JPS5920358B2 - カスガマイシンの高収量製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は醗酵法によるカスガマイシン改良製造法に関し
、詳しく言えば通気攪拌液体培養法、特にタンク醗酵槽
中の通気攪拌液体培養法でカスがマイシン生産菌を培養
してカスガマイシンを高収率で製造する方法において、
高好気条件（すなわち高い通気量）下で培養を実施しか
つ特定の時期に水の添加を行うことによりカスがマイシ
ンの生産を促進させるカスがマイシン醗酵製造法に関す
る。

カスがマイシンは本発明者のうち悔涙等によって発見さ
れたアミノ配糖体抗生物質の一種であって、下記の化学
構造を有し 緑膿菌に対し強い抗菌作用を有するので人の疾病の治療
に使用が見込ま札また、稲いもち病の病原菌であるピリ
クラリア・オリゼに対して抗菌作用を有するので、いも
ち病防除の農薬として広く使用されているものである。

抗生物質力スガマイシンの製造法については既に本出願
人の出願にか＼る特公昭４１−２１７５７号及び特公昭
４７−１８３３号公報に詳細に記載されているが、これ
等の方法においては、炭素源トシて、グルコース、マル
トース、澱粉糖化液、等の糖質原料を使用しており、こ
れら公報に記載された油脂は実際には消泡剤として使用
されていた。

しかし、上記公報に示された方法は培地中に蓄積される
カスガマイシンの量（いわゆる力価）が低いものであっ
た。

一般に、抗生物質の工業的生産において大切なのは培地
中に用いられる栄養源物質の品質が一定しており、しか
も廉価で安定的に供給されること、また培地中に生産、
蓄積される抗生物質の量（いわゆる力価）を増大させる
ことが必要とされている。

また、培地中の抗生物質の量（力価）が一定以上の濃度
に達しないと、その採取、精製、結晶化のため余分の操
作が必要となり、またロスが生じ、結局は抗生物質の生
産コストが異常に増大することになる。

カスガマイシンの醗酵製造において、最初はグルコース
を炭素源としてカスガマイシン生産菌を培養する方法か
ら出発した。

グルコースを炭素源とした場合、カスガマイシンの生産
力価の向上を狙って培地中のグルコース濃度を上昇させ
ると、成る濃度以上のグルコースはカスガマイシンの生
産力価にむしろ悪影響を及ぼすことが判明した。

カスガマイシン生産に最も適切と考えられたマルトース
を炭素源とした場合にも、培地中のマルトース濃度が成
る限度、例えば６〜８係以上の濃度になると、カスガマ
イシンの生産力価は急激に低下することが認められた。

更に６〜８係の濃度で用いた炭素源としてのマルトース
と組合わせる窒素源の種類及び濃度を種々選定して、窒
素源として最も良い大豆粉を用いた場合に、大豆粉の濃
度がおよそ５係であるときにカスガマイシン生産力価は
低い水準で頭打ちになることが判明した。

また、マルトース含量が高くグルコース含量の低い澱粉
糖化液を炭素源として使用することが試みられたが、カ
スガマイシンの生産力価を、カスガマイシン製造の高効
率化及び採取、精製操作の単純化を含めて工業上竿まれ
る１万ガンマ／Ｗｌｌの値より高かく上げることは出来
なかった。

そこで、糖質系炭素源としてマルトースを用い、これに
油脂類を副炭素源として併用して培地濃厚化の手法でカ
スガマイシンの生産力価の向上を試みたが、所期の成果
を挙げられなかった。

この糖質炭素源と油脂系炭素源とを併用した場合に、カ
スがマイシン生産菌は培地中で増殖を起こす際に、資化
し易い糖質系炭素源を栄養素としてまず摂取する性質を
有するため、培地中の糖質炭素源を先づ消費し、油脂類
はほんの僅少しか資化されていないことが判明した。

その後、カスガマイシンの生産力価の向上を求めて、使
用微生物の馴養や諸条件の検討、その他更に有利な炭素
源の検索などの研究が進められたが、本発明者は糖質系
炭素源の使用から全く離れ、糖質系炭素源を使用せずに
落花生豆の金粉をカスがマイシン生産菌の栄養源として
使用することを着想し、試験を行ったところ、培地中に
蓄積されたカスガマイシンの力価が飛躍的に向上するこ
とを発見した。

そして落花生粉の有効成分について調べ、糖質系炭素源
が共存しないと、油脂成分が培地中に存在する唯一の炭
素源として働き力スガマイシンの生産を著しく促進する
ことを見出した。

この知見を端緒にして各種の油脂類をカスガマイシン生
産の本培養培地に唯一の炭素源として存在させた場合の
培養条件を鋭意検討して一連の試験を行った。

唯一の炭素源としての油脂は植物又は動物性油脂並びに
油脂中の脂肪酸又は脂肪酸エステルが有効であることを
見出した。

そして更に油脂類を唯一の炭素源として含有する培地中
では窒素源として蛋白系のものが適するが無機態窒素源
は不適であることを見出した。

そこで、カスガマイシンの工業的規模での製造に適する
タンク醗酵槽内での通気攪拌液体培養法により蛋白系窒
素源と組合わせて油脂類を唯一の炭素源として含有する
培地を用いてカスガマイシン生産菌を培養する場合につ
いて、蛋白系窒素源濃度、油脂炭素源濃度、これらの濃
度比、通気量と培地中のカスガマイシンカ価、収量との
関連性を更に試験したところ、通気量を増大して高好気
条件とすることにより、培地に仕込む窒素源、炭素源の
単位量当りのカスガマイシン収量すなわち製造効率を増
大できることを見出し、さらに蛋白系窒素源濃度と油脂
炭素源濃度とは夫々に６重量係、６重量係とするのが培
地の単位容積中のカスガマイシンカ価及び製造効率を最
大にするのに最適であり、この場合に通気量は培養液の
酸素吸収速度係数（Ｋａ）値が２０Ｘ１０−６（Ｓ’モ
ル０２／−１分、気圧）に相当する値まで高める間はカ
スガマイシンカ価が通気量と比例的に増大することを認
めた。

すなわち、上記の手法による高好気条件下でのカスガマ
イシン製造に際しては、蛋白系窒素源濃度６重量係、唯
一炭素源としての油脂類濃度６重量％、酸素吸収速度係
数（Ｋｄ ） ２０ ＸＩ Ｏ”−６（２モル０２／ｍ
！、分、気圧）相当の通気量が最適培養条件であって、
この最適条件下では、カスガマイシンカ価について培養
中の最高値が１５０００ガンマ／ゴに達した実績を得ら
れることが認められた。

そして、上記の最適培養条件で用いた窒素源濃度値、炭
素源濃度値、通気量値以外のところで夫々の値を変動し
かつ種々組合わせて見ても、カスガマイシンカ価の最高
値は１５０００ガンマ／ｙｄを下回ることが実験結果か
ら認められた。

例えば、通気量を高好気条件、例えばＫｄ二２０Ｘ１０
−６１モル０２／鵡分、気圧の値で一定にしておき、し
かも窒素源濃度を７％ 、８ ％ ＋ ９ ％ 、 １
．０ ％と上昇させかつ炭素源濃度も比例的に７％、８
％、９％、１０％と上昇させる（窒素源濃度／炭素源濃
度比一定）と、あるいはこれらの窒素源濃度、炭素源濃
度で両者の比を変動させると、カスガマイシンカ価最高
値は１５０００ガンマ／ｒｒｄ２から低落して行くこと
が認めらへまた窒素源濃度、炭素源濃度の増大に応じる
ように通気量を酸素吸収係数（Ｋｄ）２５Ｘ１０−６（
ｆモル０２／ｍ！、分、気圧）に増大させてもカスガマ
イシンカ価最高値は１５０００ガンマ／ｍｌから低落す
ることが認められた。

他力、商業規模で実施されるカスがマイシンの工業生産
においては、設備投資の増大を避けるため醗酵槽の新建
造は出来るだけ避けられるべきであり、そして醗酵所要
時間及び操作費用（所要の消費エネルギー費用）等の経
費を同じに抑えながら、醗酵槽１本当りのカスガマイシ
ン収量を出来るだけ向上させたい製造効率向上の要請が
強いから、この点についてカスガマイシンの工業的製造
技術の改良を目ざして研究を続けた。

醗酵槽１本に仕込まれる初発培地容量には一定限界があ
る（醗酵中には発泡が起るので、醗酵槽の全容量の６０
〜７５係程度の量しか最初に仕込めない）から、醗酵槽
１本当りのカスガマイシン収量を上げるためには醗酵終
了時の培地中のカスガマイシンカ価を上げることが第一
に大切である。

そして、培地中カスガマイシンカ価の向上を計るには、
培地の濃厚化が考えられる。

そこで、培地中の初発の窒素源濃度、炭素源濃度を前述
の最適値、それぞれ６係から増大して７％、８％、９％
、１０％と上げたけれども、これらの場合に培地中に蓄
積されるカスガマイシンカ価の最高値も、醗酵槽１本当
りのカスガマイシンの収量もむしろ低下して終った。

それの主な原因としては、高好気条件を採用しているこ
と、すなわち高い通気量で空気を培地に通人することに
よる水の蒸散量が大きいので、培地液量が培養操作中に
次第に減り、その反面、濃厚化されである培地中の蛋白
系窒素源濃度、油脂炭素源濃度が急激に増し、これらの
結果として培地内でのカスガマイシン生産菌を囲む環境
が段々に変動させられることによりカスガマイシン生産
菌の生産活性が悪影響されることが考えられた。

そこで、水の蒸散による損失を補うために培養の種々の
段階で分割して又は一挙に水を培地に添加することを試
みたが、驚くべきことに、水添加を一挙に行い且つ水の
添加時期を培養中の菌体増殖の最盛期末期に選定した場
合にのみ醗酵槽１本当りのカスガマイシン収量を約３０
係以上、特に良い場合には約５０係も増大できる増収効
果が得ら札 しかもこの時期での水添加によるカスガマ
イシンの増収効果は、培地中の蛋白系窒素源の初発濃度
が８〜１０係（重量／容量）である場合であって且つ油
脂唯一炭素源の初発濃度が８〜２０係（重量／容量）で
ある場合にのみ得られることが知見された。

そして、カスガマイシン生産菌の通気攪拌液体培養では
最初から泡の発生が最も盛んであり、培養中の菌体増殖
の最盛期には発泡が次第におさまり、菌体の増殖と共に
培地液体の粘度が上昇するものであり、しかも菌体増殖
の最盛期の末期は、醗酵槽内で培地液体部分の上に生じ
た気泡層の当初の高さから下がり泡がおさまった時点す
なわち気泡層の高さが最小のはシ一定値となった時点か
ら５〜１０時間の期間に一致していることが認められた
。

さらに、醗酵槽１本当りのカスガマイシンの増収効果は
水の添加量によっても影響されることも見出された。

以上の知見に基ついて本発明は完成されたものである。

それ故、本発明の要旨とするところは、ストレプトミセ
ス属に属するカスがマイシン生産菌を通気攪拌培養して
カスガマイシンを醗酵製造する方法において、蛋白系窒
素源を８〜１０チ（重量／容量）の初発濃度で含有しか
つ唯一の炭素源として油脂類を８〜２０％（重量／容量
）の初発濃度で油脂類を含有する培地にて高好気条件下
でカスガマイシン生産菌を培養し、醗酵槽内で培地液体
部上に形成された気泡層が培養中に最大の高さに達して
から下り切った時から５時間〜１０時間の間に、培地の
初発液量の２０〜３０容量係に相当する水量の水を一挙
に添加して培養を続け、蓄積されたカスガマイシンを培
養物から公知の方法で採取することを特徴とする、カス
がマイシンの高啄量製造法にある。

なお、培地中の炭素換算濃度と窒素換算濃度との比、い
わゆるＣ／Ｎ比が８．４〜２１．１の範囲にあることが
好ましい。

以下、本発明の実施方法を詳細に説明する。

本発明に使用しうるカスガマイシン生産菌の例はストレ
プトミセス・カスガエンシス又はストレプトミセス・カ
スガスピナスであり、特に有利に使用し得る微生物とし
ては、公知のストレプトミセス・カスガエンシスＭ３３
８−Ｍ １ （５ｔｒｅ−ｐ ｔｏｍｙｃｅｓ Ｋａｓ
ｕｇａｅｎｓ ｉｓ ） ＡＴＣＣ１５７１４号及びス
トレプトミセス・カスガスピナスＭＡ３５０−Ｃ３（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｋａｓｕｇａｓｐｉ−ｎｕｓ
）ＡＴＣＣ２９８１５号（何れも米国、ＡＴＣＣから入
手可能であり、ＡＴＣＣ１５７１４号及びＡＴＣＣ２９
８１５号の菌株は米国、ＡＴＣＣが発行する所謂ＡＴＣ
Ｃカタログすなわち「カタログ・オブ・ストレインズ■
」１４版（１９８０年）７８頁（バクテリヤ）及び１５
版（１９８２年）２１６頁（バクテリヤ）に記載されて
いる」）が挙げられる。

また、上記２菌株と明らかに区別し得ない油脂類資化性
をもち力スガマイシンを生産する能力を有する全ての放
線菌種やこれらの各種変異株も本発明に包含される。

上記２菌株の微生物学的性状は、それぞれ特公昭４１−
第２１７５７号及び特公昭４７−第１８３３号公報に詳
細に記載されている。

本発明の培地組成について言えば、油脂類を唯一の炭素
源として含有し、本発明で使用できる油脂類は、動物性
の鯨油、魚油、牛脂、ラード、植物性の大豆油、ヒマワ
リ油、菜種油、椰子油、落花注油等の各種油脂類及び脂
肪酸エステル、特に脂肪酸アルキルエステルが挙げられ
る（但し、ヒマシ油は例外的に使用できない）。

これらの油脂類で特に有利に使用できるものとしては炭
素数１４以上の脂肪酸のグリセリルエステル又はアルキ
ルエステルを挙げることができる。

これら油脂類を生産培地中に存在する唯一の炭素源とし
て使用し、また窒素源として、蛋白系窒素源、例えば綿
実粉、落花生粉、大豆粉（いずれも脱脂した、又はして
いないものを含む）、乾燥酵母などを使用する。

更に、食塩、燐酸塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウ
ムなどの無機塩或いは金属等を必要に応じて使用できる
。

なお、綿実粉、落花生粉、大豆粉の如き植物粕で脱脂し
てないものを使用する場合には、その中の油脂分の量を
油脂炭素源の使用量に算入する。

培地に菌を接種する際は、菌の胞子懸濁液を接種しても
よく、また、前培養して菌体数を増加せしめた種菌液を
接種してもよいが、工業的規模で大型の醗酵槽にて醗酵
せしめるときは胞子の直接接種は好ましくない。

本発明においては、本培養に用いる生産培地は油脂を唯
一の炭素源とするのであるが、種菌の培養（前培養）に
は、必ずしも炭素源として油脂を使用する必要はなく、
通常の、放線菌を用いる抗生物質の製造の際に使用され
る前培養の培地、即ち、ゲルコール、マルトースを炭素
源とした培地を使用してもよい。

しかしながら、本発明においては、本培養に用いると同
様の油脂類を炭素源とする培地を前培養に用いて、使用
微生物を継代培養して馴養ないしは適応化せしめておく
と好ましい結果を得ることができる。

本発明においては培地中の炭素源濃度は、油脂類が水に
難溶であるという性質から、高濃度を使用することが出
来るという利点があげられる。

しかしながら極度の高濃度の油脂類を与えると、培地中
の水の含有量が相対的に低下するので油脂類に難溶の栄
養成分の量が相対的に少なくなると共に、醗酵終了後に
培地中に未利用の油脂類が残存することになるので経済
的に余り好ましくない。

その他の培養条件は通常の抗生物質生産の場合と同様で
、ｐＨは７．０附近、温度２５〜３５℃（最適２８〜３
０℃）、高好気条件下で６〜９日間の醗酵を行わせる。

なお、培養液酸素吸収速度係数（Ｋｄ）は２０Ｘ１０−
６乃至２５Ｘ１０−６（１モル（０□）／賦分、気圧）
の範囲であるのが良い。

水沫において水の添加時期は前述の通りであるが、通常
はカスがマイシン生産菌の菌体増殖値の最盛期末期は培
養開始後２４〜３６時間目である。

水の添加量は培地の初発液量の２０〜３０係相当量とし
て、水の添加により培地の初発液量又はこれよりや−多
くまで増容させるのがよい。

但しこの際の水の添加量は、使用醗酵槽の容量が一定で
あるから、自づから上限がある。

水の添加液量が少なすぎても、あるいは一挙に添加しな
いで数回に分けて加えても、所期の増収効果が得られな
いが、その理由は未だ十分に解明されていない。

醗酵は、培地中のカスがマイシンが最高値に達したとき
に終了され、培養培地から公知の採取方法により、培地
中に蓄積されたカスガマイシンを回収することが出来る
。

これら採取方法としては、イオン交換樹脂法、液体クロ
マトグラフ法、溶剤沈澱法、晶析法等が挙げられる。

次に本発明の完成の基礎になった技術的知見を得られた
実験データを実験例として次に示す。

実験例 １ 本例はカスガマイシン生産菌の通気攪拌液体培養に当り
培地中の蛋白系窒素源濃度、油脂唯一炭素源濃度、これ
らの濃度比、通気量がカスがマイシンカ価及びカスガマ
イシン収量、従って製造効率にどのように関係するかを
示す。

下記に示す組成ニー ＮａＣ１Ｏ，１％ に２ＨＰＯ４０，０５係 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５係 消泡剤 ０．０５％ の基礎培地に炭素源として大豆油、窒素源として大豆粉
を夫々第１表に示した量で添加した培地４５０７（ＩＪ
ットル）を調製し、加熱殺菌後、ストレプトマイセス・
カスガエンシス１９７ＳＳ株（ＡＴＣＣ１５７，１４）
の前培養液５１を添加し、６００を容の醗酵タンク内で
第１表に示した通気攪拌条件にて１０日間培養した。

醗酵液中のカスガマイシンカ価はビオアッセイ法にて検
定し、カスガマイシン収量およびカスガマイシン生産効
率指数を算出した。

上記の表の結果から、通気量が増大するほど、カスガマ
イシン生産効率指数が増大し、すなわち培地原料の単位
量当りのカスガマイシン収量が増大する一般的傾向があ
ることが認められ、また窒素源濃度６％、炭素源濃度６
％の際にはＫｄ値２身””’Ｘ１０−６乃至２５Ｘ１０
−６の範囲でカスガマイシン収量が他より秀れているこ
とが判る。

同様なことは、窒素源として綿実粉、落花生粉又は乾燥
酵母を用い、これに種々な油脂類を用いて実験しても認
められた。

実験例 ２ 本例はカスガマイシン生産菌の通気攪拌液体培養に当り
、培地中の蛋白系窒素源濃度、油脂唯一炭素源濃度を種
々変動した場合につき、菌の増殖期末期（気泡層の高さ
が最大値から下り、最小のはマ一定値になった時点から
５〜６時間経過した時期）に水を添加すると、カスガマ
イシンカ価最高値、カスガマイシン収量がどのように変
化するかを示す。

６００１容の醗酵タンクを用い実験例１と同様の方法（
但し、通気攪拌条件はＫｄ＝２０Ｘ１０−６とする）に
て培養を行い、菌の増殖期末期に水１００ｔを添加した
場合と、添加しなかった場合についてカスガマイシン収
量を比較し、結果を第２表に示した。

１２ 第２表の結果から、窒素源濃度が８〜１０％、炭素源濃
度が８〜２０係の場合に水の添加により、醗酵槽１回の
運転で醗酵所要時間が実質的に同じでカスガマイシン収
量が約３０％以上増収したが、上記の濃度範囲外でか増
収が殆んどないことが認められた。

特に最も良い場合として、窒素濃度９で炭素源濃度９〜
１５係の時（Ｃ／Ｎ比が９．５〜１５．８の範囲に相当
する時）には、水の添加によりカスガマイシン収量が約
５０係以上増収したことが認められる。

なお、この際、培地中の窒素源、炭素源濃度は夫々６．
０％の場合よりも濃厚化されているが、これに要する原
料費の増加は醗酵槽１回の運転に要する電気代及び人件
費に比べれば小さいから上記＊・のカスがマイシン増収
効果は工業的に顕著な利点である。

実験例 ３ 本例は実験例２について培養液の気泡層の高さは培養開
始後直ちに最大値となりしばらく最大値を維持した後に
高さが下降しはじめ、最少のはシ一定値にまで低下した
時の培養時間を基点として水１００ｔの添加時期を■そ
の時間、■５時間後、０１０時間後、■１５時間後に行
った場合の成績を示す。

結果は第３表に示したように、水の添加時期は泡立ち終
了後５〜１０時間経過した時期以外はカスがマイシン増
収効果が得られないことが判明される。

実験例 ４ 本例では、実験例２の場合と同じに培養した時に菌の増
殖最盛期末期の水の添加量を培地初発液量の１０〜３５
容量係の範囲内にして試験した時のカスがマイシンの収
量を調べた。

その結果は第４表にて示す。

第４表から、菌の増殖最盛期末期の水の添加量が培地初
発液量の２０〜３５容量係の範囲内でカスがマイシン増
収効果が得られることが明らかである。

但し水添加量を初発仕込量の３０％又は３５％とした場
合には、初発仕込量を実験例２（従って実験例１）の４
５０１とするならば、培養液が溢れ出るので、本実験例
では初発仕込液量は４４０を又は４２０ｔに減少させて
おいた。

しかしながら、通常の工業的実施で初発仕込量を常用の
値より減少させることは得策でないから、水の添加量は
実用的には２０〜３０％（容量）の範囲内で選択される
のが良い。

次に本発明の方法を実施例により説明するがこれに限定
されるものでない。

実施例 １ 斜面寒天培養したストレプトミセス・カスがエンシス１
９７ＳＳ菌の胞子から出発して、大豆油８％、大豆粉３
％、ＮａＣＡｏ、１％、に２ＨＰ０４０．０５係、Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２００，０５％の組成よりなる培地３Ｌで
フラスコ前培養を行い、これをＩＫＬ（キロリットル）
容醗酵槽中に用意した同様の培地５００Ｌに接種し、２
８℃で約２４時間培養してこれを第二段目の前培養とす
る。

本培養は犬ヴ油１０係、大豆粉９％、ＮａＣＡｏ、１％
。

Ｋ２ＨＰＯ４０，０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０
５係、カラリン０．０５％の組成を有する培地４５ＫＬ
を６０ＫＬ醗酵槽中に殺菌して準備しておき、これに前
記した第二段目の前培養液を移殖して、２８℃にて、Ｋ
ｄ＝２０ＸＩＣ）−６（ｆモル０□／ｒｎ１１分、気圧
）の条件にて通気攪拌する。

培養開始後泡立ちが低下してから７時間経過した時期に
水１０ ＫＬを添加し、培養を継続すると、培養２６５
時間でカスガマイシン生産歇は最高に到達した。

この醗酵終了液（４５ＫＬ、 カスガマイシンカ価１
６８００ガンマ／、ｄ）を酸性下扉熱処理し、珪藻土を
助剤として添加し、フィルタープレスで諷過する。

得られた泥液をイオン交換樹脂アンバーライトＸＥ−１
００に吸着後、０．２Ｎ−ＮａＯＨ水溶液で溶離し、中
和後、減圧濃縮し、噴霧乾燥して、粗粉末（カスがマイ
シン含量６１．２％）９００ Ｋ９を得た。

実施例 ２ 斜面寒天培養したストレプトミセス・カスガス上ナス４
Ｓ菌を用い、実施例１と同様の方法にて、粗粉末（カス
がマイシン含量５８．５％）８７０Ｋｐを得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ストレプトミセス属に属するカスガマイシン生産菌
   を通気攪拌培養してカスがマイシンを醗酵製造する方法
   において、蛋白系窒素源を８〜１０係（重量／容量）の
   初発濃度で含有しかつ唯一の炭素源として油脂類を８〜
   ２０係（重量／容量）の初発濃度で含有する培地にて高
   好気条件下でカスガマイシン生産菌を培養し、醗酵槽内
   で培地液体部上に形成された気泡層が培養中に最大の高
   さに達してから下り切った時から５時間〜１０時間の間
   に、初発液量の２０〜３０容量係に相当する水量の水を
   一挙に添加して培養を続け、蓄積されたカスガマイシン
   を培養物から公知の方法で採取することを特徴とする、
   カスガマイシンの高収量製造法。 ２ カスガマイシン生産菌がストレプトミセス・カスガ
   エンシスＭ３３８−Ｍｌ （ＡＴＣＣ１５７１４号）又
   はストレプトミセス・カスガスピナスＭＡ３５Ｃ）−Ｃ
   ３（ＡＴＣＣ２９８１５号）である特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ３ 油脂類が動物性又は植物性の油脂又は脂肪酸エステ
   ルである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 蛋白系窒素源が植物種子粕又は乾燥酵母である特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 植物種子粕が綿実粉、落花生粉又は大豆粉である特
   許請求の範囲第４項記載の方法。 ６ 高好気条件とは培養液の酸素吸収速度係数（Ｋｄ）
   が２０Ｘ１０ ’（Ｓ’モル０２／ｍｌ、分、気圧）
   乃至２５’Ｘ １０−６（１モル０□／ｍｌ、分、気圧
   ）の範囲である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７ 水の添加は培養開始後、２４〜３６時間目に行う特
   許請求の範囲第１項記載の方法。