合血清グロブリンから除去をもた
らす。β−グロブリンの除去は必要でなく、もし除去さ
れれば尿試料中に存在する特異的結合性蛋白質を量的に
減少せしめることがある。

代表的な精製操作は硫酸アンモニウムを用いて免疫グロ
ブリンを沈殿せしめる在来の沈殿法（例えば米国特許第
４，０６９，５５２号明細書参照〕ま友はエトキシアク
リジンのような可溶化作用有機溶媒を用いる望ましくな
い物質の除去を包含する。後者の技術には特異的結合性
蛋白質の選択的可溶化および残余の必須でない両分の沈
殿を包含する。一旦回収されれば、精製された特異的結
合性蛋白質は使用されるかまたは使用可能になるまで貯
蔵される。

一旦精製された特異的結合性蛋白質は次いでアルデヒド
化合物と反応せしめられる。予期されざることには、可
溶性の結合蛋白質は、蛋白質の不溶性支持体への結合親
和性を増大せしめかつ蛋白質を交差結合せしめること、
蛋白質的を重合せしめることあるいは蛋白質の分子量を
増大せしめることなしにアルデヒドと反応せしめ得るこ
とが見出された。

この効果の正確な操作は未刈ではあるが、それぞれの結
合蛋白質のアルデヒドへのカルボニル付加反応および／
ま次は酸によシ触媒されるカルボニル付加反応の結果で
あると信じられている。これらの反応は下記の代表例に
示されており、そこにおいて「ｚ」は特異的結合性蛋白
質上の利用可能なアミン基であ５、Ｒは水素、アルキル
基またはアリール基である。

カルボニル付加反応 酸により触媒されるカルボニル付加反応記述された反応
は酸性および塩基性の狭い範囲において生起し得る。最
適の反応を確保するために、反応中ｐＨを調節するため
の緩衝液の使用が好適であることが見出された。緩衝液
がｐＨを約６．０〜約７．８、好適には約７．０〜約Ｚ
５に調節するに適した量用いられた場合に、受容可能な
物質が得られる。蛋白質の変性を避けるためにｐＨ７，
８以上の値は用いられず、またｐＨ６，０以下の値は酸
による加水分解をもたらすことがある。蛋白質の特性に
影響しない任意の適当な緩衝液が選択使用できる。これ
に限定されることなく有効な緩衝液には炭酸ナトリウム
、炭酸カリウム、燐酸ナトリウム（二塩基性および／ま
たは一塩基性〕、燐酸カリウム（二塩基性および−塩基
性〕、適当な緩衝性塩基中の塩化ナトリウム、適当な緩
衝性塩基中の塩化カリウム、およびそれらの混合物が包
含される。成分を一旦混合した後にそれらを約３７℃以
下の温度で充分な時間アルデヒド／蛋白質複合体を形成
するために反応せしめる。温度は４〜３７Ｃの間、最適
の効率のために好適には２０〜３０℃の間に保たれる。

反応時間は数分ないし数時間にわたる大きな差異がある
が、好適には５〜６０分である。

本発明に用いられるアルデヒド化合物は、水溶性の単官
能性および二官能性試薬の多種類のなかから選定され得
る。代表的な水溶性単官能性物質は一般式０ＣＲ−Ｒ（
ただし式中Ｒ１′ｉ水素、アルナル基またはアリール基
である）により表ワサれる。代表的化合物はホルムアル
デヒ１−’、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド
、ｎ−ブチルアルデヒドおよびベンツアルデヒドならび
にそれらの混合物を包含するが、好適にはホルムアルデ
ヒドである。

代表的な水溶性二官能性物質は一般式 ０ＨＣ−（Ｒ）ｎ−ＣＨＯ（ただし式中Ｒは−（ＣＨ２
）−でありそしてｎは２〜１０の整数である〕で表わさ
れる。

アルキル基ならば例えばグルタルアルデヒド、単環状ア
ルキル基ならば例えばシクロペンチルまたはシクロヘキ
シルアルデヒド、単環状アリール基ならば例えばフェニ
ルアルデヒド、二項状アリール基ならば例えばナフチル
アルデヒド、置換環状アルカン基ま友は置換単環状アリ
ール基ならばトリルアルデヒド、ならびにそれらの混合
物であり得る。好適な二官能性アルデヒドはグルタルア
ルデヒドである。

反応生成物は、蛋白質の交差結合、蛋白質の重合または
蛋白質の分子゛量増大を示さないアルデヒド特異的結合
性蛋白質である。

かくして得られたアルデヒド特異的結合性蛋白質はつぎ
に不溶性の支持体と接触せしめられそしてその支持体の
内表面に結合せしめられる。この反応は上記の反応生成
物を不溶性支持体の存在下で適当な温度においてまた緩
衝液の存在を必須としてインキュベーション（保温〕す
ることにより達成され得る。温度は反応時間および所望
の被覆効率に応じて大幅な差異があるが、好適には約４
〜約６０℃の間の温度で実施される。緩衝作用は最大の
被覆効率を達成するために必須であｐ、ｐＨ８，０以下
の値において実施され、好適には約６．０〜約′７．５
、最も好適には約７．０〜約７．５である。そのｐＨ値
は被覆形成の全期間中維持されねばならない。代表的緩
衝液は炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、燐酸ナトリウム
（二塩基性および一塩基性）、燐酸カリウム（二塩基性
および一塩基性）、適当な緩衝剤中の塩化ナトリウムお
よび適当な緩衝剤中の塩化カリウム、ならびにそれらの
混合物を包含する。インキュベーション（保温）時間は
所望の結合の程度に応じて大幅な差異があり得る。３〜
２４時間、好適には１０〜２０時間の継続期間が４０％
以上の結合割合を達成するのく適当であることが見出さ
れ友。

アルデヒド処理された特異的結合性蛋白質は上記のよう
な反応条件下において増大した被覆効率を発揮する。こ
の効果の理由は完全には知られていないが、アルデヒド
付加によりもたらされ几疎水性の増大によるものと信じ
られている。この疎水性の増大は、蛋白質分子の不溶性
支持体への結合親和性の増大をもたらし、その間支持体
が使用される間に特異的結合性蛋白質の脱着を制限する
と信じられている。

適当な固体支持体の表面は、特異的結合性蛋白質吸着の
性能を有する水不溶性の重合体物質より形成される。代
表的物質はポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレ
ンおよびポリブチレンのような炭化水素重合体を包含す
る。その他の適当な有機重合体はシリコーンゴム、ポリ
エステル類、ポリアミド類、セルロースおよびセルロー
ス性誘導体、アクリレート類、メタクリレート類、なら
びにポリビニルクロライドおよびポリビニルフルオライ
ドのようなビニル重合体を包含する。またポリスチレン
のグラフト共重合体のような共重合体も有用である。

固体支持体表面の特に有効な形状は試験管、ビーズ、フ
ィン（ひれ）またはくほみ孔および微量力価検定用プレ
ートである。接触／吸着反応の完了後に結合されない蛋
白質および溶液を不溶性支持体から除去し、支持体表面
を乾燥せしめる。乾燥は風乾または５０℃までの周囲温
度での終夜オーブン乾燥のような在来の方法により達成
される。得られる免疫測定試験管は長期間安定でかつ良
好な再現性を有する。貯蔵は約４〜約３０℃のような適
当な温度において行うことができる。

この方法により調製される固相免疫測定システムは、使
用に際して脱着によるさしたるロスなしに高度の特異的
結合性蛋白質の吸着を示すので、この測定方法は小量の
試料物質の精密な分析を提供するための簡単、迅速かつ
実用的な手段であシ、そしてまた定性的および定量的検
定によく適する。

本発明は、抗原、不完全抗原（ハプテン）または抗体の
ような特異的分析対象物の測定に際して固体支持体表面
に本発明の操作による複合特異的結合性蛋白質が提供さ
れる測定方法を包含する。不溶性支持体はその際分析す
べき物質の定量的および／まｆＣ，は定性的な量を検定
するために在来の操作により処理される。例えば標識な
しの試料の分析対象物および標識付の特異的分析対象物
は、競合的に反応せしめるために本発明の固体支持体の
表面に接触し、つぎに結合された物質および結合されな
い物質を分離し、表面上または除去された溶液中の標識
付成分の測定により試料中に存在する分析対象物の量が
計算される。

本発明による免疫測定に用いられる標識は放射性同位元
素、酵素または螢光測定用物質のような在来の標識のい
ずれでもよい。分析対象物が例えばＷ１１ｈｅｉｍｕ８
氏によシ米国％許１３ｂ７９１，９３２号明細書に記述
されたように酵素で標識された場合には、標識付の分析
対象物の量は試験管Ｃ酵素活性を測ることにより検定さ
れる。分析対象物が螢光物質で標識された場合には、標
識付抗原の量はＫａｙ氏に付与され几米国特許第５，７
８９，１１６号明細書に記述されているように螢光を測
定することにより決定される。標識付けがいかにして達
成されたにしても、標識付物質はトレーサーの役割をす
る。

特に好適な一方法は、特異的結合性蛋白質を在来の方法
により放射性同位元素により標識することを包含する。

適当な同位元素は工１２５、工１３１、Ｃ１４またはＨ
３を包含する。特に適当な同位元素は沃素の放射性同位
元素工１２５であり、それはこの同位元素で標識するこ
とは容易で、また多くの病院がこの物質を測定する装置
を有するからである。

本発明はまた、測定用試験管および操作法の教示を含み
試料中の特定の分析対象物を測定するためのすべてまた
は若干の材料を揃えた「キット」にも関する。好適には
キット中には本発明の方法により表面を特異的結合性蛋
白質で被覆した不溶性の支持体および標識付の分析対象
物を含有する。前述の標識付与手段のいずれでもこの診
断用キットに用いるのに適する。

本発明は下記の実施例中にさらに詳細に示される。実施
例を含めて本明細書におけるすべての部およびパーセン
トは特記するもの以外は重量基準である。

実施例　１ この実施例は、本発明の方法による固相免疫測定を準備
するに用いるための抗血清を精製する操作法を示す。

〔精製操作〕

チロキシンに対して特異的な家兎抗血清１ｆｆ１７！を
Ｑ、００１モル濃度の硼酸ナトリウム緩衝剤と含有する
１４％濃度のエトキシアクリジンの溶液４−と混合する
。緩衝された溶液はｐＨ値ａｏを有する。この溶液は３
０分間２４℃にネミいて機械的に混合される。懸濁液を
次に望ましくない不溶性物質すなわち主としてアルブミ
ン、α−１およびα−２グロブリンを分離除去するため
に１，５００〜２，０００ｒｐｍで１５分間遠心する。

得られる上清液をｐＨ値７．０を有する０、　０１モル
濃度の等張燐酸塩緩衝液に対して透析する。主としてβ
−グロブリン画分および免疫グロブリン画分を含有する
。特異的家兎抗血清結合性蛋白質を含む透析された溶液
を次にガラスバイアル中に入れ使用時まで一２０℃で貯
える。

〔吸着操作〕

精製された家兎抗血清の０．２５−量をａｍ１モル濃度
の燐酸塩緩衝剤（Ｎａ２ＨＰＯ４）、０．１５モル濃度
のＮａｃｔおよび０．１モル濃度のＮａＪを含有するｐ
Ｈ６，０の緩衝液に加える。この溶液にグルタルアルデ
ヒドを最終濃度［１Ｌ００５モル濃度に加える。

こうして生ずる混合液を２０分間２４℃において反応せ
しめ、次に０．７モル濃度の燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，５
）３部と混合する。その溶液の１．２耐量を乾燥したポ
リプロピレン試験管に加えそして１８時間２４℃に保温
（インキュベート）する。試験管から余分の溶液を捨て
、０，１％のゼラチンを含有する等張の（１０１０１モ
ル濃リス緩衝液（ｐＩ（７，４）で２回洗浄する。試験
管を２４℃で風乾しそして使用時まで貯蔵する。

実施例　２ 吸着反応を１種−の緩衝液を用いる単一段階で行う以外
は実施例１の操作法を反復した。

実施例１の精製された家兎抗血清の［Ｌ２５−量を第１
表に示すｐＨ７，５の各種の緩衝液に加えた。

この溶液にグルタルアルデヒドを最終濃度［Ｌ００５モ
ル濃度に加えた。得られる混合物を２０分間２４℃にお
いて反応せしめ、その１．２　ｄ量を乾燥したポリプロ
ピレン試験管に加え、保温（インキュベート）シそして
実施例１と同様に洗浄した。

試薬管の比較分析は、反応物質としてのグルタルアルデ
ヒドの不存在下において行われた。使用された緩衝液お
よび得られた結果は第１表に記述されている。表示した
結果は、標識なしのＴ４の既知標準量の存在下において
工１２５で放射能標識されたＴ４の競合的保温（インキ
ュベーション）により計算された抗血清の結合割合を示
す。

示された値は、全カウント数に対する結合された画分の
パーセントの３凹側足の平均値を表わす。アルデヒドの
存在および不存在下における平均結合パーセント量（平
均Ｂ／Ｔ％）の比較は、アルデヒド活性化により増大さ
れた被覆効率を示す。その結果は、受動的吸着は本発明
によるアルデヒド処理抗血清に比べてポリプロピレン試
験管を被覆する効率がよくないことを示す。

ロロロ哨　　ロ０００ −　因−ｃ＋＝　　　　　　＄＜Ｓｃ＝＋ロロロロ　　
ロロ＋７′）Ｌｎ ｃｓＪ　　Ｓ　　ａ３　４　　　　　　ｄ　　ド　−　
４唖へ　　　　吟へ 前　　−−−東　　−−品 実施例 グルタルアルデヒドの代わりにホルムアルデヒドを用い
ること以外は実施例１のとおりに反復した。

結果は第２表に表わされ、そこではホルムアルデヒドの
量を変えて用いた場合の効果を示す。

その結果は、単官能性アルデヒドによる被覆効率の改善
を示す。

第２表 全カウント　　　　　９９．７９ 受動的　　　　Ａ　１．０μｇ／ｄｉ　　　　３６．７
２（ＯＭ　）　　　　　　　ＣＩ　１．７μｇ、４ｕ９
．２１Ｑ、０５Ｍ　　　　　　Ａ　　１．０μｇ７ｄｌ
　　　　　　４６．２０Ｃ１１，７μｇ／α　　　　　
１五２９０．０７５Ｍ　　　　　ｊ、　　１．０／ｊｇ
／ｄ／！　　　　　　４７．８０Ｃ１１，７μｇ、／ｄ
ｉ　　　　　　１！ｈ、６６０．１０Ｍ　　　　　　　
Ａ　　１．Ｏｐｇ／ｄ１４６．９８ＣＩ　１．７　ｐｇ
／ｄｉ　　　　　　１五７００．２５１ 実施例　４ この実施例は実施例１により調製されたＴ４に対抗する
精製された家兎抗血清の分子量特性を蛋白質分子量標準
範囲と比較して明示する。使用された分子量標準値は米
国カリフォルニア州所在バイオラード・ラボラトリーズ
社製キットよ、り計算された。標準物質およびそれらの
分子量は予め下記のように確立された。

無効成分 （グラムモル） チロキシン結合性グロブリン　　　　６７０，０００γ
−免疫グロブリン　　　　　　１５８，０００卵アルブ
ミン　　　　　　　　　４４，０００ミオグロブリン　
　　　　　　　　１７．０００ビタミンＢ、２　　　　
　　　　　　　　１，３５０実施例　５ この実施例は本発明による同相免疫測定の特異的分析対
象物の測定への使用を示す。

試料中に存在する分析対象物を定量的に決定するために
、実施例１により調製され、予め調製された抗体で被覆
された試験管中に試料１０μｔを入れる。しかる後０．
０１５％のアニリノナフタレンスルホン酸を含有するｐ
Ｈ７，４のＱ、０１モル濃度トリス緩衝液中で工１２５
を用いて放射能標識された相補的抗原の試料１．０−を
抗体で被覆した試Ｍ管に加える。それら反応物を６０分
間２４℃に保温（インキュベート）する。反応物を傾瀉
し、■１２５の活性を測定するガンマ・カウンターによ
り結合画分のパーセントを決定し、試料中の分析対象物
め結合のパーセントを既知の標準物による検量曲線から
算出する。

患者血清中のチロキシン量の精密に測定す番ための本発
明の有用性は、チロキシン過多、過少および正常の血清
を用いて示された。結果を下記の表に示す。

（過少）Ａ　　　　　　　　４．８ Ｂ　　　　　　　　２．２ Ｃ２，Ｏ Ｄ２．６ １１！　　　　　　　　４．５ Ｈ５，３ Ｇ　　　　　　　五９ Ｈ４，０ 工　　　　　　　　　　　　　　　４，２Ｊ　　　　　
　　　　　　　　　五８ （正常）ＡＡ７．４ ＢＢ　　　　　　　　　　　　　　６．２ｃｃ　　　　
　　　　　　　　　　Ｚ６ＤＤ　　　　　　　　　　　
　　　ａ。

Ｋ２Ｏ２，３ ｙｙ　　　　　　　　　　　　　　９．ＩＧＧ　　　　
　　　　　　　　　１０．３ＨＨ１０，３ エエ　　　　　　　　　　　　１０．３Ｊ：ｒ　　　　
　　　　　　　　　　９．８（過多）ＡＡＡ　　　　　
　　１２．８ＥＢＢ　　　　　　　　　　　　１５．０
ＣＣＣ１５，０ ＤＤＤ　　　　　　　　　　　　１’３．６ＥＥＥ　　
　　　　　　　　　　１４・１ＦＦＦ　　　　　　　　
　　　　１６．２ＧＧＧ　　　　　　　　　　　１５．
９ＨＨＨ１６，，５ エエエ　　　　　　　　　　　　１８．３ＪＪｙ　　　
　　　　　　　　’１９．１本発明を上記したが、それ
は多様に改変可能である。そのような改変は本発明の精
神よりの離脱とみなされるべきものではなく、それらは
すべて本発明の範囲内に包含される。

【図面の簡単な説明】

＃！１図はグルタルアルデヒドによる活性化を行わなか
った抗Ｔ４精製家兎抗血清の分子量分布プロフィルであ
る。第２図は本発明の方法によりグルタルアルデヒドで
活性化した後の抗Ｔａｆｆ製家兎・抗血清の分子量分布
プロフィルである。 これらの結果は、抗血清蛋白質にはグルタルアルデヒド
との反応後にも交差結合または重合はないことを特徴す
る

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）下記すなわち ａ）特異的結合性蛋白質を精製し、 ｂ）特異的結合性蛋白質の交差結合または重合を生ずる
   ことなしにその疎水性を増大せしめるために特異的結合
   性蛋白質をアルデヒドと反応せしめ、 Ｃ）不溶性支持体の表面を疎水性が増大した特異的結合
   性蛋白質と緩衝剤の存在下において接触させてそ・の特
   異的結合性蛋白質を前記の表面に結合せしめ、そして ｄ〕　前記の不溶性支持体から結合されない蛋白質を除
   去する ことよりなる同相免疫測定系の調製方法。 ２）特異的結合性蛋白質が抗体、抗原および不完全抗原
   よりなる群から選択される特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ３ン　精製され７′ｃ特異的結合性蛋白質が免疫グロブ
   リンを含有する抗体である、特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ４）　　Ｉ製された特異的結合性蛋白質が免疫グロブリ
   ンおよびβ−グロブリンを含有する抗体である、特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ５）特異的結合性蛋白質が高力価の抗体である、特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ６）アルデヒドが単官能性アルデヒドまたは二官能性ア
   ルデヒドである、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７）アルデヒドが一般式０ＣＨ−Ｒ（ただし式中Ｒは水
   嵩、アルキル基まｆｃはアリール基を表わす）を有する
   、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８）アルデヒドがホルムアルデヒドである、特許請求の
   範囲第７項記載の方法。 ９）アルデヒドが一般弐〇Ｃ’Ｈ−（Ｒ）ｎ−ＣＨＯ（
   ただし式中ｎは２〜１０の整数であり、Ｒはアルキル基
   、シクロアルキル基、単環状アリール基、二環状アリー
   ル基、置換単環状アリール基、およびそれらの混合物で
   ある）を有する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０）アルデヒドがグルタルアルデヒドである、特許請
   求の範囲第９項記載の方法。 １リ　特異的結合性蛋白質とアルデヒドとの反応が約６
   ．０〜約ｚ、８の間のｐＨ値を有する緩衝液の存在下で
   なされる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １２）特異的結合性蛋白質とアルデヒドとの反応が約７
   ．０〜約Ｚ５の間のｐＨ値を有する緩衝液の存在下でな
   される、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １３）不溶性支持体が水不溶性の疎水性重合体である、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 １４）増大した疎水性結合能を有する特異的結合性蛋白
   質がａＯ以下のｐＨ値を有する緩衝液の存在下において
   不溶性支持体に接触せしめられる、特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 １５）増大した疎水性結合能を有する特異的結合性蛋白
   質が約６．０〜約７．５の間のｐＨ値を有する緩衝液の
   存在下において不溶性支持体に接触せしめられる、特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 １６）接触の段階に用いられる緩衝剤が炭酸ナトリウム
   、炭酸カリウム、燐酸ナトリウム、燐酸カリウム、塩化
   ナトリウム、塩化カリウム　　。 およびそれらの混合物よりなる群から選択される、特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 １７）不溶性支持体が試験管の形状である、特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 １８）　　ｂ）段階の反応が約６．０〜約１８の間のｐ
   Ｈ値を有する緩衝液を用い、まｆｃｃ）段階の接触が約
   ６．０〜約Ｚ５の間のｐＨ値を有する緩衝液を用いてな
   される、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １９）下記すなわち− １）特異的な無標識分析対象物の試料と特異的標識付分
   析対象物とを緩衝液および不溶性支持体に疎水的に結合
   された特異的結合性蛋白質の存在下で反応せしめ、 −２）反応物を保温（インキュベート）シ、３）結合さ
   れない反応物を傾瀉し、 ４）結合されたかまたは結合されない反応物を測定して
   標準曲線と比較する ことよりなり、ただしその場合不溶性支持体に疎水的に
   結合された特異的結合性蛋白質は ａ）特異的結合性蛋白質を精製し、 ｂ）特異的結合性蛋白質をその交差結合まｆｃは重合を
   伴なうことなしに疎水性を増大せしめるためにアルデヒ
   ドと反応させ、Ｃ）不溶性支持体の表面を上記の疎水性
   を増大させた特異的結合性蛋白質に緩衝剤の存在下にお
   いて接触させそして上記の表面に特異的結合性蛋白質を
   結合せしめ、そして ｄ〕　結合されない蛋白質を上記の不溶性支持体より除
   去する ことにより調製されたものである試料中の特異的分析対
   象物を測定するための方法。 ２０）標識付分析対象物が放射能標識、酵素標識または
   螢光標識される、特許請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１）　　（１）増大された疎水性を有する特異的結合
   性蛋白質で表面を被覆された不溶性支持体および（２）
   標識付分析対象物〔ただしこの特異的結合性蛋白質は ａ）特異的結合性蛋白質を精製し、 ｂ）特異的結合性蛋白質をその交差結合または重合を伴
   なうことなしに疎水性を増大せしめるためにアルデヒド
   と反応せしめ、Ｃ）不溶性支持体の表面に上記の疎水性
   の増大された特異的結合性蛋白質を緩衝剤の存在下で接
   触させそして上記の表面に特異的結合性蛋白質を結合せ
   しめ、そして ｄ）結合されない蛋白質を上記の不溶性支持体より除去
   する１ ことにより調製される〕よりなる試料中の特異的分析対
   象物を測定するためのキット。 ２２）チロキ７ン（Ｔ４八三沃化チロキシン（Ｔ５）、
   ジゴキシン、コルトソール、テオフィリン、ゲンタマイ
   シン、葉酸およびビタミンＢ１２よりなるグループから
   選出された標識付分析対象物を特徴する特許請求の範囲
   第２１項記載の測定用キット。