JPS59148725A - 高純度のヒト・トランスフエリンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗原−抗体反応を利用して吸着法によシ高純度
のヒト・トランスフェリンを得る方法に関し、詳しくは
、細胞融合で作成したハイプリドーマ細胞から得たモノ
クローナル抗体を結合してなる吸着剤を使用して、ヒト
・トランス７エリ／を免疫特異的に高純度で効率よく製
造する方法に糎１する□ トランスフェリン（Ｔｆ）は、最初ウマ血清中よ多発見
されたが、ヒトの血清中やウサギ等の各種動物の血清中
にも存在する。Ｔｆけ主に肝臓で生合成され、その機能
はへモグロヒン等の分解で生じた鉄を骨すいゃ肝臓等の
再生組線へ運ぶことである。Ｔｆｐ化学的には鉄を含む
扼タンパク負であるが、動物の種類等によシー次構造や
扼組成に違いがある。ヒ）Ｔｆは分子ｌ約８万、糖含を
約６チであり、正常人の血清中に２〜３票ｇ　／　ｍｉ
含まれている。ヒ）Ｔｆは、１結合能を利用して、血液
納のへモクロマトーシス症における鉄の勿去゛剤として
使用され（特公昭５７−３５９７７号公報）、又ねＪｆ
Ｊｌ、　Ｉ、よう増ｌ゛剤としても用いられる（％［Ｊ
ｌｉ　５Ｑ−２５７２１号公報）。さらに腫瘍撮影剤の
キギリアー（特開昭４９−４２８２５号公報）やＴｆ定
１時の高純度の標準物質（特開昭５２−１２５６２３号
公報）として使用されるほか、鉄のキャリアーとして栄
養剤への利用が考えられる。

従来、Ｔｆの製法としては、エタノール分画法［Ｂ、７
１０．Ａｌ４ｙｚｃ４ムｎ、　Ｊ、　Ａ−＋　ＣＬ＜ｍ
、１ｓＡｅｒｒ、、　７４．２６４９（１９５２）：）
、　　イオン交換、硫安分画及びゲルｆ過を組み合せた
方法（Ｗ、　Ｒ，Ｊ％　ｅ　ｐ等、Ｔ上Ｌ　ｏ　４　Ｃ
Ｌｃｍ。

２４２、２５０７　（１９６７）及びＦ、Ｊｈ、　ａｔ
ｙＪ−＜　等、（ＺＪＬＬｎ、　ＣＬＬｍ、。

Ａｃｔａ、　３２．２４３　（１９７１）　）　’等が
知られテオリ、また、電気泳動による各種の分画法〔工
、ｙｔＬ等、生物物理化学２４　（４）　２９５　（１
９８０）　）も知られているが、これらはいずれも操作
が煩雑であり、或は得られるＴｆの純度が高くなく、或
は処理し得る量が限られる等の欠点があった。

本発明者らは、抗体結合吸着カラムを使用してヒト血ｆ
ｆｉ’％から免疫特異的にヒトＴｆを得る方法について
検討を行ったところ、Ｔｆに対するモノクローナル抗体
を結合させた吸着カラム健使用・すると高純度のＴ’ｆ
を効率よく取得できること、そして、かかるモノクロー
ナル抗体か特定２種の細胞間の細胞融合により作成され
たハイブリドーマ細胞から安定的に得られることを知見
し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は高純度のヒ）Ｔｆの製法であって、
ヒ）Ｔｆで免疫したマウスの牌臓細胞とミエローマ細胞
とを細胞融合して作成したハイブリドーマ細胞から得た
モノクローナル抗ヒトＴｆ抗体を結合してなる吸着剤に
、ヒトの血清又は血しようを接触させてヒ）Ｔｆを成鳥
させ、次いで脱着させることを特徴とするものである。

本発明によれば、抗原−抗体反応を利用するところから
、操作が簡単で１回の吸脱着で高紹腋のヒトＴｆ−を取
得することができる。そして、本発明で使用される抗体
結合吸着剤については、抗体がヒ）Ｔｆに対するモノク
ローナル抗体であるから抗体の性質は均一であり、また
、このモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細
胞が凍結保存可能であるため、抗体の必をなとき保存細
胞を融解し培養後、マウス腹腔内へ移植すれば抗体を永
続的に入手できる。このように抗体の入手は容易かつ安
定的である。

次に、本発明の構成について詳細に述べる。

本発明において＼イブリドーマ細胞はヒ）Ｔｆで免疫し
たマウスの牌臓細胞とミエローマ細胞（骨ずい腫細胞）
とを細胞融合して作成される０細胞融合は、同種の動物
の細胞間で行わせるのが好ましいから、マウスの牌臓細
胞とマウスのミエローマ細胞との間、で行わせるのがよ
い。

ミエローマ細胞は悪性腫瘍の１種であって増殖性に富む
細胞である。

マウスに対する免疫（抗原抗体反応）はヒトＴｆを抗原
として使用しこれをマウスに投与して行う。抗原のヒ）
Ｔｆは市販品（例えばシグマ社製Ｔ４５１５）を使用す
ることができる。

マウスへの抗原投与は通常腹腔内注射により行わ・れ、
免疫を充分に進めるため、例えば２週間の間隔をあけて
数回注射をする。注射液は、ヒ）Ｔｆの粉末を例えばＰ
ＢＳと呼はれる燐酸塩緩衝食塩水に溶解しこれに７０イ
ンドのアジュバントｔ−混合してエマルジョンを形成さ
せて調製する。

このようにして免疫したマウスから、免疫処理終了後か
ら約３日ひ・にＩＩＩＩ？を摘出し、との牌臓細胞（主
にＢ細胞）と、マウスのミエローマ細胞との間で細胞融
合を行わせる。マウスのミエローマ細胞は市販のもの例
えは、（Ｐ：（−ＮＳＩ’／１−Ａｇ４−１．Ｐ３−Ｘ
６３−Ａｇ８゜Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８　６５３などを培
養して増殖させたものを使用することができる０細胞融
合は、公知の技法に従って行われる０通常、ペニシリン
（１００μｖｍｅ）及ヒス）Ｌ／プトマイシ・／（ＩＯ
θ単位／　ｍｌ　）にさらに２ｍＭグｋｌミーン、１ｍ
Ｍピルビン酸を添加し７’ＣＲＰＭ工１６４０合成培養
液（以下ＲＰＭ工１６４０と記す。）と、牛胎児血清（
Ｆ　ｃ　ｓ）との混合液中で前記牌臓組織を細断し単細
胞化して細胞を充分に分散し遠心分離で上清を取り除い
た後、牌臓細胞をＲＰＭ工１６４０に分散し、これに前
記ミエローマ細胞を混合し、遠心後、上清を除去した混
合細胞に対し、細胞融合剤のポリエチレングリコール１
５０００５０％溶液を添加して細胞融合させる。

かくして作成された融合細胞の中から雑種の、いわゆる
ハイブリドーマ細胞をＨＡＴ選択によって選び出す。

ここにＨＡＴ選択とは、Ｐｓ臓細胞とミエローマ細胞と
の融合によシ生じた融合細胞をＨＡＴ（ヒボキサンチン
゛−アミノプテリン−チミジン）培地での培養結果から
選択的に取シ出すことであり、その原理は次のとおシで
ある。すなわち、ここで使用したマウスのミエローマ細
胞ハ、ヒボキサンチン　ホスホリボシル　トランスフェ
ラーゼ欠損株であるためＤＮＡ合成のサルベージ回路が
ない。したがって、ＨＡＴ選択培地中、ではアミノプテ
リンによ、！ｌｌＤＮＡ合成のドウノボ（ｄ４？Ｌヶ１
Ｐσ）回路も阻害され生育ができない。

−力、牌廣細胞はＤｈｌＡ合成のサルベージ回路を有す
るが、試欺管内で長期間にわたシ分裂、増殖することが
できない。ＨＡＴ選択培地で生育してくる細胞は、ミエ
ローマ細胞が牌臓細胞と融合してミエローマ細胞のサル
ベージ回路が門復した株・つまシＮｌｌ！細胞とミー・
−〜細胞とのハイプリドーマ細胞のみである。　　　。

ＨＡＴ選択はマイクロタイタープレートを使用して行う
ことができる。例えば、同種及び雑種の融合細胞を９６
大マイクロタイタープレート上にまいてＨＡＴ培養液で
培養を行い、約２週間如ハイブリドーマ細胞が死滅しな
いで増殖している穴を確認しハイプリドーマを得る。

ハイプリドーマの主１が認められた穴の数に対応して、
例えば、マウス１匹当り約７０種奔゛の細胞が得られ、
マウス３匹分でね２０５種類のハイプリドーマが得られ
る。

次に、かくして選ばれたハイプリドーマがヒ）Ｔｆと特
異的に結合するモノクローナル抗体を一産生するか否か
をソリッドフェーズ法にて検定する。

ここにソリッドフェーズ法とは、ポリビニルクロライド
製のマイクロプレートの穴（ウェル）内、に抗原タンパ
ク負を結合し、ハイフリドーマ培養土清を添加して、抗
原タンパク質とこれに対する特異抗体とを結合させる。

次に　１２５　■や酵素等で標識した２次抗体を添加し
て特異抗体に結合させた後Ｋ、１２５■や酵素活性等を
測定して、目的とする特異抗体の産生を検定する方法で
ある。

例えは、前記の２０５種類のハイプリドーマについてい
えば、これからノリノドフェーズ法によシ抗体産生ハイ
プリドーマとして１３秒類が選ばれ、そのうち特に安定
なモノクローナル抗体産生細胞として８釉類が得られる
。

次に、抗体のモノクローン化のため限界希釈法によりク
ローニングを行う。上記で有られた安定に抗体を生産す
るハイプリドーマ細胞とマウス胸８’Ｌ細胞とをＲＰ’
Ｍ工１６４０及びＦｏｅの混合液中で培養し、一定期間
抜増殖したハイ１ブリドーマ細胞についてソリッドフェ
ーズ法により抗ヒ）Ｔｆ抗体の生産能を調べて、モノク
ローナル抗体産生細胞を得る。

ここに得られたモノクローナル抗体産生細胞によりて、
ヒ）Ｔｆと特異的に結合する抗体を産生させる。このた
め例えばハイプリドーマをマウス腹腔内に移植して腹水
を発生させ、腹水から公知の方法、例えば硫安分画法に
よシ抗体タンパク負（ＩｇＧ）を得る。このものは主と
シテ免疫グロブリンＧで、すなわち目的のモノクローナ
ル抗体である。使用細胞はいずれも選出樹立されたもの
であるから、モノクローナル抗体が安定的に産生される
。また細胞は凍結保存が可能であるので、必！ｉ！に応
じて融解し、マウスの腹腔内に移植すれは、心像な抗体
を随時永続的に供給することができる。

このモノクローナル抗体を吸着剤に結合させる。好まし
くは、この抗体結合吸着剤をカラムに充填して使用す−
る。吸着剤としては例えばアフィゲル（バイオラッド社
製）、セファデクス（ファルマシア社製）が使用される
。

例えば、アフィゲル１０　（バイオランド社製）をガラ
スフィルター上で氷水冷却下イソプロパツールで洗浄し
、さらに氷水で洗浄し、ゲルを回収する。前記で得た抗
体を含む溶液と、このゲルとを等量混合し、結合反応を
行わせる。反応後、ゲルを遠心回収し洗浄後、未反応物
を除去し、精製した抗体結合ゲルを得る。

以上のようにして作った抗体結合吸着剤を使用して、こ
れにヒトの血清又は血しょうを接触させてヒ）Ｔｆを吸
着させ次いで脱着（宕出）させて゛高純度のヒ）Ｔｆを
取得する。

吸脱着は通常のクロマト技法に従って行う。

例えば、抗体結合ゲルを充填したカラムをカラム（床、
容積）の６倍量のＰＢＳで平衡化した後カラムの６倍量
の０．２　Ｍ酢酸と０．１５ＭＮａ０ｌとの瓜合液で洗
浄後、さらにカラムの６倍量のＰＢＳで洗浄し平衡化を
行う。次にヒト血しよう或は血清サンプルを流した後、
カラム（床簀＆）のｌθ０倍量ＰＢＳで洗浄後、４倍量
の０、３　Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＬと００１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７）及び４倍量の０．１５ＭＮａ０ｔで洗浄後、０
２Ｍ酢酸と０．１５　Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＬの混合液で、吸
着したトランスフェリンを溶出する。

使用した吸着カラムは、再生させて１０回程度再使用す
ることができる。再生は、例メ、ケ酢酸と食塩水との混
合液を鰺１すことにより行われる。

以上のごとき吸着法により目的のヒ）Ｔｆを特異的に高
純度で１回の吸脱着操作で取得することができる０ と）Ｔｆの純度は電気法ｗＪＶｃより検定される。

テンシトメトリーにより純度検定がされる。

゛本発明を実施例によって説明する。

実施例　１ 〔マウスの免疫〕 市販のヒ）　Ｔ　ｆ’　（シグマ社製）を抗原として使
用し、３匹のマウス（Ｂ　Ａ　Ｌ　ｆ３１０マウス）Ｋ
対し、次のとおシ３回の免疫、を行りた。

詑１回：ＰＢＳ（！Ｉン酸塩麹衝生理食増、水）中にヒ
ト’ｒ　ｆ　ｆ　３１１７　／　ｘｉ　ｆ　ｋ　ｈ　シ
、コｈＫフロイント完全アジーバンドを等ｉ 混合し、得たエマルジョンをマウス１ 匹当り０．２　ｍｌ　（ヒトＴｆ３Ｃ）Ｏμｔ）腹腔内
注射で投与した。

第２０：第１回免疫の２週間拶にＰＢＳ中にヒ）Ｔｆを
２１１ｇ／　ｍｌで浴解し、これに７０イ／ト完全アジ
−バンドを等を混治 し、得たエヤルジョンをマウス１匹当 り　０．２ｍ／（ヒ　ト　Ｔｆ２００　　μ　９）　　
　腹腔内注射で投与した。

釦３回：第２回免疫の２週間後にＰＢＳ中にヒ）Ｔｆを
１即／＃Ｉ／でｆｆ−座した液をマウスＩＮ！４当！ｌ
）　０．．１　ｄ　（ヒトＴｆｌＯＯμ９）腹腔内注射
した。

〔細胞融合〕

前記免疫処理終了から３日後に、免疫マウスの牌臓を無
釉的に摘出し、合成培養液’ＲＰ　Ｍ　１１１）４０　
　（ペニシリン１００μｆ／ｍｌ　及びストレプトマイ
シン１００単位／＃Ｌ／含有）と１５チ牛脂児血清（Ｆ
’Ｏ８）との混合液で洗浄後、該混合液中で牌豚組組を
ハサミで細陶１して、ピペッティングをｂい、単゛細胞
化して、咳混合液で＼　　　　　　。

２回洗浄した後、単細胞化した細胞をＲＰＭ工１工種６
４０液散した。細胞紗はマウス１匹当シ２Ｘ１０”個で
あった。

別に市販のマウスのミエローマ細１ｆｌｉｌ（Ｐ３−Ｎ
ＳＩ／１−Ａｇ３−１）を前記ＲＰＭ工１６４Ｃ及びＦ
Ｃ８の混合液中で培養し、増殖した細胞をＲＰＭ１１６
４０液で洗浄した。細ＩＩＩ！数は、１．５ＸｌＯ’個
であった。

次に、前記で調製した免疫マウス牌臓細胞・（マウス１
匹分、２Ｘ１０”個）とマウスミエローマ細胞（ＩＸＩ
Ｏ８個）とをＲＰＭ工１工種６４０散し、混合したのち
、遠心し、上清を除去した。混合細胞をポリエチレング
リコール１５００の５０チ溶液（細胞融合剤）中で細胞
融合させた後、融合細胞群をＨＴ（ヒボキサンチン−チ
ミジン）培養液に混合し、混合液を３枚の９６穴マイク
ロタ９ターグレートにまいて、２日目以降、ＨＡＴ培地
を添加し、各人の中で２週間培養して、ＨＡＴ選択を行
った。増残したノ・イブリドーマ細胞を７５穴において
＠！認した。

さらに同様な操作を残り２匹のマウスについて行い、ハ
イプリルドーマの増殖した穴の数に対応して、３匹分で
合計２０５１５１１４１のハイプリドーマを得た。

〔抗体産生細胞の選択〕

前記で得た２０５秒類のハイプリドーマより、特定の細
胞、すなわち、ヒ）ＴｆＫ％異的に結合する抗体ｔ−産
生ずるハイプリドーマをａび出すために、ビオチン−ア
ビジンシステムを用いるソリッドフェーズ法によりスク
リーニングを行った。その結果、目的に適合したものと
して１３種類の細胞が選出され、そのうち喝に８＆類に
おいて安定な抗体産生を行なうことを認めた。ビオチン
−アビジンシステムによるソリッドアニーズ法のスクリ
ーニングは下記のとおシである。免疫に用いたヒトＴｆ
を０．０２　ｍｌ　７　ｍＡ！、！：なるｊうＫｐＢｓ
に溶解し、ポリビニルクロライド製のマイクロタイター
プレートの各穴に５０μｔ’（１μＩ／穴）ずつ添加し
、常゛温で１時間放置後、５℃で１晩おき、各穴中に、
ヒトＴｆを結合した。

次に洗浄液〔１ｑＩＤウシ血清アルブミン（ＢｓＡ）含
有ＰＢＳ　）で３回洗浄後、洗浄液を添加した状態で１
時間放置することにょシ、穴をＢＳＡでコートしたのち
、洗浄液で洗浄した。次にハイプリドーマ培養上清で５
ｏμｔすっ各穴に添加し、１時間室温放置することＫよ
り、抗原−抗体の結合を行った。洗浄液で３回洗浄後、
ビオチニル化した抗マウスエｇＧ抗体（２次抗体）溶液
（１，２５ａｌｌ／　ｄ　、洗浄液中）ヲ５（ｌμｔず
つ各大忙添加し、１時間室温に放置するととＫよシ、２
次抗体を結合した。洗浄液で洗浄後、アビジン耐液（５
０μＩ／ＩＩＩ、洗浄液中）を５゜μＬずつ、各穴に添
加し、１ｏ分間室温放偽することＫよシ、ビオチン−ア
ビジンの結合を行った。洗浄液で３回洗浄後、ビオチニ
ル化した西洋ワサビ−パーオキシダーゼ溶ｉ　（−１０
０μ７７／　ｒｎ、ｌ　、洗浄液中）５０μｔを各穴に
添加し、１０分間放置後、ＰＢＳで５回洗浄後、パーオ
キシダーゼ反応液（５０ｍＭリン酸カリ緩衝液。

ＰＨ７，０，０，６チチラミン、０．０１％八〇へ）を
加え、３０分間室温で反応後、各穴の螢光をみることＫ
より検出した。

〔クローニング〕

抗体のモノクローン化のため、限界希釈法によシ、クロ
ーニングを行りた０上記で得られた安定に抗体を生産す
る８種類のハイプリドーマより１株を選び細胞５０個と
４週令ＢＡＬＢ／Ｃマウス胸１！細胞（常法によりＦＡ
　ＩＩ　）　’　１０８個をハ ＲＰｊＦ工１６４０及びＦｅ２の混合液１０Ｉｎ／に均
一に分散し、１枚の９６穴マイクロタイタープレートに
まいて（１００μｔ／穴）、５日目相 及び１２日１にそれぞれＲＰａ１１６４０及びｙｅｓの
混合液管添加し、２週間後増殖したハイプリドーマ細胞
を２７穴において見出した。

この２７穴のハイブリドーマについて、ソリ。

ドアーズ法にょシ、抗ヒ）Ｔｆ抗体の生産能を調べた結
果、２７糧類全部について生産能のあることが確認され
た。

同様にして、残シフ種類のハイブリドーマについても、
限界希釈法によるクローニングを行い、モノクローナル
抗体産生細胞を得た。

〔抗体の産生〕

前記の如くして得られた抗ヒトＴｆモノクローナル抗体
産生ハイプリドーマよシ任意に２Ｍｉ類（Ｔｆ０５０２
．Ｔｆ１２０３のハイブリドーマ）を選出し、抗体の産
生を行わせた。すなわち、’Ｔｆ０５０２．Ｔｆ１２０
３１７）ハイブリドーマおのおのについて、２０匹の１
ウスに対し、細胞をマウス１匹’ｋＪ）５ｘ１０６個腹
腔内に注射して抗体を産生させた後、１０匹のマウスか
ら腹水を採取し、これを４５チ飽和硫安水溶液で硫安分
画に付し、抗体としてＩｇＧ画分１５１１１？　（Ｔ’
ｆ０５０２）、１３ｏＩＩｇ（Ｔｆ１２０’３）、をそ
れぞれ得た。

〔抗体結合吸着カラム作成〕

アフィゲル１０（バイオランド社＃）をガラスフィルタ
ー上で氷水冷却下インフロパノールで洗浄し、さらに氷
水で３回洗浄し、ゲルを回収した。前記で得た各抗体を
含む溶液と、このゲル１５ｍ／とを混合し、４℃で５時
間攪拌しながら結合反応を行わせた。反応後、ゲルを遠
心回収した。この（のを０．１ＭＮａＨＯＯ３と０、１
５　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃｔの混合液で２回洗浄後、０１Ｍエ
タノールアミン塩酸塩（ｐＨ８）と室温で１、時間よく
混合して未反応物を除去し、和製した抗体結合ゲルを得
た。このゲルをカラム（２，４儒×３３儂、床容叛１５
ｄ）に充填して吸着カラム２種（Ｔｆ０５０２゜Ｔｆ１
２０３のカラム）を作成した。

〔ヒトＴｆの取得〕

ヒト血しよう又はヒト血清よりそれぞれ下記のようにし
てヒトＴ　ｆｔｏた。

（Ａ）　　ヒト血しようよりのＴｆの和製前記で作成し
た吸着カラム（Ｔ　ｆｏ　ｓ　Ｏ２）Ｋ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　
９０　ｍｌ　ヲ’６０　ｒｔｒｌ　／　ＪＬ　ルテ流１
．、平Ｔｈ化し、次いで０．２　Ｍ酢酸と０．１５　Ｍ
　Ｎ　ａ　Ｏｔとの混合液９９ｍｊを同じ流速で流し、
洗浄した後、さらにＰＢＥ１９０１１／を同様に流し平
衡化した。

ヒト血しようは、とト廂液をヘパリン採血ののち、５℃
で３５００ｒｐｍ１５分間遠心し、血球を沈澱分罰し、
上清として血しようを得た。

型車しょう１０−を等量のＰＢＳで希釈した。重液を前
記で処理した吸着カラムに対し、３ｏＷＬｌ／Ｊルの流
速で通した後１６０ゴＰＢＳを６０１１１７Ｊ４で通し
洗浄後、０．３’Ｍ　Ｎ　ａａｔと０．　ＯＩ　Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７）６０＊／及びＯ，”ｌ　５ＭＮａ　
Ｏ４６０ｍｌで洗浄後、０２Ｍ２Ｍ酢酸、　１５　Ｍ　
Ｎ　ａ　Ｏｔとの混合液で溶出した。この廠来均−なＴ
ｆとして２２．８■のタンパク質を得た。

なお、本吸着カラムは、（溶出後）０．２Ｍ酢酸と０．
１５ＭＮａＣｔの混合液６’０ｙｎｌを流速６０　ａ／
　／　Ｌ　４で流しだ後、Ｐ　Ｂ　Ｓ　９０　ｔｎｔを
同様に流し、平衡化することにより再生することができ
、１０回以上の再使用が可能である。

（Ｂ）　　ヒト血清よシのＴｆの精製 ト血清５０１１１１を＃＆鬼カラムを通したところ、１
１５１１？のタンパクを得た。本タンパク質は電気泳動
的に均一であった。

特許出願人雪印乳業６式会社 代理人弁理士　土　　か　　三　　部

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　ヒト・トランスフェリンで免疫したマウスの
   牌臓細胞とミエローマ細胞とを細胞ｂ・合して作成した
   ハイプリドーマ−細胞から得たモノクローナル抗ヒト・
   トランスフェリン抗体を結合してなる吸着剤に１ヒトの
   血清又は血しようを接触させてヒト・トランスフェリン
   を吸着させ、次いで脱着させることを特徴とする高純度
   のヒト・トランスフェリンの製法。
2. （２）　　吸着剤をカラムに充填して使用する製許請求
   の範囲＋１１の製法。