JPS59173094A - デオキシリボ核酸の分離方法 - Google Patents

デオキシリボ核酸の分離方法

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JPS59173094A
JPS59173094A JP59044145A JP4414584A JPS59173094A JP S59173094 A JPS59173094 A JP S59173094A JP 59044145 A JP59044145 A JP 59044145A JP 4414584 A JP4414584 A JP 4414584A JP S59173094 A JPS59173094 A JP S59173094A
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JP
Japan
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rna
separation
acid
dna
deoxyribonucleic acid
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JP59044145A
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ラインホルト・ケラ−
メルテン・シユリングマン
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Hoechst AG
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Hoechst AG
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • B01D61/145—Ultrafiltration
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物細胞の集塊から人栄養用に蛋白質を得る場合には
大部分の核酸を除去することが必要である。これは有利
には西ドイツ国特許第２．６３３．６＋Ｓ６号（米国特
許第４，２０６，２４３号）明細書に記載の方法により
実施されるが、これは最初極性溶媒好ましくはメタノー
ルおよびアンモニアを含有する抽出混合物で脂質を除去
し、それから水で核酸を抽出することを包含する。これ
ら組接酸抽出物はリボ核酸（以下ｒ　ＲＮＡ　ｊと略記
）の他にデオキシリボ核酸（以下ｒ　ＤＮＡ　Ｊと略記
）を含有している。
５′−リボヌクレオタイドは食品添加物および医薬の製
造の出発材料として使用されている。
ＲＮＡの酵素氷解によるそれらの製造は開示されている
。しかしこの目的に使用される酵素、５′−ホスホジェ
ステラーゼはＲＮＡを加水分解するのみならず、同時に
ＤＮＡも加水分解してその結果所望の５′−リボヌクレ
オタイドの他に５′−デオキシリボヌクレオタイドもま
た副生成物として生成される。これら副生成物を５′−
リボヌクレオタイドから分離することはできるがそれは
非常な困難さを伴う。それ故に純粋なＲＮＡの製造法は
すでに多く開示されている。これらの方法は特願昭５４
−２０，４９３号明細書記載のように加熱およびそれに
続く酸処理によるＲＮＡの選択的製造を包含する。特願
昭５４−５５，７９１号明細書の方法においてはＲＮＡ
の酸沈殿は二価陽イオンの存在下に実施される。すなわ
ちこの方法においてはＤＮＡは熱および酸処理により分
解される。更に、かなりの比率のＲＮＡもまたこの工程
で失われる。
５′−リボヌクレオタイドの製法はすでに提案されてい
るが、この方法は重合体担体上に固定させた５′−ホス
ホジェステラーゼを使用してＲＮＡを含有する組接酸溶
液を選択的に加水分解させ、そしてこの氷解物から既知
の精製および分離法（西ドイツ国特許公開番号第３．１
３６．９４０号明細書参照）によって未変化のＤＮＡお
よび５′−リボヌクレオタイドを単離することを包含す
る。
組接酸溶液中におけるＲＮＡはこの溶液を膜分離工程に
かけることによりＤＮＡから分離させうろことが発見さ
れた。この方法においては比較的高い分子量のＤＮＡと
比較的低い分子量のＲＮＡとの間の分子量差が利用され
る。膜の排除限界は分離させるべき核酸の既知の寸たは
測定された分子量により選ばれる。
膜分離法は一般によく知られており、そして特に生物工
学においてはそうである（［ｃｈｅｍｔｅ−Ｔｅｃｈｎ
ｉｋＪ第１１巻第８１３〜８１９頁（１９８２）参照〕
。プレート、チューブ、カビラリ−チューブ、巻いた膜
および特に中空繊維装置での限外濾過が本発明による方
法にとっては好ましい。
使用される好ましい出発物質は細菌からの組接酸であり
、その中のＲＮＡ　／　ＤＮＡ比は通常約４：１である
。ＤＮＡが全くまたは無視しうる程度にしか分解されて
いないすなわちＤＮＡとＲＮＡ０間の自然の分子量差が
大部分保持されているような組接酸溶液を使用すること
が重要である。
西ドイツ国特許第２．６３３．６６６号明細書開示の方
法もまたこの点に関しては好都合である。
本発明により得られる透過物は既知の方法、例えば酵素
的に分解させて５′−リボヌクレオタイドを生成させる
ことができる。残留物を更に同一の方法で処理して５′
−デオキシリボヌクレオタイドを生成させることができ
るがこれは例えば遺伝子工学において広範な種々の使用
を有している。本発明は次の例においてより詳細に説明
されている。
例　　１ 米国特許第４，１６６．００４号明細書の例２で得ら　
５− れｆＣｌｌ、２重量％の核酸含量および２〜４重量％の
残存水分含量を有する細菌集塊を１６０℃の気温で３０
分流動床中で処理したが、その際生成物温度・は１．２
０℃で１０分間保持された。次いで米国特許第４．２０
Ｓ、２４３号明細書の例１によって、この処理された細
胞集塊をメタノール性アンモニアで抽出し、メタノール
で洗浄して真空下に４０℃で５時間乾燥させた。
この乾燥細胞集塊を重量で１０倍量の水に懸濁させそし
て攪拌により均質化させた。５５℃に温度を上昇させた
後、更に２０分間攪拌を続け、次いで懸濁液ｆ、５０℃
に冷却しそして遠心分離によって固体と液体相に分離し
た。得られた沈降物を再び同一量の水と混合しそして２
０℃で１０分攪拌した。次いで遠心分離をくりかえしそ
して液相を合した。それらは１２当り９？の核酸を含有
しておりそのＲＮＡ　／　ＤＮＡ比は４６− ：１であった。
この粗板酸溶液１００λを深い濾過媒体を通して濾過し
て清澄化させ、そしてこのろ液を中空繊維限外濾過装置
（アミコンＤｏ　５０］ＩＣＭ中空繊維カートリッジ、
分子量分離限界１ｏｏ、ｏｏｏ）に通す。これはこの粗
板酸溶液を１０℃に濃縮する。そしてそれを次いで１０
ぶの脱イオン水によるダイアフィルトレージョン（ｄｉ
ａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に付する。
このようにして得られた残留物は１チ以下のＲＮＡ混入
物を有するＤＮＡを含有しており、そして透過物はＤＮ
Ａ混入のないＲＮＡを含有している。
ＤＮＡとＲＮＡを単離するためには残留物および透過物
をそれぞれ５℃まで冷却し、そしてこの溶液のｐＨを塩
酸で２．０に調整する。沈殿したＤＮＡおよびＲＮＡは
遠心分離により除去しそして乾燥させる。
例　　２ 出発粗核酸溶液は米国特許第４，２０６，２４３号明細
書の例８によって得られた。しかしその中の核酸は水の
みで抽出された。この粗板酸溶液を１込当り３０２核酸
含量にまで濃縮させる。このＲＮＡ　／　ＤＮＡ比は３
：１であった。
との粗板酸溶液５０℃を予め濾過し、次いで例１記載の
ような限外濾過にかけた。５ｆ１．に濃縮された残留物
を５２の脱イオン水を使用して透析させた。このように
洗浄した残留物を５℃に冷却後そしてｐＨを２．０に調
整することによってＤＮＡを沈殿させ、そして単離させ
た。同様にして、透過物からＲＮＡが得られた。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）組接酸溶液を膜分離法に付してデオキシリボ核酸を
    残留させ、そしてリボ核酸は透過させることからなる組
    接酸溶液中のリボ核酸からデオキシリボ核酸を分離する
    方法。 ２）分離が中空繊維膜を使用する限外沖過として実施さ
    れる、前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）１００．ＯＤＤの分子量分離限界を有する膜が使用
    される、前記特許請求の範囲第１または２項いずれか記
    載の方法。
JP59044145A 1983-03-12 1984-03-09 デオキシリボ核酸の分離方法 Pending JPS59173094A (ja)

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DE33089329 1983-03-12
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