JPS59145966A - 過酸化脂質の定量法 - Google Patents
過酸化脂質の定量法Info
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- JPS59145966A JPS59145966A JP1914083A JP1914083A JPS59145966A JP S59145966 A JPS59145966 A JP S59145966A JP 1914083 A JP1914083 A JP 1914083A JP 1914083 A JP1914083 A JP 1914083A JP S59145966 A JPS59145966 A JP S59145966A
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- JP
- Japan
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- lipid peroxide
- hydroperoxide
- sample
- heme
- measurement
- Prior art date
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- Granted
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒドロペルオキシド型過酸化脂質の新しい定量
法に関する。
法に関する。
過酸化脂質は近時循環器系障害を誘起する化合物として
種々の而でとりあげられて米ているが、過酸化脂質には
、二次生成物としてマロンジアルデヒドを生ずるいわゆ
るエンド型過酸化脂質と、マロンジアルデヒド生成効率
の低いヒドロペルオキシド型過酸化脂質とが存在し、血
管の彎縮、血栓の形成等の障害を惹起するのは、ヒドロ
ペルオキシド型のものと云われている。
種々の而でとりあげられて米ているが、過酸化脂質には
、二次生成物としてマロンジアルデヒドを生ずるいわゆ
るエンド型過酸化脂質と、マロンジアルデヒド生成効率
の低いヒドロペルオキシド型過酸化脂質とが存在し、血
管の彎縮、血栓の形成等の障害を惹起するのは、ヒドロ
ペルオキシド型のものと云われている。
従来から比較的正確な測定値を与える過酸化脂質の定量
法として知られているチオバルビッール酸を使用する方
法は、マロンジアルデヒドの定量法であって、主として
エンド型過酸化脂質含駄に対する目安を与えるに過ぎな
い。
法として知られているチオバルビッール酸を使用する方
法は、マロンジアルデヒドの定量法であって、主として
エンド型過酸化脂質含駄に対する目安を与えるに過ぎな
い。
ヒドロペルオキシド型過酸化脂質の定量法としては、化
学反応を利用するものとして、（１）ヨードメトリー法
、および（２）還元色素（ロイコ体）酸化法が、物理化
学的手法を利用するものとして、（１）赤外法、および
（２）共役ジエン法等が知られている。しかしながら、
これら従来法において、化学反応を利用する方法は、反
応柴件の変動に大きく左右された、す、妨害物質の影響
を受けやすく、更に前処理が煩雑であり、物理化学的手
法は交雑物の影響を受けやすく適用対象が制限され、検
出感度も満足すべきものでなかった。また酵素を使用す
る測定方法として、グルタチオンペルオキシダーゼを用
いる方法も試みられているが、内因性のグルタチオンに
よる妨害或いは試料中に含まれるグルタチオン分解酵素
によるグルタチオンの減少等の因子により、測定値の信
頼性は低い。
学反応を利用するものとして、（１）ヨードメトリー法
、および（２）還元色素（ロイコ体）酸化法が、物理化
学的手法を利用するものとして、（１）赤外法、および
（２）共役ジエン法等が知られている。しかしながら、
これら従来法において、化学反応を利用する方法は、反
応柴件の変動に大きく左右された、す、妨害物質の影響
を受けやすく、更に前処理が煩雑であり、物理化学的手
法は交雑物の影響を受けやすく適用対象が制限され、検
出感度も満足すべきものでなかった。また酵素を使用す
る測定方法として、グルタチオンペルオキシダーゼを用
いる方法も試みられているが、内因性のグルタチオンに
よる妨害或いは試料中に含まれるグルタチオン分解酵素
によるグルタチオンの減少等の因子により、測定値の信
頼性は低い。
本発明者等は、ヒドロペルオキシド型過酸化脂質を高感
度且つ迅速に測定する方法について鋭意研究を重ねた結
果、活性酸素を利用した発光分析を行なうことによシ、
極く微厳例えば数１０μｔノ試料中に含まれるヒドロペ
ルオキシド型過酸化脂質を極めて短時間例えば数秒で測
定できることを見出して、本発明を完成した。
度且つ迅速に測定する方法について鋭意研究を重ねた結
果、活性酸素を利用した発光分析を行なうことによシ、
極く微厳例えば数１０μｔノ試料中に含まれるヒドロペ
ルオキシド型過酸化脂質を極めて短時間例えば数秒で測
定できることを見出して、本発明を完成した。
即ち、本発明の特徴とするところは、ヒドロペルオキシ
ド型過酸化脂質を定面する方法ておいて、２価の陽イオ
ンを生成する遷移金属の塩もしくは水ば化物、２価状態
の遷移金属の錯体、ヘム、ヘムペプチド、ヘム蛋白質ま
たはヘム酵素に被検試料溶液を加え、生ずる活性酸素を
増感剤と反応させて光学的に測定することにあシ、この
方法では試料に特別な前処理を施す事なく簡便で迅速に
高感度でヒドロペルオキシ型過醒化脂質濃度を測定する
ことができる。
ド型過酸化脂質を定面する方法ておいて、２価の陽イオ
ンを生成する遷移金属の塩もしくは水ば化物、２価状態
の遷移金属の錯体、ヘム、ヘムペプチド、ヘム蛋白質ま
たはヘム酵素に被検試料溶液を加え、生ずる活性酸素を
増感剤と反応させて光学的に測定することにあシ、この
方法では試料に特別な前処理を施す事なく簡便で迅速に
高感度でヒドロペルオキシ型過醒化脂質濃度を測定する
ことができる。
本発明方法において、過酸化脂質に作用して活性酸素を
生じ発光を惹起するものとしては、２価の陽イオンを生
成する遷移金属の塩例えばＦ、ｚ−ｔ−、、生ずる塩化
第１鉄、硫酸第１鉄など、Ｍｎ”ｉ生ずる塩化第１マン
ガン、硫酸第１マンガンなど、Ｃ０２“を生ずる塩化第
１コバルト、硫酸第１コバルトなど、同様な遷移金属の
水酸化物、２価状態の遷移金属の錯体例えばポルフィリ
ン鉄（ｌＩ）錯塩など、ヘム蛋白質例えばチトクローム
Ｃ１ヘモグロビン、ミオクロビンナト、ヘムペプチド例
えばチトクロームＣをキモトリプシン、トリプシン等の
ような蛋白質分解酵素で分解した化合物、ヘム酵素例え
ばワサビペルオキシダーゼ、プロスタグランジンヒドロ
ペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼなどがあげ
られる。好適な化合物としてはヘム蛋白質、ヘムペプチ
ド、ヘム酵素であるが、通常は取少扱イカ容易なヘムペ
プチドが使用される。（Ｆ用される濃度は、化合物によ
っても異なるが約０．１１１１７ｍ１〜３０ ＯＡｔ／
ｍ１． Ｌ７）範ｉｆ使用可４ｐ−ｃ’あり、通常は１
μ？／ ｍＡ〜１００μｔ ／ｍｉの濃度が用いられる
。例えば西洋ワサビペルオキシダーゼの場合は約２０μ
Ｐ／ｒＩＬｌ程度、チトクロームＣヘムペプチドの場合
には約２μｙ／ｍｌｌ程度のときに最も発光効率が良い
。
生じ発光を惹起するものとしては、２価の陽イオンを生
成する遷移金属の塩例えばＦ、ｚ−ｔ−、、生ずる塩化
第１鉄、硫酸第１鉄など、Ｍｎ”ｉ生ずる塩化第１マン
ガン、硫酸第１マンガンなど、Ｃ０２“を生ずる塩化第
１コバルト、硫酸第１コバルトなど、同様な遷移金属の
水酸化物、２価状態の遷移金属の錯体例えばポルフィリ
ン鉄（ｌＩ）錯塩など、ヘム蛋白質例えばチトクローム
Ｃ１ヘモグロビン、ミオクロビンナト、ヘムペプチド例
えばチトクロームＣをキモトリプシン、トリプシン等の
ような蛋白質分解酵素で分解した化合物、ヘム酵素例え
ばワサビペルオキシダーゼ、プロスタグランジンヒドロ
ペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼなどがあげ
られる。好適な化合物としてはヘム蛋白質、ヘムペプチ
ド、ヘム酵素であるが、通常は取少扱イカ容易なヘムペ
プチドが使用される。（Ｆ用される濃度は、化合物によ
っても異なるが約０．１１１１７ｍ１〜３０ ＯＡｔ／
ｍ１． Ｌ７）範ｉｆ使用可４ｐ−ｃ’あり、通常は１
μ？／ ｍＡ〜１００μｔ ／ｍｉの濃度が用いられる
。例えば西洋ワサビペルオキシダーゼの場合は約２０μ
Ｐ／ｒＩＬｌ程度、チトクロームＣヘムペプチドの場合
には約２μｙ／ｍｌｌ程度のときに最も発光効率が良い
。
本発明の方法に使用される増感剤としては、活性酸素と
反応して発光する化合物であれば特に限定はなく、その
ような化合物の例としては、例えばピロガロール、バー
ブロガリンのようなポリヒドロキシフェノール類、例え
ばルミノール、イソルミノールのようなフタラジン誘導
体、例えばインドール酢酸、スカトール、トリプトファ
ンのようなインドール誘導体、例えばウミホタルルンフ
エリン、ロフィンのようなチアゾリジン誘導体、例えば
ルンゲニンのようなアクリジン誘導体、例えばビストリ
クロロフェニルオキザレートのような蓚酸誘導体、１，
２−ジオキサ−４，５−アジン誘導体などがあげられる
。
反応して発光する化合物であれば特に限定はなく、その
ような化合物の例としては、例えばピロガロール、バー
ブロガリンのようなポリヒドロキシフェノール類、例え
ばルミノール、イソルミノールのようなフタラジン誘導
体、例えばインドール酢酸、スカトール、トリプトファ
ンのようなインドール誘導体、例えばウミホタルルンフ
エリン、ロフィンのようなチアゾリジン誘導体、例えば
ルンゲニンのようなアクリジン誘導体、例えばビストリ
クロロフェニルオキザレートのような蓚酸誘導体、１，
２−ジオキサ−４，５−アジン誘導体などがあげられる
。
使用される濃度は使用される化合物によっても異なるが
、一般には０．１μｙ／ｒｎ１以上の濃度が好ましく、
通常は約１μｍ７Ｍ〜２０μｆ／ｒｎ１３の濃度範囲が
適当である。発光効率は濃度の増加に伴って増大するが
、は＼゛一定となる濃度は一般には１０μり／ｒｒｔ１
前後であって、例えばルミノールの場合には約９μＷ／
ｒｕｌの値が得られている。
、一般には０．１μｙ／ｒｎ１以上の濃度が好ましく、
通常は約１μｍ７Ｍ〜２０μｆ／ｒｎ１３の濃度範囲が
適当である。発光効率は濃度の増加に伴って増大するが
、は＼゛一定となる濃度は一般には１０μり／ｒｒｔ１
前後であって、例えばルミノールの場合には約９μＷ／
ｒｕｌの値が得られている。
本発明の方法において測定対象となるヒドロペルオキシ
ド型過酸化脂質被検試料の例としては、例えばｔ−ブチ
ルヒドロペルオキシド、キュメンヒドロペルオキシドの
ような一般的な有機ヒドロペルオキシド化合物、例えば
リノール敵ヒドロペルオキシド、リルン酸ヒドロペルオ
キシド、アラキドン酸ヒドロペルオキシドのような多価
不飽和脂脂酸のヒドロペルオキシド化合物、その他生体
内成分白米のヒドロペルオキシド例えば血清脂質由来の
ヒドロペルオキシド、リボ蛋白質白米のヒドロペルオキ
シド、組織中のヒドロペルオキシドなどが測定対象とな
る。
ド型過酸化脂質被検試料の例としては、例えばｔ−ブチ
ルヒドロペルオキシド、キュメンヒドロペルオキシドの
ような一般的な有機ヒドロペルオキシド化合物、例えば
リノール敵ヒドロペルオキシド、リルン酸ヒドロペルオ
キシド、アラキドン酸ヒドロペルオキシドのような多価
不飽和脂脂酸のヒドロペルオキシド化合物、その他生体
内成分白米のヒドロペルオキシド例えば血清脂質由来の
ヒドロペルオキシド、リボ蛋白質白米のヒドロペルオキ
シド、組織中のヒドロペルオキシドなどが測定対象とな
る。
測定溶液の液性は特に限定ないが、弱塩基性溶液での測
定が好１しく、特［ｐＨ９〜１０程度が餐好な結果を与
える。そ。ようケ液性を与える緩衝液としてはホウ酸緩
衝液（Ｈ３ＢＯ３−ＫＯＨ）、炭酸緩衝液（Ｎａ２Ｃｏ
３−ＮａＨＯＯ３）、グリシン緩衝液（ＮＨ２ＯＨ２０
００Ｈ−ＮａＯＨ）などが使用される。
定が好１しく、特［ｐＨ９〜１０程度が餐好な結果を与
える。そ。ようケ液性を与える緩衝液としてはホウ酸緩
衝液（Ｈ３ＢＯ３−ＫＯＨ）、炭酸緩衝液（Ｎａ２Ｃｏ
３−ＮａＨＯＯ３）、グリシン緩衝液（ＮＨ２ＯＨ２０
００Ｈ−ＮａＯＨ）などが使用される。
超微批のヒドロペルオキシド型過酸化脂質の分析に際し
、溶存酸素が妨害する場合があるので発光測定用セル内
および試料室を不活性ガス置換することが安定した測定
値を得る上で好ましい。本発明者等は、後記のように容
易に測定用セル内を不活性ガス置換しうる構造の装置を
も発明した。不活性ガスとしては窒素ガス、アルゴンガ
ス等が使用される。
、溶存酸素が妨害する場合があるので発光測定用セル内
および試料室を不活性ガス置換することが安定した測定
値を得る上で好ましい。本発明者等は、後記のように容
易に測定用セル内を不活性ガス置換しうる構造の装置を
も発明した。不活性ガスとしては窒素ガス、アルゴンガ
ス等が使用される。
本発明の方法は、通常好適には過酸化脂質と反応して活
性酵素を生ずる化合物および増感剤を含む溶液を測定用
セル（セプタム付石英製つ℃学セル）に入れ、不活性ガ
ス置換した後、過酸化脂質被検試料を加えて発光々散を
測定することによって容易に実施される。この場合被検
試料液の透明度、色言固等は特に悪影響を及ＩスさなＧ
）。
性酵素を生ずる化合物および増感剤を含む溶液を測定用
セル（セプタム付石英製つ℃学セル）に入れ、不活性ガ
ス置換した後、過酸化脂質被検試料を加えて発光々散を
測定することによって容易に実施される。この場合被検
試料液の透明度、色言固等は特に悪影響を及ＩスさなＧ
）。
測定用セルの容Ｒは通常の光学セル程度でよく、発光々
量の測定は常法にしたがって行なわれる。通常被検試料
の曖は約１０μを乃至１００μｔ、光学セルは巾１ｃｍ
、厚さ１ｃｍの通常の容はで、使用される液計は通常１
乃至数ｍＡである。
量の測定は常法にしたがって行なわれる。通常被検試料
の曖は約１０μを乃至１００μｔ、光学セルは巾１ｃｍ
、厚さ１ｃｍの通常の容はで、使用される液計は通常１
乃至数ｍＡである。
装置にの始動、測定、結果等の出力は全て自動化するこ
とができ、予め求められた検＠線から過酸化脂質酔度が
割算される。
とができ、予め求められた検＠線から過酸化脂質酔度が
割算される。
通常検址線の作製には、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド
、キュメントヒドロキシベルオキンド、リノール酸ヒド
ロペルオキシド、アラキドンｌ！ジヒドロペルオキシド
等から選択されて使用される。
、キュメントヒドロキシベルオキンド、リノール酸ヒド
ロペルオキシド、アラキドンｌ！ジヒドロペルオキシド
等から選択されて使用される。
次に本発明の方法によって、ヒドロペルオキシド型過酸
化脂質を定量分析する為に使用される好適な装置の１例
として、本発明者らの発明に係る装置をあげて説明する
。第１図より第４図までは本発明方法に使用される発光
測定用セルであシ＼材質としては石英が好ましい。図中
１はセル本体、２はセプタムであシ材質としてはマイク
ロシリンジの注射釧が貫：Ｊｉ Ｌ且つ抜針したときに
閉塞されるような弾性を有するものが好ましく、通常は
ゴム、合成ゴム等特にシリコンゴムが使用される。また
セル内部に面する部位はゴムの削りクズが生じて反応に
悪影響を与えぬようテフロンのような不活性体で加工す
るのカ好ましい。３はキャップであり薔中央にはセプタ
ムを通して注射針が入るよう孔がおいている。材質に特
に限定はないが通常プラスチック性のものが使用される
。上記測定用セルを使用することによ゛り、セル中にお
ける溶液に含まれる溶存酸素を不活性ガスで置換する操
作や測定用試料と試薬との接触が空気の影響を受けるこ
となく行なうことができる。第５図よシ第γ図までは測
定装置の試料室および測光部を示し、第５図は正面の透
視図、第６図は側面の透視図、第１図は上面を示したも
のである。試料室は不活性ガス雰囲気に保たれるように
工夫されている。図中４は測定用セルのホルダ一部分で
あシ、こ＼に測定用セルを挿入する。５はマイクロシリ
ンジガイドで太い筒状の部分（５ａ）と細い筒状の部分
（５ｂ）とよシ成シ、太い部分は注射筒の支えとなり細
い部分にマイクロシリンジの針が差し込まれる。５ａと
５ｂとはネジ部５Ｃによって接続され、ネジ部には上部
よりの光を遮断するための遮光用ラバーセプタムとＱ
ＩＪソングが設置されている。５Ｃの先端は測定用セル
蓋部のセプタム上に密着するように調節される。本装置
に使用されるマイクロシリンジは通常市販されている例
えば汎用５０μｔ、１００μｔなどのものを特に限定な
く使用しつる。６はセルホルダーブロックで測定用セル
を恒温に保つための金属製のブロックであって、８およ
び９で示される導入・排出口よりの恒温水の循環によっ
てブロック全体を恒温に保つ。７は試料室内の空気を置
換するだめの不活性ガスの導入ノズルであシこ＼よシ導
入されブロックで温められた不活性ガスはセルホルダ一
部分に存在させる小孔よシ排出し試料室が充たされる。
化脂質を定量分析する為に使用される好適な装置の１例
として、本発明者らの発明に係る装置をあげて説明する
。第１図より第４図までは本発明方法に使用される発光
測定用セルであシ＼材質としては石英が好ましい。図中
１はセル本体、２はセプタムであシ材質としてはマイク
ロシリンジの注射釧が貫：Ｊｉ Ｌ且つ抜針したときに
閉塞されるような弾性を有するものが好ましく、通常は
ゴム、合成ゴム等特にシリコンゴムが使用される。また
セル内部に面する部位はゴムの削りクズが生じて反応に
悪影響を与えぬようテフロンのような不活性体で加工す
るのカ好ましい。３はキャップであり薔中央にはセプタ
ムを通して注射針が入るよう孔がおいている。材質に特
に限定はないが通常プラスチック性のものが使用される
。上記測定用セルを使用することによ゛り、セル中にお
ける溶液に含まれる溶存酸素を不活性ガスで置換する操
作や測定用試料と試薬との接触が空気の影響を受けるこ
となく行なうことができる。第５図よシ第γ図までは測
定装置の試料室および測光部を示し、第５図は正面の透
視図、第６図は側面の透視図、第１図は上面を示したも
のである。試料室は不活性ガス雰囲気に保たれるように
工夫されている。図中４は測定用セルのホルダ一部分で
あシ、こ＼に測定用セルを挿入する。５はマイクロシリ
ンジガイドで太い筒状の部分（５ａ）と細い筒状の部分
（５ｂ）とよシ成シ、太い部分は注射筒の支えとなり細
い部分にマイクロシリンジの針が差し込まれる。５ａと
５ｂとはネジ部５Ｃによって接続され、ネジ部には上部
よりの光を遮断するための遮光用ラバーセプタムとＱ
ＩＪソングが設置されている。５Ｃの先端は測定用セル
蓋部のセプタム上に密着するように調節される。本装置
に使用されるマイクロシリンジは通常市販されている例
えば汎用５０μｔ、１００μｔなどのものを特に限定な
く使用しつる。６はセルホルダーブロックで測定用セル
を恒温に保つための金属製のブロックであって、８およ
び９で示される導入・排出口よりの恒温水の循環によっ
てブロック全体を恒温に保つ。７は試料室内の空気を置
換するだめの不活性ガスの導入ノズルであシこ＼よシ導
入されブロックで温められた不活性ガスはセルホルダ一
部分に存在させる小孔よシ排出し試料室が充たされる。
１０は光学フィルターホルダ一部であり、通常の光学測
定器機におけるものと同様にセルホルダーに近い部分に
光学フィルターを挿入する部分を有し、こ＼に光学フィ
ルターを挿入することによって観測すべき光の波長領域
を適宜選択することができる。ｔた測光器様に近い部分
にシャッターを備え、これを閉じることによって暗電流
の測定をしたり、不使用時の測光系の保撤をする。１１
は通常使用されているヘッドオン型光数子計数用光電子
増倍管（例えば浜松テレビ（株）製ブＣ電子増倍管Ｒ−
１３３３）および−ｙｅ’市子増倍管冷却装置（例えば
同社製ＨＴＶ−○６５９−Ａ）のセットである。この１
１は冷却水の導入口および排出口を有し、また冷却装置
用電源、光電子ｊ’ＦＪ ’ＩＭ・ｄ相高圧電源、プレ
アンプ用電硯、シグナル回路に接続している。第８図は
測定系および測定結果の出力システムを示したものであ
る。図中１２は光電子増倍管用電諒組込み型フォトンカ
ウンター、１３は雑音消去用フォトカップラーアッセン
ブリー、１４は ／。パスユニット、１５はマイクロプ
ロセッサ−１１６はフロッピーディスクドライブユニッ
ト、１７はディスプレーそして１日はプリンターを夫々
用している。第９図は下記測定例におけるディスプレー
およびプリンターの出力モードの１例であって、発光の
時間特性曲線を示したものである。即ち発光測定用セル
に充填された試薬に、ヒドロペルオキシド型過酸化脂質
を含む試料を注入添加することによって発する光は、１
１において電気信号に変換はれ、最終的に１７および／
または１８に時間の関数として表示または出力され、同
時にフロッピーディスクに記憶される。その際試料情報
および測定条件も同時に表示または出力し、記憶させる
ことができる。
定器機におけるものと同様にセルホルダーに近い部分に
光学フィルターを挿入する部分を有し、こ＼に光学フィ
ルターを挿入することによって観測すべき光の波長領域
を適宜選択することができる。ｔた測光器様に近い部分
にシャッターを備え、これを閉じることによって暗電流
の測定をしたり、不使用時の測光系の保撤をする。１１
は通常使用されているヘッドオン型光数子計数用光電子
増倍管（例えば浜松テレビ（株）製ブＣ電子増倍管Ｒ−
１３３３）および−ｙｅ’市子増倍管冷却装置（例えば
同社製ＨＴＶ−○６５９−Ａ）のセットである。この１
１は冷却水の導入口および排出口を有し、また冷却装置
用電源、光電子ｊ’ＦＪ ’ＩＭ・ｄ相高圧電源、プレ
アンプ用電硯、シグナル回路に接続している。第８図は
測定系および測定結果の出力システムを示したものであ
る。図中１２は光電子増倍管用電諒組込み型フォトンカ
ウンター、１３は雑音消去用フォトカップラーアッセン
ブリー、１４は ／。パスユニット、１５はマイクロプ
ロセッサ−１１６はフロッピーディスクドライブユニッ
ト、１７はディスプレーそして１日はプリンターを夫々
用している。第９図は下記測定例におけるディスプレー
およびプリンターの出力モードの１例であって、発光の
時間特性曲線を示したものである。即ち発光測定用セル
に充填された試薬に、ヒドロペルオキシド型過酸化脂質
を含む試料を注入添加することによって発する光は、１
１において電気信号に変換はれ、最終的に１７および／
または１８に時間の関数として表示または出力され、同
時にフロッピーディスクに記憶される。その際試料情報
および測定条件も同時に表示または出力し、記憶させる
ことができる。
測定例
ルミノール（９２３７１／ｒｎ／ｉ ０．０１ホウ酸緩
衝液ｐＨ９，３） ２ ｍＡＩおよびチトクロムＣヘム
ペプチド（サツカロミセス・オビフォルミスＭμ源チト
クロムＣのトリプシンおよびヘフシン分解ヘムペグチド
−５，１ｍｇ／ｒｒＬｉ上記ホウ酸緩衝液）（１，ｏｓ
ｍｘとを測定用石英セルに入れ、試料室に装着後、注射
針によ９２分間窒素ガスを吹き込んで溶存酸素を除去す
る。試料室に窒素ガスを導入しながら、マイクロシリン
ジによシ測定用セルに七−ブチルヒドロペルオキシド水
溶液（８４℃ｍｏｚｅ／ ” ） ０．０５ ｖｌｌを
添加する。その結果が第９図である。測定条件は次の通
りである。
衝液ｐＨ９，３） ２ ｍＡＩおよびチトクロムＣヘム
ペプチド（サツカロミセス・オビフォルミスＭμ源チト
クロムＣのトリプシンおよびヘフシン分解ヘムペグチド
−５，１ｍｇ／ｒｒＬｉ上記ホウ酸緩衝液）（１，ｏｓ
ｍｘとを測定用石英セルに入れ、試料室に装着後、注射
針によ９２分間窒素ガスを吹き込んで溶存酸素を除去す
る。試料室に窒素ガスを導入しながら、マイクロシリン
ジによシ測定用セルに七−ブチルヒドロペルオキシド水
溶液（８４℃ｍｏｚｅ／ ” ） ０．０５ ｖｌｌを
添加する。その結果が第９図である。測定条件は次の通
りである。
光電子増倍管；前記浜松テレビ（株）部付加電圧ニー１
４８２Ｖ フィルター：なし 測定温＃： ３７℃ デイクリミネーターレベル：６０ 注入時間：９秒 測定結果 極太値： １３８２２ 終了値：２３４ 初期値：２２１ 積分値：γＴ２５５ （第９図において縦←１１は発光値（ＣＰＳ）、横軸は
時間（分）を示している。） 次に実施例をあけて本発明の方法を更に具体的に説明す
るが、本発明はこれによって限定されるものではない。
４８２Ｖ フィルター：なし 測定温＃： ３７℃ デイクリミネーターレベル：６０ 注入時間：９秒 測定結果 極太値： １３８２２ 終了値：２３４ 初期値：２２１ 積分値：γＴ２５５ （第９図において縦←１１は発光値（ＣＰＳ）、横軸は
時間（分）を示している。） 次に実施例をあけて本発明の方法を更に具体的に説明す
るが、本発明はこれによって限定されるものではない。
実施例１
発光測定用セルに、ルミノール（９２３ｎｆ／ｒｎｌ）
、チトクロームＣヘムペプチド（サツカロミセス・オビ
フオルミスＭ２起原チトクロームＣをトリプシンおよび
ペプシン分解したヘムペプチド１２０ ｔｔ ｆ／ｗＬ
ｌ）を含む０．０１Ｍホウ酸緩衝液（１）Ｈ９，３）
２．０５ ｍＡを入れ、注射針により２分間窒業ガス置
換を行な９゜セルを測定装置の試料室（３１℃に胴筒）
に装着後、試料室に窒素ガスを通じながら、所定濃度（
１０℃ｍｏｚｅＡＬｌ〜２μｍ Ｏｔｅ／ｒｎＡの範囲
で第１０図に示される個々のｍＫ）（１）”−ブチルヒ
ドロペルオキシド水浴液５０μｔを注入して発光値を計
測する。発光値＆まピーク値および積分値で出力される
が、検緻線作製には全発光址を用いるのが、注入速度に
左右されず、良好な結果を与えた。検置線（ま第１０図
に示す通ｐであった。横軸はｔ−ブチルペルオキシドの
嘴であり目印および右縦軸は全発光量、○印および左Ｍ
ｌ動は発光ピーク値を示す。
、チトクロームＣヘムペプチド（サツカロミセス・オビ
フオルミスＭ２起原チトクロームＣをトリプシンおよび
ペプシン分解したヘムペプチド１２０ ｔｔ ｆ／ｗＬ
ｌ）を含む０．０１Ｍホウ酸緩衝液（１）Ｈ９，３）
２．０５ ｍＡを入れ、注射針により２分間窒業ガス置
換を行な９゜セルを測定装置の試料室（３１℃に胴筒）
に装着後、試料室に窒素ガスを通じながら、所定濃度（
１０℃ｍｏｚｅＡＬｌ〜２μｍ Ｏｔｅ／ｒｎＡの範囲
で第１０図に示される個々のｍＫ）（１）”−ブチルヒ
ドロペルオキシド水浴液５０μｔを注入して発光値を計
測する。発光値＆まピーク値および積分値で出力される
が、検緻線作製には全発光址を用いるのが、注入速度に
左右されず、良好な結果を与えた。検置線（ま第１０図
に示す通ｐであった。横軸はｔ−ブチルペルオキシドの
嘴であり目印および右縦軸は全発光量、○印および左Ｍ
ｌ動は発光ピーク値を示す。
実施例２
実施例１においてｔ−ブチルヒドロペルオキシドを使用
する代りに、アラキドン酸ヒドロペルオキシド（１５−
ヒドロベルオキシーエイコサテトラエノイツクアシツド
）を使用する以外は、実施例１と同様の操作をして検量
線を作製した。検１．／ｉ−線は第１１図に示す通ｐで
あった。
する代りに、アラキドン酸ヒドロペルオキシド（１５−
ヒドロベルオキシーエイコサテトラエノイツクアシツド
）を使用する以外は、実施例１と同様の操作をして検量
線を作製した。検１．／ｉ−線は第１１図に示す通ｐで
あった。
アラキドン酸ヒドロペルオキシドのｐ度はヨードメトリ
ーにより定偵した値を使用した。横軸はアラキドン酸ペ
ルオキシド針、縦軸は発光ピーク値を示す。横軸に平行
な影線はバックグランド値である。
ーにより定偵した値を使用した。横軸はアラキドン酸ペ
ルオキシド針、縦軸は発光ピーク値を示す。横軸に平行
な影線はバックグランド値である。
実施例３
実施例１において、チトクロームＣヘムペプチドを使用
する代りに、西洋ワサビペルオキシダーゼ（シグマ社製
、１２０μｆ／ｍ７！、）を使用する以外は実施例１と
同様の操作をして検畦純を作製した。検量線は第１２図
に示される通りであつた。横軸はｔ−ブチルペルオキシ
ドのけ、目印および右縦軸は全発光量、○および左縦１
す１１は発光ピーク値を示す。
する代りに、西洋ワサビペルオキシダーゼ（シグマ社製
、１２０μｆ／ｍ７！、）を使用する以外は実施例１と
同様の操作をして検畦純を作製した。検量線は第１２図
に示される通りであつた。横軸はｔ−ブチルペルオキシ
ドのけ、目印および右縦軸は全発光量、○および左縦１
す１１は発光ピーク値を示す。
実施例４
純系マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ！Ｊ）の頚動脈採血によ！ｌ
ｌ得られた血清を、生理食塩水にて８倍に稀釈する。こ
れを１００％として１．．２０ ％、’４０ ％、６０
％、８０％の各血清合計の試料を作製し、生理食塩水お
よび１００％の場合も含めその発光量を測定した。実験
は実施例１においてｔ−ブチルペルオキシドを使用する
代りに上記血清等を使用して全く同様にして行なわれた
。その結果は第１３図に示される通りである。横軸は血
清濃度・印および右縦ｆｒｑｂは発光ピーク（直、○お
よび左縦軸は全発光量を示す。横軸に平行な影線はバッ
クグランドを示す。
ｌ得られた血清を、生理食塩水にて８倍に稀釈する。こ
れを１００％として１．．２０ ％、’４０ ％、６０
％、８０％の各血清合計の試料を作製し、生理食塩水お
よび１００％の場合も含めその発光量を測定した。実験
は実施例１においてｔ−ブチルペルオキシドを使用する
代りに上記血清等を使用して全く同様にして行なわれた
。その結果は第１３図に示される通りである。横軸は血
清濃度・印および右縦ｆｒｑｂは発光ピーク（直、○お
よび左縦軸は全発光量を示す。横軸に平行な影線はバッ
クグランドを示す。
実施例５
ウィスター・イマミチ（Ｗ、工、）系ラットおよび純系
マウス（ＢＡＬＢｌｏＪ）の頚動脈採血によって得られ
た夫々の血清５ｏμｔを、ルミノール９μｙ／ｍｌ、チ
トクロームＣヘムヘッドＣ前ｔＢ ）１２ ｔｉ ｆ
／ｍｌを含む００１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９，３）２
ｔａｌｌに注入し、ヒドロペルオキシド型過酸化脂質社
を求めた。窒素ガス置換等の操作は実施例１と同様に行
なった。ラット１０匹およびマウス９匹についておこな
い第１表の如き結果を得た。同数のＴＢＡ法による血清
ＭＤＡ測定値も併せ
マウス（ＢＡＬＢｌｏＪ）の頚動脈採血によって得られ
た夫々の血清５ｏμｔを、ルミノール９μｙ／ｍｌ、チ
トクロームＣヘムヘッドＣ前ｔＢ ）１２ ｔｉ ｆ
／ｍｌを含む００１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９，３）２
ｔａｌｌに注入し、ヒドロペルオキシド型過酸化脂質社
を求めた。窒素ガス置換等の操作は実施例１と同様に行
なった。ラット１０匹およびマウス９匹についておこな
い第１表の如き結果を得た。同数のＴＢＡ法による血清
ＭＤＡ測定値も併せ
第１図より第４図は測定用セルを示し、第１図は上面図
、第２図は側面の第１図におけるＡ−Ａの断面図、第３
図は底面図、第４図は部品の側面図を示す。第５図よシ
第Ｔ図は測定装置の透視図を示し、第５図は正面、第６
図は側面、第１図は上面よシのものを示す。第８図は測
定系および結果の出力システムを示す。第９図はｔ−ブ
チルヒドロペルオキシドをチトクロームＣヘムペプチド
−ルミノールで測定した測定結果を示す。第１０図はｔ
−ブチルヒドロペルオキシドをチトクロームＣヘムペプ
チド−ルミノールで発光させた検量線である。横軸はｔ
−ブチルペルオキシドの風であシ、目印および右縦軸は
全発光量、○印および左縦軸は発光ピーク値を示す。第
１１図はアラキドン醒ヒドロペルオキシドをナトクロー
Ｃヘムペプチド−ルミノールで発光させた検量線である
。横軸はアラキドン酸ペルオキシド量、縦軸は発光ピー
ク値を示ス。第１２図はｔ−ブチルヒドロペルオキシド
を西洋ワサビペルオキシダーセールミノールで発光させ
た検量線である。横１軸はｔ−ブチルペルオキシドの量
、目印および右縦軸は全発光量、○および左縦軸は発光
ピーク値を示す。第１３図はマウス血清をチトクローム
Ｃヘムペプチド−ルミノールで発光させた検量線である
。 横軸は血清濃度、・印および右縦軸は発光ピーク値、○
印および左縦軸は全発光量を示す。第１１図および第１
３図における横軸に平行な影線はバックグランドを示す
。 特許出願人 三共株式会社 代理人 弁理士樫出庄治 鑵 １ 図 ？ 第２Ｅ ≠８図 第４図 中 第８図 １７ ３８０− Ｎ９ 図 、Ｚ！ｊ 、５．７５ ＋ 分第
１０図 第１１図 ０１０２ （ｎｍｏｌｅ／ｍｌ） ン１２図 （ｎｒｎｏｌｅ／ｍｌ） 第１３図 ｒ 、、ｌ Ａ ４ 。
、第２図は側面の第１図におけるＡ−Ａの断面図、第３
図は底面図、第４図は部品の側面図を示す。第５図よシ
第Ｔ図は測定装置の透視図を示し、第５図は正面、第６
図は側面、第１図は上面よシのものを示す。第８図は測
定系および結果の出力システムを示す。第９図はｔ−ブ
チルヒドロペルオキシドをチトクロームＣヘムペプチド
−ルミノールで測定した測定結果を示す。第１０図はｔ
−ブチルヒドロペルオキシドをチトクロームＣヘムペプ
チド−ルミノールで発光させた検量線である。横軸はｔ
−ブチルペルオキシドの風であシ、目印および右縦軸は
全発光量、○印および左縦軸は発光ピーク値を示す。第
１１図はアラキドン醒ヒドロペルオキシドをナトクロー
Ｃヘムペプチド−ルミノールで発光させた検量線である
。横軸はアラキドン酸ペルオキシド量、縦軸は発光ピー
ク値を示ス。第１２図はｔ−ブチルヒドロペルオキシド
を西洋ワサビペルオキシダーセールミノールで発光させ
た検量線である。横１軸はｔ−ブチルペルオキシドの量
、目印および右縦軸は全発光量、○および左縦軸は発光
ピーク値を示す。第１３図はマウス血清をチトクローム
Ｃヘムペプチド−ルミノールで発光させた検量線である
。 横軸は血清濃度、・印および右縦軸は発光ピーク値、○
印および左縦軸は全発光量を示す。第１１図および第１
３図における横軸に平行な影線はバックグランドを示す
。 特許出願人 三共株式会社 代理人 弁理士樫出庄治 鑵 １ 図 ？ 第２Ｅ ≠８図 第４図 中 第８図 １７ ３８０− Ｎ９ 図 、Ｚ！ｊ 、５．７５ ＋ 分第
１０図 第１１図 ０１０２ （ｎｍｏｌｅ／ｍｌ） ン１２図 （ｎｒｎｏｌｅ／ｍｌ） 第１３図 ｒ 、、ｌ Ａ ４ 。
Claims (1)
- ２価の陽イオンを生成する遷移金属の塩もしくは水酸化
物、２価状態の遷移金属の錯体、ヘム、ヘムペプチド、
ヘム蛋白質またはヘム酸素にヒドロペルオキシド型過酸
化脂質被検試料溶液を加え、生ずる活性酸素を増感剤と
反応させて光学的に測定することを特徴とするヒドロペ
ルオキシド型過酸化脂質の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1914083A JPS59145966A (ja) | 1983-02-08 | 1983-02-08 | 過酸化脂質の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1914083A JPS59145966A (ja) | 1983-02-08 | 1983-02-08 | 過酸化脂質の定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59145966A true JPS59145966A (ja) | 1984-08-21 |
| JPH049264B2 JPH049264B2 (ja) | 1992-02-19 |
Family
ID=11991144
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1914083A Granted JPS59145966A (ja) | 1983-02-08 | 1983-02-08 | 過酸化脂質の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59145966A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63233374A (ja) * | 1987-03-20 | 1988-09-29 | Tohoku Denshi Sangyo Kk | 過酸化脂質の測定方法およびその測定装置 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5492391A (en) * | 1977-12-29 | 1979-07-21 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Measuring of peroxide substance |
| JPS5713357A (en) * | 1980-06-02 | 1982-01-23 | Miles Lab | Composition for measuring peroxiding activation material, testing device and method and production thereof |
-
1983
- 1983-02-08 JP JP1914083A patent/JPS59145966A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5492391A (en) * | 1977-12-29 | 1979-07-21 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Measuring of peroxide substance |
| JPS5713357A (en) * | 1980-06-02 | 1982-01-23 | Miles Lab | Composition for measuring peroxiding activation material, testing device and method and production thereof |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63233374A (ja) * | 1987-03-20 | 1988-09-29 | Tohoku Denshi Sangyo Kk | 過酸化脂質の測定方法およびその測定装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH049264B2 (ja) | 1992-02-19 |
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