JPS59224686A - 枯草菌変異株における二機能性プラスミドベクタ−の分子クロ−ニング、安定な形質転換枯草菌突然変異株およびその形質転換突然変異株の利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、常態では枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ）宿主によって分ＩＷ７ａ′９けや１−い三
機能性キメラベクターによる枯草菌の安定な形質転換に
関する。

本発明の一態様は、クローンゾールによってまたは太１
拗ｆｉ４　（Ｅｅｃｈｅｒｊ、ｃｈｉａ、　ｃｏｌｉ　
）内で増動した個体組候え三機能性プラスミドによって
安定な形質転換か可能な枯草ｕ弓矢然変異株の単に＋ｌ
に関する。

また本発明の佃の態様としては、安定な形質転換体をう
ろだめのこれらの突然変異株の形質転換を包含する。さ
らに仙の態様として、生合成方法における上記形質転換
体のλ（１用を包含１−る。さらに他の態様はＡ１う草
菌突然変異株の単離方法に便用才るのに過した二機能性
プラスミドに関する。

組換えＤＮＡ技術は年物宇および生化年の分’ＪＪ−に
おげろ比較内油しい技；ＩｉＪであるか、こσ）分！Ｉ
’Ｊの発展は者しく、細菌間でのプラスミドの移し碗え
も最近になって経躾され始めている。フ０ラスミド乞介
した（たとえば＋８１Ｆ索およびＤＮＡ　ｌす［片乞用
いた）クローニングもかなり通芽してきて、曲業日ソリ
ｉ′妓性も［°晶まりつつある。あるイ止の充イ王住９
勿（たとえは大腸繭）内で、生物学的に全く別の分シ」
′４に属−する生物由来の退仏子か″に製され、その結
果、佳間退伝子表現も川面になっている。僅感柴能の角
力と所望σ）キメラプラスミドに対する感染によって、
福生生物にも様々な特性牙たは衣用型か与えられてきた
。

大腸用の各他菌株は組侠えＤＨＡのイυ１死開発に繁用
されてきたし、他の棟の分野での４ｄ＋死が開始された
今日でも、大部分の研究は大Ｍ＋　’ｔｊｔ’ｔによっ
て付われているのである。大１腸菌には多（の重要なオ
リ７φｊがある。しかしまた欠点もｋっって、それがゲ
１死渚ｒ伸σ）個主生物の検索に向かわせろことにもな
っている。たとえば、大腸菌の細胞外皮ツタ分にはパイ
ロジエンかある。ｆだ大腸口は通猟、＃Ｉｆｌ胞外へ缶
白質乞分泌−「ず、そのため工業的操作でのｌｎ　ｖｉ
ｖｏ生合成に大腸−１７ｊ形買私挟体を１丈用すると生
ルｙ物の回収か像尚ｊＶｃ７；ｃる。

太り、、ｒｊ＋　Ｋ代わりｎＪる口Ｊ前件か品く、興味
かもたＡ１ていイ）柘主としては、土壊バクテリアであ
る枯Ｑ　ａ１ｙｅｔ卒けることかでき金。この微生（吻
はヒトにメＪして病原づ１−を示さず、１ｈ性や有害細
胞外皮成分ケもたす、工業的発隙応用分野におい又能率
的にイψＪ４．ｌできる。たとえば桿菌属（Ｂｕｃｉｌ
ｌｕｓ　）のこの神は＋＋、ｉｌｌ川悶外右τ用買の屑
っ生かｊｊＪ能で、蛋白質が７５ｉ望のｊｉＮ終序９勿
でｋ）るＪ場合、回収ケ卑糾化てろことができ゛る。し
たかつて、最近、枯草菌の形′Ａ転換体ｒ大天然魚伝子
背景？有する天然の土壌バクテリアからは借られない細
胞外蛋白質の産生に第１用１−ろため、枯卑閉乞クロー
ニングシステムとじてｌＬ９発することを目的とした研
究か行われろようになってきた。しかも、枯草？ＴｈＫ
ついて（」１、鋤仏子、ｆｌｉｐ図、ＤＮＡ伸介形賀転
換システム、クローニングヒークルとして応用できる一
５ｊ能性のあるいくつかの溶加性おまひ馬性バクテリオ
ファージがよく知ら才Ｉている力・らで・ある。

黄色ブドウ状球菌（５ｔａｐｈｙｉｏｃｏｃｃｕｓ　ａ
ｕｒｅｕｓ　）起Ｗの数穫のＱ離プラスミド？枯草り内
で壇ημさせることはできるが、これらのビークルｒＪ
：るＤＮＡ配列のクローニングは大腸１閉システムの場
合に比してきわめて効率がイハい。こθ）体；合の曲題
ルの一部は、４ｉ！ｉ徹菌が被感染性受隘′細／Ｉｆｊ
！の効率的な形質転％”５　Ｋプラスばドのマルティマ
−（たとえ（１、タイマー、トリマー等）￥要求するこ
とＫある。

このため、大部分σ）枯草菌配列は、形質軸振・かたや
すい太ｊ１易１７４内に面接クローン化されてぎた。プ
ラスミドマルティマーの要求を角１決１−ろために、Ｒ
ａｐｐａｐＯｒｔ　　ら　（Ｍｏ　１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎ
ｅｔ、、　　　ｉ　　７　６　　コ　２３５２．１９７
９］は、枯草菌ＤＮＡ馨まず大腸口中で二截能性ベクタ
ーとクローン化した。この場合の月日ソは大ｈａ　＆ｈ
内にキメラブラスミドマルティマーヲ生成さゼ−１つい
でこれらのマルティマーン枯草菌の被感染コー４１′受
等菌の形質転換に利用することであった。残念ながら、
榊在のところ、この方法で得られた形質転錬体は不安定
であることが示されている。移送Ｉ１．″ｊまたは数代
の継代培香後に、形蛮転換体はいわゆるν「たに取得さ
れた性ＪＩＪ、を失ってしまう（本明細り中では、この
新しい性質の喪！に：馨「不′ｆ、を延性」と呼び、兵
に増’ｉ＋Ｍ　Ｌで刹たに取得した性質を明らかに糺２
代的に維持する場合、これを「安シＪ＝な」形質転換体
と１）γぶ）。

中間宿主を回避でとれは、安短な枯阜珈形質転お）４体
がイｌられるとも考えられるかもしれない。しかしなか
ら、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで産生される代表的な組捩えフ０
ラスミドはモノマー、すなゎぢただ１個の安全迫仏子栄
位を含有ｆ７−１ＶＣすぎない。この＞＝のモノマーは
枯草菌内には移送され得ないし、また４５月１的な頻度
で枯草菌内ＶＣおいて増動１−ることもない（「頻度」
とはポジティブな小物の実誹数を生じた全部例数で割っ
た伜である〕。一方、マルティマープラスミドの（＋ω
体ｆｆｆ￥開発する方法としては中間宿主を使用１−る
方法が考えられる。理論１コツには、Ｉｎ　Ｖｌｌ：ｒ
ｏでモノマーのキメラニ段ＴｉＬ性シャトルベクターを
調装し、このベクター？大腸６１内に移送してマルディ
マーの１１」イネＬ１ケイ！７　％　４’＋’Ｊ草６．
１ケこのマルティマープラスεドで埠柴さ一１ｊ不こと
は可能である。しかし、この方法に伴う丑な間私点・”
ｉＪ’　７Ｊわち枯岸菌形質転４．゛・体の１９ｊらが
な〉［、安定性と形質転換り度Ｑ）仏、さの加重はうＱ
　３−ｋｃ　＆ま角ｊ明されていｌよい。

本シロ明は、二（か油性キメラフリシスミド゛で４ｉ１
＋　４ξ１η苓ｒ辞、采さ１Ｌる場合にみら！シイ）フ
１ン賃転挟σ）不汝別１９：とり・５１ｉｉ」題をプｊ
１？、Ｉ＜〕−イ）ことをイ側′Ｊ−Ｊ−６ものでＡ；
）ろ。

７１：　３’ｊｉ　’Ｄ：：ｆ６Ｊ−！ＩＩＰ　＋７）
状ｒ原ｔｔｒ　−）　イもヨリ、下１７ｃ　、−＋３＝
げイ）釉告の６己述が４．之ｋｃなる。

Ｅｈｒｌｉｃｂ：ｉ’ｒｕｃ、１Ｊａｔ１．Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、　、　７５　：　１４３６−１４６６、（１９
７８）、Ｇｒｙｃｚａｎら＝３・Ｂａｃｔｅｒｉｏま−
，１３４：３　１８−３２３（１９７８）、Ｊ（ｅｇｇ
ｉｎｓ　　ら　：　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、、　　７　５　　：１４２３−１４２７（１９
７８）、　、ＫａＷａｆｆｌｕｒａ　　：Ｇｅｎｅ、　
ｂ　：　８７−ン１．（１９７９）、Ｇｒｙｃｚａｎら
：　　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１　４　１　　：　
　２４６−　２５３（１９８０）　、　Ｒａｐｐａｐｏ
ｒｔ　　ら　：　　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ。

１７６：２３９−２４５（１９７９）、　Ｔａｎａｋａ
ら　：　　Ｇｅｎｅ、１０：１３１−１３６（１９８０
）、Ｆｅｒｒａｒｉら：　Ｊ’、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
１５２　：　８０９−８　１　４　　（’Ｉ　　９　Ｂ
　２　　）　　、Ｇｒａｙ　＆　Ｃｈａｎｇ　　：　　
Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１　４５　　：　　４２２　
（１９８１）１９８０年１２月２日発行の米国特許 第４．２５７，２２４号（０ｏｈｅｎ　＆　Ｂｏｙｅｒ
　）に開始されたＪ）・作は、本発明の実施に除し有用
である。本発明の操作にｉ／、１４して以下に引用する
文献も不発１ル」の実施に釡考と／よる。

本発明ばいか７．ｃろ埋ム面によっても拘束されるもの
ではないが、本発明者らの最も重要な理論的所見は本発
明の枯草菌形質転換方法によれは例数安定な形質転捗体
が珪化するか乞示唆するものである。

これらの理論的所見は次のとおりである。第一に、マル
テイマーフ”ラスミドが大ＩＪｔａ　＆ｌ中間宿主から
枯草菌ＶＣ，移送されたのちにはクローン化された挿入
体は不安定である。比較的短期間に、あるいは数代の絹
９代」召哀で、挿入体はたとえば欠失により著しく」１
１ｍｇれ７．）。第二に、相似の程度は（１）枯草−受
答法の退伝子背穿および（２）り【コーン化される。ｆ
、ｊｊ人体の大きさＶこよるように思われろ。キメラプ
ラスミド欠失の頻度は制限能のある受答法では増大する
ように与える。しかし１．Ｃがら、：ｌ１１４限欠］ｈ
株であるＭ１１１２では、欠失は全く誌められす、その
頻度は４１人体の大きざに比例した。第三に、ｌｌ１ｌ
■１１２ｔａｙ株においてさえ、損傷は制限に仲介され
るようにみえた。第四に、放射性リン標ｉｆ／＜シラス
ミドによる研究の？５果、挿入体に対する損傷の少なく
とも一部はエンドヌクレオティックな分解水９よびＭｉ
ｌｌｉ胞外住のものであることが示唆されろ。

第五に、インタクトキメラシラスミドＤＮＡに対するＭ
、Ｉ　１１２の形質転換乞広範に検討した通告で、枯草
珈受答株の形質転換に先立って大腸菌内で増殖させたキ
メラプラスミドＤＮＡにはインタクトな挿入体の出現が
時に認められることがあった。第六に、プラスミドの不
安定性は大腸菌内での増殖の結果σ）ように思われる。

枯草菌内で増ＩＡ貝させたキメラば、大ｊ偕拍内で増殖
させた場合より、枯草菌受答法の安定な形質転換にはる
かに有効である。

これらの所見を黄銅に、形質転換能の高い枯草閉の変異
株（以下ＰＳＬ　１と叶ぷ）が発見された。

この変異株は（１１大腸閉からの個体組候え二機油性プ
ラスミドによる安定な形質転換、（２）大腸菌からのあ
る棟のクローンブールの安定な移入の増大、：１６よび
（Ｘ３）卸［用悶外均−工冒夕匣キメラプラスミドＤＮ
Ａのエンドヌクレオティックな分Ｗ１１１１向の明らか
な低下によって示されるように、親株とは表功型が異な
っている。

この亥族株は大腸菌内で増殖された各種任意の過当′／
、Ｃ組４３）１え三機能性プラスミドによって安定に形
質転換される。その結果、細胞外飯白質分泌体としての
実用性をもつ新規な形質転換体が、枯草菌変異株から得
られることＫなった。枯草菌生合成技術の著しい進歩が
もたらされることになる。

この変異株は次のようにして単離される。

ａ）大腸菌内での組み換え二機油性フ０ラスミドの瑠焔 ｂ）大部分は不安定な枯草菌形質転換体の１同体群を得
るため、上記のように増殖させたキメラプラスミドによ
る枯草菌ｔｌｊｌｌ限欠失株の形質転換Ｃ）きわめてわ
ずかな安定形質転換体の単離ｄ）女′ｊＪ１７：ｃ形質
転換体を抗生物質からの選択圧なしで数代にわたり生有
させることによる安定な形質転換体のキユアリング ｅ）キユアリングされた後代世代内から、好ましくは初
め不安定であった起＞’ｉ　Ｍｔ、−＋ｊ＋・えプ′ラ
スミドでの安定な杓形質転換による変兵柱の検出および
選択 好ましいｆｂＩｊ限久袖栽株ｈ載体ｘ　１１２について
は、Ｔａｎａｋａ　：　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、
、　１７５　、：　２３５（１９７９）の記載が参考に
なる。この相法のＡＴＯＯ寄託番号は３３７１２である
。

キユアリングされた変異株のコロニーは大賞に生習さぜ
ることが可能で、大脇白Ｐノでさせた組換え三機能性シ
ラスミドによって安定に形′Ｂ、転換できる。

挿入体の大きさとコロニー化された挿入体に向けられろ
損傷との間に明らかに有意な相関があることから、ｉｕ
偏か枯草−の制限欠損菌株によってなされた場合でも、
組禎えフ９ラスミドは本発明の単離方法に百片ｌ′ぶ容
易に検知、測定できる長さく叶たは分子υ）乞有１−る
枯草−のクローン化伸入体を歯角し、その構成は本発明
の徒然変異株単離方法に廁している。こび）　ＤＮＡス
トレンチは塩基対ソ００ｆ７とは６００程度と小さくて
も、また塩基対２　ＬＪ、０００　（２［Ｊ　Ｋｂｐ　
）程度と人ぎくてもよ−いが、比較的ジいＤＮＡストレ
ンチ（＞　４　、Ｋｂ＋ｐ　）の方がはるかに偵湯乞受
げや−４−＜、この突然変異株０）単１シ：［方法の効
率は低重−「る。クローン化された挿入体は既知の分子
艙副足法によりインタクトな形で４Ｃ′！出できる。

本発明の形質転換効率の高い枯草菌突然変異株（ＰＳＬ
　１　）は適当なメジウム中で生育し、この培養微生物
は、１９８３年２月２５日に枯草菌遺伝的菌株センター
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋＣｅ
ｎｔｅｒ、　０ｈｉＯ５ｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇ、ｙ、　Ｏｏｌｕｍｂｕｓ、○ｈｉｏ、　Ｕ、Ｅｌ
、Ａ、　）にＢＧＳＯＩ　Ａ　５１０の番号で寄託され
た。

以下枯草菌ｐｓｒ、　１または単にＰＳＬ　１と呼ぶ突
然変異株（Ｍ工１１２菌株の突然変異株）の単離方法の
開発には、組換えＤＮＡ技術の分野における熟練者に容
易に利用できる材料を使用し、各方法工程の多くは文献
公知である。枯草菌および大腸菌の各菌株が本技術分野
の熟練者に利用可能なことはもちろんである。これらの
菌株は容易に入手できるメジウム中で生育させることが
可能で、この種のメジウムには、形質転換の効率を調べ
るために抗生物質金加えたメジウムも包含される。三機
能性クローニングベクターを含めた各種シラスミドにつ
いてはすでに文献に報告されているし、その構成も比較
的容易になっている。

本発明に使用できる代表的な枯草菌菌株Ｍ１１１２につ
いてはすでに述べた。その関連ある遺伝子型はｌｅｕ　
Ａ　８　ａｒｇｌ　５　、　ｔｈｒ　Ａ　ｒｅｃ　Ｋ　
４　ｒ−ｍ−である。代表的な大腸菌には５ｘ２２６７
および０６００ＳＦ８がある。前述したように、大腸菌
は有用量の各種マルテイマー（ダイマー、トリマー、テ
トラマー等）を含む個体群を得るだめに、モノマーシラ
スミドを増殖させる中間宿主として利用される。中間宿
主である大腸菌および枯草菌の両者に感染可能な三機能
性プラスミドベクターは、文献、たとえばＲａｐｐａｐ
Ｏｒｔら：　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　、　１７６　：　２３９−２４５　（１
９７９）およびＧｒａｙ　＆　Ｃ！ｈａｎｇ：　Ｊ、　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　１４５　：４２２−４２８
（１９８１）に記載されている。

これらおよびその他の本発明に使用される材料および方
法について以下に詳述する。

フ０ラスミドベクター： 本技術分野においてよく知られているように、モノマｍ
＝機能性クローニングベクターは１ｎＶｉｔｒＯにおい
て、挿入体によって供給される高次コイルプラスミドか
らヌクレアーゼおよびリガーゼを用いて構成される。本
発明においては中間宿主の大腸菌および所望の枯草菌菌
株への感染が答易なように、挿入体の大きさが重装にな
る。三機能性プラスミドベクターは表現型性質、たとえ
ば抗生物質抵抗性全付与することが可能で、これは中間
宿主にも枯草菌にも表現される。抗生物質抵抗性は、本
発明の方法に用いられる選択および単離工程を容易にす
るのでとくに有用な性質である。

文献に報告されている三機能性ベクターは大腸菌形質転
換体に第一の抗生物質（たとえばアンピシリン、テトラ
ザイクリン等）に対する抵抗性を、枯草菌形質転換体に
は通常、第二の別の抗生物質（たとえばクロラムフェニ
コールまたはカナマイシン）に対する抵抗性を付与する
。形質転換の結果として１　′Ｐｆｆ以上の抗生物質に
対する抵抗性を付与することもできる（裏とえば大腸菌
にアンピシリンおよびテトラザイクリン両抗性物質に対
する抵抗性）。

天然の枯草菌微生物内にもフ０ラスミドは発見ざれてい
るが、これらの天然に生じたプラスミドには抗生物質抵
抗性決定子が暗号づけされておらず、選択可能な表現型
をもたないので有用でない。しかし他のダラム陽性菌（
一部の研究者によって発生学的に桿菌属に近いと考えら
れている）からのプラスミドは枯草菌内での複製に使用
でき、適合できる。的に述べたように黄色ブドウ状球菌
起源の幣離プラスミ、ｔ、−＋は被感染能を有する枯草
菌細胞によって取り込まれるが、この感染性にはプラス
ミドマルテイマーが要求される（枯草菌はそれらが天然
成分であるかのように生育する。すなわち、そのプラス
ミドを取り込むことが可能である）。

公知の三機能性ベクターのうちで、数種のものは本発明
への使用に適当で、たとえばＲａｐｐａｐｏｒｔら：　
Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　、　１７６　：　
２５９　（１９７９）に開示されたものがおる。また一
連のベクターがＧｏｅｂｅｌら：　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　Ｂｏｙｅｒら編。

Ｅｌｓｅｖｅｅｒ、　Ｎ、　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　Ａｍｓ
ｔｅｒｄａｍ、　４７〜５８負（１９７８）に報告され
ている。その他の三機能性ベクター（以下「ｐＤＨ５０
６０」という）が、Ｇｒａｙ　＆　Ｏｈａｎｇにより、
１）ＯＧ１１９６（ｐ０１９４とｐＵＢ　１１０のキメ
ラ）全ｐＢＲ’３２２にその独特なＰｖｕサイトに結合
させて構成されている。このプラスミド（Ｉ）ＤＨ５０
６０）は大腸菌内および枯草菌内の両者で複製され、第
一の抗生物質（アンピシリンおよびテトラサイクリン）
に対する抵抗性を大腸菌に、第二の抗生物質（クロラム
フェニコール）に対する抵抗性を枯草菌に伺与する。文
献に報告されたこのベクターはＴｃ遺伝子内の独特なり
ａｎ　Ｈ１およびＳａ’ｌ　Ｉサイトラ含み、挿入不活
性化による組換え分子の同定が可能である。

Ｇｒａｙ　＆　Ｏｌｘａｎｇ：　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、　、　１４５　：　４２２〜４２Ｂ（１９８１）参
照。

他のベクター（以下［ｐｂｐ　１２０１　Ｊと呼ぶ）は
ＰＤＨ５０６０から、Ｈｌｎｄ　Ｉｌｌサイトをシラス
ミドのｐＢＲ３２２配列内に保持させ、ｐａ１９４寄与
のクロラムフェニコール抵抗性決定子の近くにちる他の
Ｈｌｎｄ　Ｘサイ１４−欠失させることによシ誘導され
る。ＰＤＨ５０６０Ｃｏｏ　（共有結合的に近接した環
状）　ＤＮＡを低濃度ｍ１ｎｄＩＩ［（０，１単位／μ
ｇ；３７°０１１時間）で直線化し、シラスミドを両サ
イドで切断し、エタノールで沈殿させ、高置緩衝液（２
８０ｍＭ　Ｎａ０１１　、３０　ｍＭ酢酸ナトリウム、
４．５　ｍＭ酢酸亜鉛）に再懸濁する。ついでＤＮＡ　
ｆ：Ｓ　１ヌクレアーゼ（１単位／μｇ）によシロ７°
Ｃで６０分間処理し、露出Ｈ１ｎｄ　Ｉ！末端をプラン
ト末端とする。ＥＤＴＡ　’ｅ最終濃度１０　ｍＭにな
るように加え、ＤＮＡ１６５℃に１０分間加熱し、１チ
アガロースゲル上で電気泳動する。塩基対７５００　（
７，５Ｋｂｐ　）の配列をもつ線状分子をゲルから、凍
結、融解、フェノール抽出２回、酢酸アンモニウム（１
Ｍ）からエタノール沈殿による濃縮で回収する。

Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ（５０単位／ｍｆｆ１，１４℃
、１８時間）でプラント末端のＩＪ　、７”−ジョン後
に、ＤＮＡ　ｆ　大腸ｍｃ６００Ｓｙ８にトラン、＜＊
−、Ａし、アン２シリン抵抗性形質転換体を数える。ｐ
ＤＨ５０６００２個のＨｉｎａ　ｌ［は約２．４　Ｋ１
１ｏ塩基対（Ｋｂｐ　）離れていて、このＤＮＡアトレ
ツテはＢａｍＨｌにより非対称的に分裂されるので、２
個のＨｌｎｄ　ｌサイトのいずれがＢａｍ　Ｈ１−Ｈｌ
ｎｄｌｌ［二重消化によシ個体アンピシリン抵抗性形質
転換体から欠失したかが確認された。所望のプラスミド
ｐＬＰ　１２０１は７．１および０．４　Ｋｂｐ断片を
生じｐＢＲ３２２コｙトリビュー　ショｙ内にＨｉｎｄ
　ＴＩＩが保持されていることを示している。

テトラサイクリン抵抗性決定子に対するプロモーター近
くの独特なＨｉｎｄ　ｌサイトにより、ｐＬＰ１２０１
を産前製バクテリオファージφ２９　Ｈｌｎｄ　Ｍ断片
をクローン化するために用いた。

プラミドＤＮＡの単離と被感染性細胞の調製：ａａＣ−
プラスミドＤＮＡ　＠固定相大腸１右培地から、１１ぼ
、Ｋｕｐｏｒｅｚｔｏｃｈ　＆　Ｈｅ１ｓｉｎｋｉ　：
　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｅ、　　Ｒｅｓ、　　Ｏｏｍｍｕｎ、　　
　、　　５　４　　：　　　１　４　５　１　〜１４５
９（１９７３）ならびにＲａｄｌｏｆｆら：Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｌ、Ａｃａａ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、　５７　
：　１５１４〜１５２１（１９６７）記載のクリアドー
リゼートーセシウムクロライドエチジウムプロマイド法
によって１官製した。

シラスミドＤＮＡは大腸菌について上述したと同４Ｈ’
ｌ’ロラムフ工ニコール含有メジウム中６７°Ｃで一夜
生育させた枯草菌培養液から精製した。

大腸菌５Ｋ２２６７のシラスミド形質転換は公知の塩化
カルシウム法に従って調製した被感染性細胞を用いて実
施した。抵抗性細胞はアンピシリンまたはテトラサイク
リン含有アガールプレート上で選択した。被感染性枯草
菌細胞はＣ１ｏｎｔｅｎｔｅ＆　Ｄｕｂｎａｕ　：　Ｍ
ｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　、　１６７　：　２
５１〜２５８（１９７，９）に記載の方法にほぼ従って
調製した。シラスミド形質転換の至適条件は好ましい枯
草菌菌株について経験的に決定した。クロラムフェニコ
ール抵抗性の選択は被感染性細胞とＤＮＡを６７°Ｇで
１時間インキュベートしたのちクロラムフェニコールを
含有するアが一ルプレート実施例 各種のプラスミドおよびキメラプラスミドがｐＤＨ５０
６０から誘導され、約Ｑ、３　Ｋｂｐから約２０　Ｋｂ
ｐの範囲の大きさの挿入体が得られる。以下に述べる単
離方法においては、大きさは約１．７Ｋｂｐから９．５
　Ｋｂｐの範囲で選択された。

大腸菌内増殖プラミドに対する形質転換能が改良された
枯草菌突然変異株の単離： 前述のプラスミドベクターにより、Ｍ工１１２菌株から
枯草菌形質転換体が得られた。

ＲａｐｐａｐＯｒｔら：　Ｍｏｂ、Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅ
ｔ、　、　１７６　：　２３９（１９７９）参照。

前述の理論的所見に基づき、稀な、安定なりロラムフエ
ニコール形質転換体は偶然または受容法の表現型の結果
と推測できよう。Ｍ１１１２形質転換体５００について
調べ、インタクトなキメラプラスミドＤＮＡ　’ｉ検出
した。インタクトプラスミドまたはハイブリッドプラス
ミドＤＮＡを含有する２０のＭ工１１２クロラムフェニ
コール抵抗性形質転換体が選出された。これらの安定な
形質転換体は自然にプラスミドＤＮＡ　’ｉ失う（クロ
ラムフェニコールなしで２０世代生育）。（枯草菌菌株
は細胞をクロラムフェニコール選択を行わないで生育さ
せると１世代約１０％の割合でｐＤＨ５０６０キメラを
自然に喪失する）。このキユアリングを行ったコロニー
はシラスミドを含まないことが確認された。このキユア
リング後に誘導された菌株をついで被感染性とし、適当
なプラスミドまたはキメラシラスミド（たとえばＩ）Ｄ
Ｈ５０６０）で再形質転換した。キユアリングされた菌
株のキメラプラスミドによる再形質転換頻度は親株のＭ
工１１２に比べ１００倍程度上昇した。５種のキユアリ
ングきれた菌株が５種の異なるキメラシラスミドにより
高頻度に再形質転換され、クロラムフェニコール抵抗性
を再獲伺した。しかしながらこのうらのただ１種、先に
ＰＳＬ　１と命名した菌株のみがフ０ラスミドキメラに
よって安定に再形質転換された。

ＰＢＬ　１の形質転換表現型の特性： ｐｓＬｌのキメラプラスミド形質転換効率は、天然１）
ＤＨ５０６０、Ｉ）ＤＨ５０６０均一キメラおよび大腸
菌内増殖ＰＬＰ　１２０１不均一キメラによる親株Ｍ１
１１２の形質転換の場合に匹敵する。ＰＳＬｌおよびＭ
１１１２（親株）はベクターｐＤＨ５０６０により同様
の効率で形質転換される。しかしながら、大腸菌から単
離されるキメラはＰＳＬ１′ｆＩ：親株Ｍ工１１２よ９
５〜１１０倍高率に形質転換した。形質転換効率の最大
の改善は４　Ｋｂｐまたはそれ以下の挿入体を含有する
キメラの場合に観察された。大きな挿入体（＞５Ｋｂｐ
）を含むハイブリッドプラスミドによる菌株Ｍ工１１２
の形質転換はきわめて低率であった。

菌株ＰＳＬ　ｉの表現型には、大腸菌から移入されたキ
メラシラスミドＤＮＡの短時間安定性の増大も生じた。

この増大は長さ１．７〜４．２　Ｋｂｐの挿入体を含む
プラスミドでは１００％に達したが、枯草菌９．５Ｋｂ
ｐ挿人体を含む大きなキメラの移入の場合は２５チに低
下した。すなわち、ＰｓＬｌは枯草菌の高頻度形質転換
可能ｒｅｃ　Ｋ　４株で、長さ４Ｋｂｐまでの挿入体を
含む個体組換えシラスミドＤＮＡ分子の大腸菌から枯草
菌への移入を可能にする菌株である。

本発明の方法におけるプラスミドＤＮＡ　Ｉ￥ｙ、シ込
みならびに細胞外および細胞内酸可溶性物質の生成ｆ　
ｅＬｅ　Ｖｏｓら：　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ
、　、　１８１　：　４２４〜４３３（１９８１）の方
法にほぼ従って測定した。親株である枯草菌Ｍ工１１２
菌株および突然変異株ＰＳＬ　１の両者について、細胞
外および細胞内安定性、ならびに３２ｐ標識大腸菌およ
び枯草菌増殖キメラシラス、Ｓ　ＦｏＤＮＡのＤＮＡ取
シ込み動態について検討した。ＰＳＬ　１の形質転換時
および親株Ｍ工１１２における３２ｐ標識キメラシラス
ミドの特性に関しては、プラスミドＤＮＡの取シ込み、
あるいは細胞外および細胞内酸溶解性放射能とも差はな
かった。しかしながら、細胞外大腸菌増殖キメラプラス
ミドＤＮＡは１■株１シエ１１２と６０〜６０分間イン
キュベートするとエンドヌクレオティックに分解したが
、ＰＳＬｌではこの現象はみられなかった。

大腸菌からｐｓＬｌへの枯草菌クローン銀行の移入： ＰＳＬ　１の形質転換可能な表現型が、大腸菌と１を工
１１２の間のｐＤＨ５０６０クロ一ン銀行の移入にも拡
大されているかどうかを調べるために、大腸菌内で増殖
された枯草菌配列のクローンゾールを用いてＭ工１１２
およびＰＳＬ　１の形質転換を行った。大腸菌内で増殖
されたＩ）ＤＨ５０６０キメラのクローンゾールはＭ工
１１２を低効率で（天然ｐＤＨ５０６０ベクターによる
形質転換の０．１〜１チ）形質転換したが、ｐｓｒ、、
１は高効率−、Ｍ工１１２の場合の２０〜１００倍、形
質転換された。

大腸菌から枯草菌へ、また２種の大腸菌菌株間の、２種
の枯草菌クローンプールの安定な移入に関呟ＰＳＬ　１
の突然変異株の効果を検討した。移入された大腸菌増殖
キメラの物理的統合性を調べるため、１０３〜１０４の
形質転換体をプールし、グラスミドＤＮＡ　’ｉ単離し
、制限ヌクレアーゼ消化後にアがロースデル電気泳動で
分析した。対照として大腸菌５Ｋ２２６７菌株とｃ６０
０ｓｒ８ｉ株の間を移送されたクローンプール中の個体
組換えシラスミＰの回収率を調べ、平均８０％という値
を得た。

これに対し、これらのクローンゾール中の個体組換えプ
ラスミドのＭ工１１２への移送はきわめて低効率で平均
１６％であった。しかしながら、これらのクローンゾー
ル中のハイデリッＰフ０ラスミドの大腸菌からｐｓｂ　
ｉへの移入では、プールされたクロラムフェニコール抵
抗性形質転換体からの個体安定キメラの回収率の増大を
生じた（５０チまで）。すなわち、ＰＳＬｌの表現型は
大腸菌から枯草菌への高い効率での、個体キメラおよび
クローンプール両者の安定な移送を可能にする。

本発明を要約すれば次のとおシである。

非病原性微生物である枯草菌への遺伝子クローニングを
著し′く容易にする枯草菌の突然変異株が単離された。

枯草菌は蛋白質分泌体として知られ、工業的操作には能
率的に利用できる。もつと一般に使用されているクロー
ン増殖微生物、大腸菌と異なり、枯草菌は細胞外皮にパ
イロジエン物質を含まないという利点がある。しかしな
がら、枯草菌に感染させるキメラプラスミドの調製は困
難で、枯草菌の形質転換に適当なプラスミド型を得るだ
めの中間宿主として大腸菌を用いると、枯草菌は大腸菌
増殖ＤＮＡを異物として扱い、シラスミＰの挿入体部分
を好んで攻撃する。この攻撃によシクローニングされた
遺伝子が欠失し、クローニングシステムとしての枯草菌
の使用には限界があった。

本発明の枯草菌受容様は、これに対し、大腸菌増殖プラ
スミドＤ’ＮＡにより高頻度に、安定かつ効率的に形質
転換される。この突然変異株の発見と、それＫよって得
られる高頻度の安定な形質転換体は、クローン化された
遺伝子の発現のだめの宿主としての枯草菌の利用を著し
く容易にする。

本発明はいかなる理論によっても限定されるものではな
いが、枯草菌Ｍ工１１２を大腸菌由来の適当な組換えプ
ラスミドで形質転換した場合の不安定性および非効率性
の基盤は、この菌株の制限欠損性にもかかわらず、Ｍ１
１１２のもつ１種以上の酵素による欠失がクローニング
された遺伝子に向けらノしることによるものと思われる
。この１種以上の酵素は大腸菌増殖ＤＮＡ分子を異物と
して認識するのであろう。したがって、クローニングさ
れた遺伝子の著しい喪失を生じ、Ｍ工１１２やその他の
通常用いられる枯草菌菌株をクローニングシステムとし
て使用することは顕著な制限を受けることになる。一方
、突然変異株ＰＳＬ　１はクローニングされた遺伝子を
桿菌域内で安定に増殖させる。この発見によシ、クロー
ニングされた遺伝子の表現に宿主バクテリアとして枯草
菌を使用するに際しての最大の問題点が解決されたので
ある。

代理人　浅　村　　　皓 手続補正書（師） 昭和５９年　３月２６日 特許庁長官殿 １１１１ｆｎ　　　　年特許願第　　　　　　　　号（
昭和５９年３月１日付特許願） 事１！Ｉとの関係　１■゛１出願人 ４、代理人 昭和　　年　　月　　日 ６、補正により増加する発明の数 ７゜補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 （１）　　明細書、１６頁７行と８行との間に下文を加
入する。

「　さらに、本発明の突然変異株はアメリカンタイプカ
ルチャーコレクション（ＡＴＯＯ）に１９８４年２月２
８日付でＡＴＧＯ ３９６２０として寄託された。」 　４４７−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　大ＨＭＪ園内で増殖された組換え二様ｎ目性
   プラスミドによる安定な形質転換のための衣境型乞有し
   、敢株の刺限久Ｊμ囚株に比へて大腸菌増殖キメラシラ
   スミドＤＮＡの分力１１唄同か低下している枯草囚制限
   欠１ト困ａｔ７’）突然変異株。 （２）　　大ｈＭ　ｒＩｑ内でＪＷ　Ｍｉ４された組換
   え三機能性プラスミドによって安定に形質転換された特
   許請求の範囲第１項記載の突然変異株。 ＋３１　　＊＋ｔｉ侠え三機能性プラスミドによる形質
   転換の結果として、１ｌｉｌｌ限欠損非変異株によって
   は産生されない蛋白買の産生か可能となった特許請求の
   範囲第２項記載の汝足に形質伝法された突然変異佑（４
   １形′Ｒ駄挨の結果として抗生物質抵抗性を有する、特
   許請求の範囲第２項記載の安定に形１↓Ｗ、飼された突
   然変異株。 （５）　　クロラムフェニコール抵抗性を有し、大腸国
   内で増殖された組換え三機能性プラスミドによって安定
   に形質転換され、この形質転換体は枯草菌Ｍ］：１１２
   菌株の自然突然変異株の形質転換によって得られ、この
   自然突然変異株は載体ＭＩｉ１２と比べて場合の表し型
   の差違、＃−７；ｃわぢａ）人肌菌からの個体組換え三
   機能性シラスミドによる【？ｈ頻度での安定な形質転換
   能、ｂ）大瓶−からのクローン７°−ルの安定な移入の
   増大、Ｃ）＃」施外不均−増殖キメラプラスミドＤＮＡ
   のエンドヌクレオティックな分解１頃向の低下によって
   特許つけられろ枯草菌微生物の安定な形質転換体。 （６）生成物の原料を含有する微生物栄養メジウムから
   生物学的に合成または改変される生成物を製造する方法
   において、特許請求の範囲第２項ｈα載の突然変異株を
   栄養メジウムと接８！１１さぜることからなる改良。 （７１ａ）大ｊ助菌に第一の抗生物質ａ仇惟を付与でき
   ろ第−ＤＮＡ領域、枯草菌に第二の抗生物質抵抗性乞伺
   与できる第二ＤＮＡ領域、およびクロ・−ン化された挿
   入体からなる第三のＤＮＡ領域乞包含する卸例えまたは
   キメラニ機能性プラスミド乞大腸菌内で増動させろ工程
   、１））枯草菌の制限欠損菌株を前工程で増動させたプ
   ラスミドで形質転換して、第三のＤＮＡ領域をインタク
   トに含有する、大部分が不安定でｔトニの抗生物質に対
   する抵抗性？有し微小％Ｂ分が安定で第二の抗生物質に
   対する抵抗性乞有′ｆる形質転換体からなる１ｂす限欠
   偵枯草菌形質転？Ａ１４−の個体群を得る工程、Ｃ）安
   定で第二の抗生物で出に対′１−ろ抵抗性’ｒ　イ：　
   ＝ｒる形質転換体である微小部分の単離工程、ｄ）安ず
   で第二の抗生物質に対する抵抗性を有する形質転換体か
   ら抗生物質抵抗特性を除去１ろために形質転換体を継代
   生育させてその慣性ケ失わせる工程、ｅ）上記特性が除
   去さλまた後代世代からその突然変異株を選択する工程
   からなる特許請求の範囲第１項記載の突然変異株の単１
   ｌｌｉｔ方法、 （８）工程ｅ）において、特性除去後代世代を第三のＤ
   ＮＡ　領域乞含有する組換えまたはキメラフ０ラスミド
   で杓形質転°換し、特性除去後代世代中の第三のＤＮＡ
   領域の〃“定性ヶ決定てろことにより突然後４：＋を株
   をフベ択１−ろ特許請求の範囲々’７１ｆ＋、　Ｓｆ　
   ｑ８夕）方法。 （９）第三〇）１１）ＮＡ領領域安駕性は分子ζ、のｉ
   ｌｌ、ｉ定により決定する艶イＦｉｉ青求の釘ｉｐ四組
   ８　”５−ｅｒ　ｉｆ５肩・ｋの方法。 （１，０１大股ＩＷＩ内、枯草菌内σ）両キｊでネ・・
   Ｍ１２さ才？−て、大（枳−ｄＩＫアンビ′シリンおよ
   びテトラザイタリン枦、イ元性を枯′＃−第にクロラム
   フェニコール卦わ１仁１嘔′（＝Ｊ与し、アンピシリン
   またはテトラサイクリンＶｔｌヌ゛」１“る担初Ｉ住４
   ′イ・１埼できく・肩ｊ−のＤＮＡ　ｖｆｇ＆、クロラ
   ムフェニコールに対すく）折損性？イ４均できる第二の
   ＤＮＡ領域、およびバクテリオファージψ２９）ｉｉｎ
   ｄ■断片ぞ含むクローン化挿入体からなる第三のＤＮＡ
   領域を含有する、和ｉｉ’ｆ請求のイ・１）、四組７項
   ｎ１２載の方法に使片１゛るのにオした絹換え汁たはキ
   メラ二機能性モノマープラスミド、。 （１１）特ｆ（：　ｐ、〜求の射ｌ四組１頌Ｍｊ４載の
   突然亥ｙ株を形質転換する方法において、ａ）突然後か
   株にその変異株のノ１？袈転換体コロニー生爪炙件下メ
   ジウム中で、大腸肖１内に増焼されたマルテイマーフ０
   ラスミドで感染させ、そのマルテイマーフ０ラスミドは
   １榎の抗生物１１に対する抵抗性表胡、型を伺与できて
   、形質転換体コロニーに抗生物質に対する抵抗性ライ」
   与する工程、ｂ）メジウムから形質転換体コロニーを分
   離する工程、ｃ）この形質転換体コロニー？上記抗生物
   質ン含有するメジウム中忙移イエ程、およびｄ）この抗
   生物質中で生存する形知転換微生物ケ回収する工程、か
   うな゛ろ突然変異株の形質転換方法。