JPS59135890A - 複合プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ダラム陽性菌のストレプトコッカス０フエカ
リス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｅａｌｉｓ
　）のプラスミドと、ダラム陰性醒のニジエリシア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）のプラスミ
ドベクターから合成された複合プラスミドに係わり、少
なくとも、大腸菌、枯草菌の生態系内で安定に増殖し、
形質発現するクローニングベクターとして有用な新規な
複合プラスミドに関するものである。

更に詳しくは、本発明は、ストレプトコッカス・フェカ
リスのプラスミドｐＡＭα１由来のテトラサイクリン耐
性遺伝子領域（Ｔｃ　）と、該プラスミドｐＡＭα１由
来の複製開始領域（ＯｒｉｐＡＭα１）と、ニジエリシ
ア・コリのプラスミドベクターｐＡＣＹＣ１７７由来の
カナマイシン耐性遺伝子領域（Ｋ７７Ｌ）と、該プラス
ミドベクターｐＡ−ＣＹＣ１７７由来の複製開始領域（
Ｏｒｉ１７７）とを有し、前記テトラサイクリン耐性遺
伝子領域には、制限酵素Ｂａ１Ｉに対する全領域中唯−
の認識切断部位が位置１〜、更に、前記カナマイシン耐
性遺伝子領域には、制限酵素Ｘｂｏｌ、及びＣ１ａＩの
各々に対する全領域中唯−の認識切断部位が位置するこ
とを特徴とする新規複合プラスミドに関するものである
。一般に、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ遺伝子操作においては、所
望の外来の異種１）　Ｎ　Ａを宿主細胞内に移入させて
、安定に増殖と形質発現とを行わせるべく、宿主細胞に
適合するベクターを使用することが要請されている。遺
伝子操作におけるプラスミドベクターの役割に関しては
、研究成果の蓄積の多い大腸菌の宿主−ベクター系にて
最もよく解明されているが、最近では、大腸菌以外の微
生物、例えば、工業的に有用な微生物である枯草菌、抗
生物質の生産菌である放線菌、醸造分野で広く利用され
ている酵母などに関しても、遺伝子操作に有用な宿主−
ベクター系を開発すべく、多くの試みが活発に行われて
いる。このように、種々の宿主微生物に関して、工業上
利用し得るような遺伝子操作技術を確立するためには、
先ず、有用なベクターの開発が必須であるので、これま
でも、工業的に有用なプラスミドベクターの開発、宿主
−ベクター系の確立が種々検討されてきた。

中でも、プラスミドベクターの開発分野では、プラスミ
ドベクタ・−とし２ての必須条件が、自己複製に必要ｌ
Ｚ遺伝子配列と、外来の異種Ｄ　Ｎ　Ａを挿入するため
の制限酵素の認識切断部位の存在であることが知られて
いるが、実際に該ベクターを工業的に利用するためには
、遺伝子操作を可能にし、且つ、容易にするための制限
酵素の種類とその切断部位の選定の問題、形質発現効率
の問題、形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ　）の
検出とその選択に必要なマーカー遺伝子の存否の問題、
宿主菌との適合性の問題、宿主域の問題、宿主菌におけ
る安定保持の問題、更には、仮想される生物災害のリス
クの逓減を企図した生物的封じ込めに対する適応性の問
題ｔｘ、と、遺伝子操作技術−に必要とされる種りの問
題点を、全て解決し得るようなりローニングベクターと
しての必要条件が伺加されることから、大腸菌、枯草菌
の宿主−ベクター系に関しては、比較的多くの研究開発
例が報告されてはいるものの、工業的に実用可能な宿主
−ベクタ・−系の開発例が、多くはないのが現状である
。

かかる現状に鑑み、本発明者らは、これまでに、研究開
発例の最も多い大腸菌、及びアミラーゼなどの生産菌と
して工業上有用な枯草菌について、その宿主−ベクター
系を確立すべく、これらの菌種のベクターとｌ、２て使
用１−、得るプラスミドの開発を行なってきた。その結
果、ストレプトコッカス・フェカリスのプラスミドｐＡ
−ＭαＪと、ニジエリシア・コリのプラスミドベクター
ｐＡＣＹＣ１，７７とから合成１〜だ複合プラスミドが
、大腸菌、枯草菌などの遺伝子操作におけるクローニン
グベクターと１〜て好適な種々の特性を保有１−７【い
ることを見出１−、て、本発明を完成するに至った。

本発明の複合プラスミドの構成は、ス）ｌ／フ゛トコノ
カス・フェカリス　Ｉ）Ｓ　５　（ＡＴＣＣ１４５０８
）が保持するプラスミドの一種ひある１）Ａ−Ｍα１の
テトラザイクリン耐性遺伝子領域（Ｔｃ）及び該プラス
ミドｐＡＭα１の複製開始領域（Ｏｒｉ−ｐＡＭα１）
とを含むＤＮＡと、ニジエリシア・コリのプラスミドベ
クターであるｐＡ−ＣＹＣ１７７のカナマイシン剛性遺
伝子領域（Ｋｍ、　）及び該ベクターｐＡＣＹＣ１７７
の複製開始領域（Ｏｒｉ１７７）を含むＤＮＡ−とを、
酵素的に切断し７、連結することにより、合成された複
合プラスミドであり、具体的には、ｆｌｌＪ限酵素の作
用による欠失領域の相違に基づいて分子清の異なる三種
類のプラスミド、すなわち、ｐＰＹ８５０、Ｉ）ＰＹ６
００及びｐｐｙ５００と命名される各複合プラスミドを
含むものである。

一上記この発明に係わる複合プラスミドは、そのＤＮＡ
−Ｌに、デトラザイクリン及びカナマイシンに対する耐
性遺伝子領域を保有しているので、形質転換に際しては
、宿主菌に対ｌ−で、両薬剤に関する耐性形質を付与す
る特性を備えている。この特性は、所望の外来の異種Ｄ
ＮＡを組み込Ａ７だ組換えプラスミド保有株、すフエわ
ち、形質転換体を取得する際に、その検出、選択を効率
的に行なうための選択−マーカーの役割を果すものであ
る。加えて、−上記この発明に係わる複合プラスミドの
テトラザイクリン耐性遺伝子領域には、制限酵素Ｉ’３
ａｌＩに対する全領域中唯−の認識切断部位が位■する
と共に、そのカナマイシン耐性遺伝子領域には、二種類
の制限酵素Ｘｈｏｌ及びＣ１ａ　Ｉの各々に対する全領
域中唯−の認識切断部位が位置しているので、かかる制
限酵素により、この発明に係わる複合プラスミドのＤＮ
Ａを特異的に切断する限り、該１）　ＮＡ中に不所望の
多数の切断部位を生じてこれが断片化１．てしまうこと
はない。

しかして、上記全領域中唯−・の切断部位のいずれかを
所望の外来の異種Ｉ）　Ｎ　Ａの挿入箇所と１〜て使用
することができるものである。

そして、とりわけ、テトラザイクリン耐性遺伝子領域の
制限酵素Ｂａ１Ｉの認識切断部位は、ＤＮＡの６塩基の
中央が切断されるいわゆるフラッシュエンド（ｆｌｕｓ
ｈ　ｅｎｄ　）を形成１〜で切断されるので、同種の制
限酵素により切断し２て作製されたＤ　Ｎ　Ａ断片はも
とより、他のいかなるフラッシュエンド型の制限酵素で
切断されたＤＮＡ断Ｊ１をも、リンカ−ＤＮＡ等を用い
ることなく、直接的に連結することが可能であり、更に
は、人工的にフラッシュエンドにしたＩ）　Ｎ　Ａ断片
をもクローニングできる特徴を有するものである。

本発明に係わる複合プラスミドのうち、ｌ持に、１、）
ＰＹ　５００に関しては、大腸菌の他に、枯草菌中でも
、前述の二つの複製開始領域、即ち、プラスミドｐＡ、
Ｍα１由来の複製開始領域（ＯｒｉｐＡＭα１）と、ベ
クターｐ、Ａ、ｃＹｃ　１７７由来の複製開始領域（Ｏ
ｒｉ１７７）とが適切に作用して、安定に増殖し、その
テトラザイクリン耐性遺伝子が一上記両菌種にて発現す
るので、大腸菌と枯草菌の間を往復できるシャトルベク
ター（５ｂｕｔｔｌｅ　ｖｅｃｔｏｒ）としての特質を
備えているものである。

イ４官するならば、現在、最も研究開発の進んりＩ）　
Ｎ　Ａクローニングシステムは、ダラム陰性閑のニジエ
リシア・コリ■ぐとそのベクター系（Ｅ　Ｋ系）であっ
て、このシステムでは、グラブ、１へ性菌に由来する遺
伝子及びグラ人陽性菌に由来するある種の遺伝子を形質
発現させることができる。

どころか、一方、グラ人陽性菌の系に関１−７ては、解
明ｔべき問題点がより多く残されているので、今日、多
大の関心が払われている。特に、グラ人陽性菌のうち、
枯悟菌（ｌ３ａｃｉｌｌｕｓ　５ｉｔｂｔｉ−１ｉｓ　
）に関しては、実用上程々の利点を持つ有用な微生物で
ある反面、その生物学的性状が大腸菌のそれとは全く異
っているので、近年、その遺伝的解析、更には、遺伝子
のクロ・−ニングシステムの開発が非常な関心事と’Ａ
っている。

しかｌ〜て、かかる現状下で、枯草菌の宿主−ベクタ・
−系を確立することは切迫１−７だ産業上の要請とな・
つでいるから、本発明者らが、グラブ・陰性菌の代表菌
種である大腸菌と、グラブ、陽性菌の代表菌種である枯
草菌の間を往復できるシャトルベクターを開発１−得た
ことは、グラ人陽性菌のＤＮＡクローニングシスデムの
確立への一つの段階を克服するものとし２て意義深く、
しかして、Ｉ）ＰＹ５００を含むこの発明に係わる複合
プラスミドは産業的に有用なものである。

そればかりか、他のグラ人陽性菌、例えば、ラクトバチ
ルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｔｌｌｕｓ　）、ビヒドバク
テリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔ、ｅｒｉｕｍ　）な
どに属する微生物の遺伝子の解析や分子育種の面にも拡
張的に活用できる可能性を有している点で産業上有望な
ものである。

続いて、この発明に係わる複合プラスミドの構成を詳細
に説明すれば以下の通りである。

複合プラスミドｐＰＹ　８５０の構成 （１）　　複合プラスミドｐｒ’ｙ　８５０は、分子屏
約８５メガダルトンの環状デオギシリボ核酸（１）ＮＡ
）である。

（２）　　ｐＰＹ　ｓ　５０　ハ、スｌ−レフトコツカ
ス・フェカリスＤＳ５　（ＡＴＣ０１４５０Ｂ　）のテ
トラザイクリン面ｊ性遺伝子領域（Ｔｃ）を含む　プラ
スミドりＡＭα１を制限酵素用ｓｔｌで切断して得られ
ケＤＮＡ−断片と、大腸菌（ニジエリシア・コリ）のア
ンピシリン耐性遺伝子領域（Ａ、ｍ、ｐ　）及びカナマ
イシン耐性遺伝子領域（Ｋｍ、　）を含むプラスミドベ
クターｐＡＣＹＣ１７７を制限酵素Ｐｓｔ　Ｎで切断し
て得られるＴ）　Ｎ　Ａ断片とを、連結して合成した複
合プラスミドである。

そして、かかる合成の原料として使用されるプラスミド
ｐ、Ａ、Ｍα１及びベクターｒ＋ＡｃＹｃｉ　７７は、
いずれも公知のものである（　ｐＡ−Ｍｎ２　：Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、
　７２．　１７２０−−１７２４　（１９７５）、ｐＡ
ＣＹＣ］　７７　：　Ｊ、　Ｂａｃｔｃ−ｒｉｏｌ、、
１３４．１１４１−１１５６（１９７８））。

なお、合成された複合プラスミドの分子ｈ１の決定に際
しては、大腸菌のλファージＩ）　ＮＡをＨｉｎｄｕで
消化し゛〔得られる分子量既知の断片（Ｊ、　Ｍｏ１．
　Ｂｉｏｌ、、　９８．５５１−５６４（１９７５））
が０１８％アガロースゲル上に描く泳動距離の基準線と
の対比により、各種制限酵素で消化されたプラスミドｐ
ＰＹ８　ｓ　ｏの各断片の分子量を測定し、それらの総
和を算出した。

（３）　　ｐＰＹ８５０は、少なくとも、制限酵素Ｂａ
ｍ１月。

Ｘｂａ　１．　ＥｃｏＲｌ、　Ｈａｅ　Ｉｌ、　５ａ１
１．　ＩＴｉｎｄｌ、　Ｐｓｔ　１．　Ｂｇ−１、８ａ
ｃ１１．　ＡＣＣｌ、　Ａ、ｖａ！、　Ｈｉｎｃｌｌ、
　Ｋｐｎｌ　に対する認識切断部位を有し１、そのテト
ラサイクリン耐性遺伝子領域（Ｔｃ）には、制限酵素）
１ａ１１に対する全領域中唯−の認識切断部位を有（〜
、更に、そのカナマイシン耐性遺伝子領域（Ｋ、ｍ、　
）には、制限酵素Ｘｈｏｌ及びＣ１ａｌの各々に対する
全領域中唯−のＲ，Ｈ識けｌ断部位を有する。

そり、て、各種制限酵素に対する認識切断部Ｃ＼１の数
（・え、１Ｌ下の通りである。

制限酵素　　　　　切断部位数 １３ｃｏＲ１２ ｒＪａｍＦＩｌ　　　　　　　　　　　　　２Ｈｉｎｄ
ｌ　　　　　　　　　　　　　５ＰｓｔＩ　　　　　　
　　　　　　　２ＨｐａＩ　　　　　　　　　　　　２ Ｂａｌｌ　　　　　　　　　　　　　”ＸｈｏＩ　　　
　　　　　　　　　　ＩＸｂａｌ　　　　　　　　　　
　　　ｌ５ａｌＩ　　　　　　　　　　　　　２Ｐｖｕ
　Ｉ　　　　　　　　　　　　　２（４）　　ｐＰＹ８
５０は、グラム陰性菌である大腸菌の生態系内で自己複
製可能であるばかりか、その自己複製されたＤＮＡ、ｌ
：の特定の領域中に存在するカナマイシン（Ｋｍ　）及
びテトラザイクリン（Ｔｃ）耐性遺伝子に由来する耐性
形質をその宿主菌に付与する。

なお、宿主菌に形質転換する方法は、常法（Ｊａｐａｎ
　Ｊ、Ｇｅｎｅｔｉｅｓ、　４９．９７−１０１（１９
７４））通りである３、 複合プラスミドｐＬ’Ｙ　６０　（ｌの溝成（１）　　
複合プラスミドｐＰＹ　６００は、分子−Ｍ約６，０メ
ガダルトンの環状デオキシリ４−′核酸（１）ＮＡ）で
ある。

（２）　　ｐＰＹ　６０　（ｌば、ｐＰＹ　８５０を制
限ｒｌ￥：素ＢａｙｒＬＨ，１で切断して得られたＩ）
　Ｎ　Ａ断片をＴ　４１Ｊ　フｊ・−ゼにより連結して
合成したもの−Ｃある。

（３）　　ｐＰＹ６００は、少１にくとも、制限酵素艷
應■ＩＩ。

ＥｃｏＲｌ、　ｌ１ａｅ　Ｉｌ、　Ｓａｄ　１．　Ｐｓ
す、　Ｂｇｌ、　１．　Ｓａｃ　Ｉｆ、　Ａｃｅｌ、　
Ａｖａ　１．　Ｘｂａ　Ｉの認識切断部位を有し、ｐｐ
ｙ８５０と同様に、テトラサイクリン耐性遺伝イー領域
（Ｔｃ　）　Ｋ　ハ、制Ｋｌｔ酵素１３ａｌＩＫ対−（
る全領域中噌−の認識切断部位な有し、更に、カナマイ
シン耐性遺伝子領域（Ｋｍ、　）にに主、市１１限酵素
Ｘｈｏｌ、Ｃ１ａｌ及びＰｖｕｌの各々に対する全領域
中唯−の認識切断部位を有する。

そして、各種制限酵素に対する認識切断部位の数は以下
の辿りである。

制限酵素　　　　切断部位数 Ｈ，ａｅｌ［３ ｉ−１ｐａｌ　　　　　　　　２ ＢａｌＩ　　　　　　　　　１ Ｘｈｏｌ　　　　　　　　　Ｉ Ｐｖｕ　１　　　　　　　　　’ Ｈｉｎｄｌ　　　　　　　　２ ＢａｍＨｌ　　　　　　　　１ Ｘｂａｌ　　　　　　　　　１ ＥｅｏＲＩ　　　　　　　　２ Ｉ’ｓｔ！　　　　　　　　　’ （４）　　ｒ＋ＰＹ６００は、ｐＰＹ８５０と同様に、
グラノ、陰性菌である大腸菌の生態系内で自己？ｕ　’
Ｊ！！　’ｉ’Ｔ　倉’？であるばかりか、宿主菌に対
してテトラ１ノーイクリン及びカナマイシンに対する耐
性形質を伺与、する。

複合プラスミドｐＰＹ５００の構成 り鴫−一一一い、−−ｈ→−□よ□１．〒−轡−−−陽
１１−ｉ甲−□□−←−幣トー閾−２（１）複合プラス
ミドｐＰＹ５００＆！、分子量約５．０メガダルトンの
環状デオキシリボ核酸（，１）ＮＡ　）である。

（２）　　ｐＰＹ５００＋−ｚ、ｐｌ）Ｙ　６　ｏ　□
　ヲ、制限酵素Ｓ　ａｌＩで切断して得られるＤＮＡ断
片を′■゛４リガーゼにより連結して、合成したもので
ある。

（３）　　ｐＰＹ５００は、少なくとも、制限酵素Ｂａ
ｍ）−Ｊｌ、　Ｘｂａ　１．　ＥｃｏＲｌ。Ｈｉｎｃ　
Ｉｌ、　ＩＩａｅ　Ｉｌ、　Ｓａｄ　１．　Ｐｓｔ　［
。

ルビ１．ジ氏Ｉ１．　Ａｃｃ　ｌ、人ｖａｌの認識切断
部位を有し、テトラザイクリン耐性遺伝子領域（Ｔｃ）
には、制限酵素）（ｐａｌ及びＢａ１ｌ　Ｉの各々に対
する全領域中唯−の認識切断部位を有し、更に、カナマ
イシン耐性遺伝子領域（Ｋｍ、　）には、Ｎ央１．リユ
ｆ、Ｐｖｕｌ及び、見切、ｄＩの各々に対する全領域中
唯−の認識切断部位を有する。

そして、各種制限酵素に対する認識切断部位の数は以下
の通りである。

制限酵素　　　　切断部位数 Ａｃｃ　Ｉ　　　　　　　　　３ Ａｖａ（２ Ｂａｌ［Ｉ ＢａｍＨＩ　　　　　　　　］ ＢｓｔＥＩＩ　　　　　　　　２ （Ｊ？ａＩ　　　　　　　　　Ｉ ＥｃｏＲＩ　　　　　　　　２ ）−（ａｅｌｌ　　　　　　　　３ Ｈｉｎｃｌｌ　　　　　　　　３ １ｎｄＩＩ Ｈｐａｌ　　　　　　　　　Ｉ ＰｓｔＩ　　　　　　　　　Ｉ Ｐｖｕｌ　（Ｘｏｒｌｌ　）　　　　　ＩＰｖｕｌｌ　
　　　　　　　２ Ｓａｃ　Ｉｆ　　　　　　　　　ｌ ５ａｌＩ　　　　　　　　　Ｉ Ｓｍａ　ｌ　　　　　　　　　１ Ｎ仄１１ Ｘｈｏｌ　（Ｓｌａｌ　）　　　　　　１（４）　　１
）ＰＹ　５００は、グラム陰性菌の代表である大腸菌の
みなら１゛、ダラム陽性閑の代表である枯草菌の生態系
内で自己複製可能であると共に、これらの宿主菌にテト
ラザイクリン耐性遺伝子に由来−する耐性形質を４＝ｌ
与する。

以上のように構成さ第１た、この発明に係わる複合プラ
スミドｐＰ’Ｙ８５０．　ｐＰＹ６００．　ｐＰＹ５０
０は、少なくとも、大腸菌を宿主菌どするＤ　Ｎ　Ａ組
換え技術により、任意の遺伝子をクローン化する際に必
要なベクターと１〜での条件を完全に具備しており、と
りわけ、Ｉ）Ｐ−Ｙ２Ｏ２は上記ＤＮＡ組換え技術の適
用に際して、少なくとも、大腸菌と枯草菌との間を往復
可能なシャトルベクターとしての条件をも完全に具備し
ているので、この発明に係わる複合プラスミドによれば
、大腸菌、枯草菌等の宿主菌に対して、他の微生物等か
ら有用物質の生合成あるいはその調節に関する特定の遺
伝子をクローニングすることにより、該宿主菌の生態系
内で有用物質の生産を行わせたり、更には、上記ｌ特定
の遺伝子に係わる遺伝子情報の増幅作用を通じて生合成
系を強化することにより、有用物質の生産性を増大させ
たりするための有効な手段を提供することができる。そ
して、特に、ｐＰＹ５００によれば、枯草菌に代表され
るグラム陽性菌種の生態系内で他の微生物由来等の種々
の遺伝子を発現させることができるので、グラム陽性菌
種の遺伝子の解析や分子育種に有効な手段をも提供する
ことができる。

続いて、この発明の詳細な説明すれば以下の通りである
。

〈実施例１〉・・・・・・・・・複合プラスミドｐＰＹ
　８５０の合成 （１）　　ｐＡＣＹＣ１，７７の調製。

！−シエリ、：／　−ｆ　−ｒ９　Ｋ１２　　ＷＡ８０
２ｒｍ（ｐＡｃＹｃ１７７　）（東京大学応用微生物研
究所斎藤研究室）を、Ｌ−プロス（）；クトートリグト
ン　１％、酵ＪＪエキス　０．５％、Ｎａｔ、’、ｌＯ
，５％、グ／Ｌ／　コース　０１％をｌＮ−ＮａＯＨで
ｐｌ、（７，ＯＫ調節したもの）中で、−夜培養した後
、遠心分離処理にて集菌し、これを、１００ｍ１の２０
ｙ＋＋Ｍ　　Ｔｒｉｓ　−１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ　（ｐ
Ｈ８，０）で２回洗滌した。洗滌後の菌体を９　ｍｌの
１００ｍＭ　ＮａＣｌ−２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＩＯｍ
Ｍ　　ＥＤ’Ｌ’Ａに溶解させた。次いて、リゾチー１
２とＲＮａｓｅをそれぞれ１００　ｔｔｇ／ｍｅと、５
０１４７ｍｌとになるように加え、０℃で、１０分間反
応させた後、２％Ｓ　Ｉ）　Ｓをｌ　ｍｌ加えて、３７
°Ｃ１５分間、上記反応後の菌を更に溶解させた。この
溶液を０°Ｃで１０分間放置した後、３６．００　Ｏｒ
ｐｍで３０分間遠心分離処理し、分離された上清をＤＮ
Ａ粗標品として採取した。これに等重陽の塩化セシウム
を加え、５ｍｑ／ｍｌのエチジウムブロマイド（ＥｔＢ
ｒ　）を０．７　ｍｌ加えた。これに３６，０００　ｒ
ｐｍ、４０時間の遠心分離処理をほどこしてＤＮＡ画分
を集め、更に３６，０００　ｒｐｍ、４０時間の遠心分
離処理を行った。

分離されたＩ）　Ｎ　Ａ画分を飽和塩化−せシラノ、水
で飽和し７たイソプロ・くノールを用いて洗滌すること
により、Ｅ　ｔ、Ｂ　ｒを除去した。次いで、１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−０，１ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ　（ｐＨ７，４）
（以下緩衝液Ａという）に対して透析し、更に、１）　
Ｎ　Ａと等張のフェノール（緩衝液Ａで飽和したもの）
を加えて、振とうした。そ１２で４、遠心分離処理によ
り得られた水層を緩衝液Ａに対して透析して、第１図（
４）の切断地図で表わされるｐＡＣＹＣ１７７ＤＮＡを
調製した。

（２）　　ｐＡＭα１の調製。

ストレプトコッカス・フェカリスＤＳ５（ＡＴＣＣ１４
５０８）を５００ｍ１のロゴサ培地（Ｊｌ、ｏ−ｇｏｓ
ａ　ｍｅｄｉｕｍ　：　１　ｌ中　グルコース　２０．
！ｉ’。

トリプチケース−ペプトン　１０ｇ、酵母エキス　５ｇ
、トリプト−ス　３ｇ１）ぐ２　）Ｉ　Ｐ　０４３ｇ、
Ｋ　）−Ｉｚ　ＰＯ＜　３　ｇ、クエン酸アンモニウム
２ｇ、酢酸ナトリウム　ＩＩ、ツイーン８０１ｇ、Ｍｇ
ＳＯ４・ＬＯＯ，５７５ｉ、１．−システィン塩酸塩　
０．５　ｇ　ＳＭｎＳＯ４・２）（，００，１２ｇ、Ｆ
ｅＳＯ４”　７Ｌ（，０８４ｍ９を含む：　ｐＨ６，８
）にて−夜培養した。

後続のＩ）　Ｎ　Ａ抽出処理は、（１，）項記載のｐＡ
ＣＹＣ１７７の調整の場合と同様の方法により、行なっ
た。次いで、抽出されたＩ）ＮＡｏ、５ｍ／！ヲ、二１
−ロセルロース遠心管中の１２ｍ、ｌの５％〜３０％蔗
糖グラディエンド」二にのせた。

緩衝液としては、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−５０ｍＭ　
ＥＤＴＡ　−５（ｌ　ｍＭ　　Ｎａ（’／ｌ！　（ｐＦ
Ｔ　８．　Ｏ）を使用した。

２０．０００　ｒｐｍ　、　６時間、１０℃で遠心分離
処理した後、遠心管の底に穴を開は−Ｃ１１０滴づつ分
画した。各分画中のＤＮＡ］、Ｏｌｚ／を０゜８チアガ
ロースゲルトで電気泳動させて、そのＤＮＡの分子量を
確認した。そして、分子量６メガダルトンの８画分を１
０ｍ、Ｍ　　Ｔｒｉｓ　−０，１ｍＭＥＪ−）ＴＡ緩衝
液で透析しまた。以上の処理を経て、第１図ＣＢ）の切
断地図で表わされるｐＡ、Ｍα１をβ１、ｒｌの混合物
から分離した。

（３）　　ｏＡｃＹｃ　１７７及びｐＡＭα１の制限酵
素による切断及びＴ４リガーゼによる連結（Ｉｉｇａｔ
ｉｏｎ　）。

上記（１）項、（２）項記載の処理により得られた１０
１１１の各ＤＮＡ　（０，１〜０．２ｚｔｇｒ）ＮＡｔ
）に、Ｉ　Ｉｌｌの１００倍量の緩衝液（１０ｍＭ　　
Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ（ｐＩ−１７，６）、７ｍ、Ｍ　Ｍ
ｇＣｌ７．７　ｍＭ　　β−メルカプトエタノール）を
加えた後、更に、１　ｔｔｌｌのＰｓｔ　Ｉを添加し、
これを３７℃、６０分間反応させた。そ１−て、６０℃
、１０分間でこの反応を停止させた後、１１５０量の５
ＭＮａＣｌを加え、更に、全量の２倍量の一２０℃の冷
エタノールを加え、これを−２０℃、３０分間冷却しま
た。更に、これを１５．００Ｏｒｐｍ、０℃、５分間、
遠心分離処理した後、」二清を捨てて、沈澱物を再び一
２０℃エタノールで洗滌した。これを１５，０００　ｒ
ｐｍ、０℃、２分間、遠ノ１ｉ　、、−ｒｉｌト処即し
た後、上清のエタノールを捨てて、更に、エタノールを
完全に蒸発させた。

、てれにより得られたＩ）　Ｎ　Ａ断ハに２０μｌの滅
菌水を加えて溶解させ、１０　ｍ、Ｍ　ＡＴＰ　：３１
１１．１、００　ｍＭ　　ジチオスレイトール　３ｚｔ
ｌ、６６０ｍＭ　肯ｉｓ　−ＨＣＩＪ　（ｐＨ７，６）
　−６６ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ３１ｔｌを加え、更に、４０
０．１位／１ｌｔＪのＴ４リガーゼを０．５１ｔｌ加え
た。１５℃で一夜反応を行わぜた後、１２０／ｌｌの滅
菌水を加えて、全Ｉを１５０μｌとした。

（４）　　プラスミドＩ）ＮＡによる大腸菌の形質転換
。

ニジエリシア・コリ■ぐ１２　　ＣＣ６００ｒ、（東京
大学応用微生物研究所斎藤研究室保有）株を、Ｌ−ブロ
ス中で一夜培養し、た。この培養液０．０５　ｍｌを５
　ｍｌのＬ−ブｏ　、ｚ、　Ｋ加えて、３７℃で２時間
１０分の振とり培養を行った。

遠心分離処理にて集菌した後、得られた菌を０　℃の０
．１　Ｍ　　ＣａＣ４水で洗滌し、０．２５　ｄ（７）
　０　’Ｃ１０，１Ｍ　　Ｃａ（’４水に溶解す−るこ
とにより、コンピテント細胞を作製１〜た。そＩ〜て、
Ｑ、　ｌ　ｍｌのコンビプント細胞に対して、ｏ、　ｉ
　ｍｌの、上記（３）項の処理により、得られた１、）
　Ｎ　Ａ（濃度　１　ｔｔｇ／ｍｌ　）を加え、０°Ｃ
にて５分間、放置シた後、Ｏ，Ｂ　ｍｌのＬ−ブロスを
加えて、３７℃で１時間、培養ｌまた。次いで、この培
養液を、Ｌ−ブロスに１．５％寒天と、２０１ｔｆＺ／
　ｍｌのテトラ−リ゛イクリンと、２０μｇ　／ｍｌの
カナマイシンとを添加して成る選択培地の表面上に塗布
１〜て、３７℃で一夜培養（−７た。その際、この選択
培地上でゴロニーを形成した１０株の形質転換体につい
て、保有シラスミドの大きさを８周べた。

（５）形質転換体からのプラスミドＤ　Ｎ　Ａの抽出及
び分子袖の測定。

形質転換体をＬ−ブロス中で一夜培養［７た培養液５　
ｍｌを遠心分離処理にて集菌１．た。次いで、５＋離さ
れた閑を０．５　ｍｌの１００　ｍ、Ｍ　　Ｎａ−（＃
−５０ｒｎＭ　　’ｒｒｉｓ−１（１ｍＭ　　Ｔら［）
ＴＡ　（ｐ）Ｉ７．４　）に溶解させた。この溶液に０
．２　ｍｌの２ｍｇ／ｍｅリゾチームー０．５ｍｙ／ｍ
ｌ　　ＲＮａｓｅを加えて、３７℃で５分間反応させた
。Ｑ、　２ｒｎｌの２％ＳＤＳ溶液を加えて、３０゛″
Ｃで１〜２分間更に反応させ、０℃で１０分間放置後、
この溶液を２０．０００　ｒｐｍで０℃、１０分間遠心
分離処理し１１−６分離された上清０．５　ｍ１１！に
緩衝液Ａで飽和し７たフェノール０．５　ｍｌを加え、
よく混合した１、更に、これを、１５．００　Ｏｒｐｍ
で３分間室温で遠心分離処理ｌ−１水層を採取し、その
５ｊＪｔｔｌづつを０．８係アガロースゲル屯気泳動て
＼せ−（−１その分子晴を測定ｔまた。−Ｆ’　：ｌＬ
、：　’Ｊｊ口中（（−上り、１０株の形質転換体につ
いて、プラスミドの大きさを調べたところ、全て、分子
量約８．５メガダルトンであり、ｐＡＣＹＣ１７７とＩ
ｌ−１Ａα１の大きさの相と一致した。このようにして
、第１図囚（Ｂ）の切断地図で表わされるｐＡＣＹＣ１
７７、ｐＡＭα１から合成された複合プラスミドの５は
）、第１図Ｃ）の切断地図で表わされるものなｐＰＹ８
５０と命名Ｌ２、他の一つをｐＰＹ２０と命名した。こ
れにより、少なくとも、第１図Ｃ）の切断地図で表わさ
れるｐＰＹ８５０が大腸菌の生態系内で安定に増殖１７
、形質発現することが確認された。

なお、ｐＰＹ８５０への連結に際しては、ｐＡ、ＣＹＣ
１７７のＤ　Ｎ　、Ａ断片と、ｐＡＭα１のそれどの連
結方向の異る同分子量の他の複合プラスミドｐＰＹ２０
も同時的に生成されるが、両複合プラスミドｐＰＹ８５
０、ｐＰＹ２０は、Ｂａ、ｍＨｌを用いて、切断処理す
ることにより、断ハ゛の大きさの異る二つのグループと
して分離することができる。そして、第１図Ｃ）の切断
地図に基づいて、二つの複製開始領域（ＯｒｉｐＡＭα
１）、（Ｏｒｉ１７７）を欠失させることなく、しかも
、二つの遺伝子領域（Ｔｃ）（Ｋｍ）中に存在する全領
域中唯−の制限酵素認識切断部位の数を増大させるべく
、両遺伝子領域（Ｔｃ　）　（Ｋｍ、　）中の制限酵素
認識切断部位と同一の切断部位を含む全領域中の部分を
切断除去するために使用可能な制限酵素の存否の観点か
ら、両複合プラスミドｐＰＹ８５０、Ｉ）ＰＹ　２０の
うちｐｐｙ８５０が後続の縮小化処理に有望なものとし
て選択された。

〈実施例２〉・・・・・・・・・複合プラスミドエ）Ｐ
Ｙ、　６００の合成 （１）実施例１で作製された形質転換体ニジエリシア・
コリ　ＣＣ６００ｒ　　（ｐ、ＰＹ８５０）から、実施
例１の場合と同様の方法により、プラスミドＤ　Ｎ　Ａ
を抽出した。抽１−１１されたＩ）ＮＡ１８ｇ　／　２
０１１１３に２μｇの緩衝７４１　（１００ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ　−ＨＣｌ（＋）Ｈ７，ｆｉ　）、７０　ｍ、Ｍ
　ＭｇＣｅ２．７０　ｍＭ　　β−メルカプトエタノー
ル、５００ｍＭ　Ｎａｃｌ）を加え、さらに、４詔間限
酵素１３ａｍ）目を加えて、３７°Ｃで６０分間反応さ
せた。６０℃、１０分間熱処理してこの反応を停止さぜ
た後、８０　ｔｔｌＪの水を加え、２ｔｔｌの５Ｍ　　
ＮａＬ’、／？を加え、更に、−２０℃のエタノール２
００μｌを加えて、−２０℃で３０分間放置し、次いで
、０℃で５分間、１０．００　Ｏｒｐｍの遠心分離処理
によりＩ）　Ｎ　Ａを集めた。コレを、２００ｐｌ（７
）−２０℃エタノールで洗滌した後、２０μｌの水に溶
解させ、Ｔ４リガーゼを用いて実施例１と同様の方法で
連結処理（Ｉｉｇａｔｉｏｎ　）を行なつブこ。

（２）　　次いで、このＩ）　Ｎ　Ａ−を用いて、エシ
エＩＪシア・コリ　Ｋ１２　　Ｃ６Ｃ６００ｒ−に対す
る形質転換を行った。形質転換体は、２０μｇ　／ｍｌ
デトラザイクリン、２０μｇ／ｍｌカナマイシンに耐性
を示した。この形質転換体１０株について、実施例１と
同様の方法により、プラスミドの大きさを調べたところ
、全て、分子量約６メガダルトンであった。

このようにして、第１図Ｃ）の切断地図で表わされるｐ
ＰＹ８５０から合成された、第１図００切断地図で表わ
される複合プラスミドを■）ＰＹ６００と命名した。

そして、−」−記処理により、この１）ＰＹ６００も、
少なくとも、大腸菌に対するクローニングベクターとし
て使用可能であることが確認された。

〈実施例６〉・・・・・・・・・複合プラスミドｒ＋Ｐ
Ｙ５００の合成 実施例２で作製されたｒ＋Ｔ’Ｙ６００を、制限酵素Ｓ
ａｔ　Ｉを用いて実施例１と同様の酵素処理により、切
断し、更に、そのＤ　Ｎ　Ａ断ハをＴ４−リガーゼを用
いた酵未処理により連結（１ｉｇａｔｉｏｎ　）　して
、大腸菌に形質転換し２、分子量約５．０メガダルトン
のプラスミド（ｐＰＹ５００　）を作製した。これによ
り、第１図００切断坤図で表わされるｐＰＹ６００かも
第１図（ト）σ）切断地図で表わされるｐｐｙｓｏｏが
生成された。。

〈実施例４〉・・・・・・・・・複合プラスミドｒ＋Ｐ
Ｙ　５００の枯草菌（バチルス・ズ ブチリス（ｌ１ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂ−換 （１）　　コンビプント（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　）細胞
の調製。

Ｌ−寒天平板上で一夜培養１〜たバチリス・ズブヂルス
　マバ・−グ　１６８株（東京大学応用微生物研究所斎
藤研究室保有）を培地Ｉ（スビザイゼン　ミネラル培地
）　（Ｓｐｉｚｉｚｅｎｍｉｎｅｒａｌ　　ｍｅｄｉｕ
＋ｎ　　　：　　Ｋ２ｔｌＰＯ４１，４％、　ＫＨｚ　
Ｐ　０４０．６％、（ＮＨ４）、ＳＯ４０，２％、クエ
ン酸ナトリウム　０．１係、ＭｇＳＯ４・７　Ｈ，００
，０２係、グルコース　０６５％に対し２てカゼイン加
水分解物　０．０２係、Ｌ−トリプトファン　５０μｇ
　／ｍｌを加えたもの）に対して、Ｉ　Ｘ　１０８／ｍ
ｉ程度接種１−た。これを３７℃で振と５培養して、約
４時間経過後、静止期に入った段階で、培地ＩＩ　（培
地ＩのＬ−）リプトファンを５１＋ｇ／ｍｌと１−、、
更に、５ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ＋を加えたもの）中で、１０倍
に薄めて培養を続行した。培！液中の菌は９０分俊に、
コンピテント（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　）　　状態に達し
た。このコンピテント細胞０．　ｇ　ｍｌに実施例３に
て作製され／ｊｐＰＹ５００複合シラスミドのＤＮＡ溶
液０．１　ｍｌ、を加え’−（３７°Ｃで、９０分間振
と５培善り、なから形質転換を行なった。

（２）形質転換体の検出。

ＤＮＡ　（ｐＰＹ５００　）をとり込ませた形質転換体
を２０μｇ／ｍｌのテトラザイクリンを含む［１−寒天
平板上に塗布して、３７℃で２４時間培養した。得られ
）、−コロニーにつき、実施例１と同様の方法によりプ
ラスミドの存在を石７６ふ８ｔ７ブこ。

複製されたプラスミドｐｐＹ５００は、分子Ｍ約５．０
メガダ、ルトンのものであった。

そ１−て、実施例１．２と同様の方法により、ニジエリ
シア・コリＫ］、２　　Ｃ６Ｃ６００ｒ−に対する形質
転換も確認された。これにより、複合プラスミドｐＰＹ
　５００は、少なくとも、大腸菌と枯草菌の双方の宿主
−ベクター系におけイ）クロ・−ニングベクタ・−１即
ち、シャトルベクターであることが判明し人−３、 フｇ　＋６、形質転換体としてのニジエリシア・コリに
１２　　Ｃ６００ｒ−ｍ−（ｐＣ６００ｒ−及びバチル
ス・ズブチリス　１６８　　（ｐＰＹ５００　）は、そ
れぞれ、受託番号　微土研菌寄第６８７０号及び微工研
菌寄第６８６９号とＬ７て工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託済みである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、複合プラスミドｐＰＹ８５０、ｐＩ’Ｙ６０
０及び１）ＰＹ５００の合成処理工程を示す説明図であ
る。 Ａｍ、ｐ・・・アンピシリン耐性遺伝子領域Ｔｃ・・・
・・・テトラザイクリン耐性遺伝子領域Ｋｍ・・・・・
・カナマイシン耐性遺伝子領域ＯｒｉｐＡＭα１・・・
プラスミドｐＡＭα１由来の複製開始領域 Ｏｒｉ　１７７　＝−ベクタ　ｐＡＣＹＣ１′７７山来
の複製開始領域

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ストレプトコッカス・フェカリスＣ足旦■二ｃｏ
   ｃｃｕｓ　　ｆａｅｃａｌｉｓ　）のプラスミドｐＡＭ
   α１由来のテトラザイクリン耐性遺伝子領域と、該プラ
   スミドＰＡＭα１由来の複製開始領域と、ニジエリシア
   拳コリ（’Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｉａ　　ｃｏ旦）のベク
   ターｐＡＣＹＣ１７７由来のカナマイシン耐性〕す伝子
   領域と、該ベクターｐＡＣＹＣ１γγ由来の複製開始領
   、域とを不し、−１４ｆｌＮ已テトラザイクリン而１性
   遺伝子ｆ］貝域には、制限酵素Ｂａ、ｌＩに対する全領
   域中唯−の認識切断部位が位僅し、史に、前記カナマイ
   シン耐性遺伝子領域には、１０１］限酊素Ｘ１ｔｏｌ及
   びΩ匡１の各々に対する全領域中唯−の認識切断部位が
   位向することを特徴とする沖合プラスミド。
2. （２）約８，５　Ｉ−ノノダルト７．のひ１：１；ノ、
   ］記・’）　！１ｉｌｌ限酵素１１．３識明断部（５７
   ，（７）配列ノーｆｔｒ、　、Ｌ　リ’ｒ！ｊ　ｒ？’
   ｔ　＝’＋け＋’＋、１＋、イ）！Ｉｌｌ’　ｉｊ’Ｅ
   　ｉ’ｊｊ’ｉホの範囲第＋　、ｌｒｔ記１＆の沖合シ
   ラスミド１．１ＰＹ８５０　、、
3. （３）　　糸−１６，ｕ　ノ　カ　夕　！１１・　−の
   分　ｉ’　ニー、；　　と　、　　［・１１ピ（ｈ市１
   限醇素認識１ｊ１断部ＩＹンの配列〕置ζよｉｙ　７ｊ
   口微−）けｔ＞　ｈる’ｉｋ　ｇｉ請求の仲１囲第１ｓ
   Ｈ記載（７）腕台グラスミドｒ＋Ｐ）：’６ｔｌＯ、。
4. （４）約５．υメカゲルト７・の分子１１３と、Ｔ−記
   の制限酵素認識１．ＩＩＪ断部位の配列々により！［）
   徴づけられろ特８′１請求の範囲第１項ｉ［：載の和合
   ）°ラスミ１゛ｔ＋ＰＹ５υ０．．