JPS5925400A - プラスミドｐｕｈ１及びその含有菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ドＰＵＨ１に関するものである。

更に詳細には、本発明は、新規なベクターとしてのプラ
スミドｐＵＨ１及びプラスミドｐＵＨ　１を含有する新
規分離菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａ
ｔｔｏ）　Ａｓａｈｉｋａｗａに関するものである。

本発明の目的の一つは、遺伝子操作技術に新規プラスミ
ドｐＵＩ（１を提供することにある。

現在、遺伝子操作技術に関連して数多くのプラスミドが
提供され、なかにはベクターとして有効に利用されるも
のもみられるようになって米た。

しかしながら、従来の数多くのプラスミドは、ベクター
として宿主に移入し、発現させたときに、そのプラスミ
ドが移入されたかどうかを検知することがきわめて困難
であった。勿論、すべての発生菌株についてプラスミド
を分離して検知すれば可能なのであるが、きわめて長い
時間がかかつてしまうものであった。

そこで、あらかじめ各種薬剤耐性をもたせた菌株から、
特定薬剤耐性のプラスミドを分離し、これをベクターと
して用いて菌に移入し、該菌を特定薬剤含有培地で培養
し、生育する菌を、プラスミドが移入された菌として分
離することが行なわれていたのである。

不発明煮らは、ベクターとしてより検知の容易なプラス
ミドを求めるために研究を行ったところ、納豆から分離
されたー菌株がすぐれたプラスミドを有していることが
わかったのである。

本発明は、プラスミドｐＵＨ１及びプラスミドｐＵＨ１
を含有するＢａｃｉｌｌｕｓ　ａｕｂｔｉｌｉａ　（ｎ
ａｔｔｏ）Ａａａｈｉｋａｗａに関するものである。

本発明のＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｔｌｅ　（ｎａ
ｔｔｏ）Ａｓａｈｉｋａｗａ　は市販の納豆Ａ＋＋ａｈ
ｉｋａｗａから新たに分離されたものであって、コロニ
ーはきわめて粘性が強く、納豆の粘質物を多量生産する
ものである。この分１ｌｌｌＬ株は１１ａｃｉｌｌｕＢ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ　（ｎａｔｔｏｌＡｓａｈｉｋａｗａ
と名うけられ、微工研にＥＦＲＭＰ−６６２０として寄
ｉｔされている。

新分離株、Ｂａｃｉｌｌｕａ　［ＩｕｂｔＮｉＢ（ｎａ
ｔｔｏ）Ａｓａｈｉｋａｗａは、既知の微生物であるバ
チルスズブチルスＩＦ’０１．！＋７１９の類似株であ
ると決定された。新分離株は表１及び２において、標準
株（ｔｙｐｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ）であるバチルス　ズブ
チルス■ＦＯ１３７１９と比較されている。バイオタイ
ツは引用された培地上で生育し、合成培地中では標準株
と同８度に炭素化合物を利用する。表面又は気中生育は
主に栄養的であり、クリームホワイト色−に見える。

新分１ｉｉｆ６株はプラスミドｐＵＨｊを含有する。新
分離株の特性はバチルス　ズプチルスに近似している。

顕微鏡特性：桿状、鞭毛側生、そして内生胞子二〇、７
〜０．９　Ｘ　１．２〜１．５　μｍ。

培養基及び生化学的特性：寒天上のコロニーは不規則、
表面はダル（ｄｕｌｌ）　、厚くなり不透明になった。

そしてコロニーの特色は培地の組成によって変化した。

１％グルコース栄養寒天穿刺培養での表面生育は厚くな
った。

表　　　２ 新分離株の分類学的調査 形態時性 桿状、　　０．８−０．９Ｘ２．０〜３．２μｍ、運動
性あり、ダラム陽性。

内生胞子形成、０７〜［Ｊ、　９　Ｘ　１．２〜１．５
μｍメチレンブルー陽生０ 培養特性 栄養寒天（培地）でのコロニー：ラフ、不透明。

ダル、拡散、クリーム色。

栄養寒天スラント（培地）：中程度の生育、ラフ、ダル
ー拭敗□−一 栄養ブロス：濁るが、こわれ易い菌膜はない。

リドマスミルク：徐々に一乏プトン化。

ゼラチン（培地）穿刺（培養）；液化する。

ポテト：著しい増殖、拡散。

生理学的ｔｈ性 硝酸塩還元能：阻生。

生産 インドール：陰性 アセトイン：阻生。

カタラーゼ：阻生。

酸　　　　：糖からは阻生。

色素　：陰性。

レバン　　：陽性。

資化 クエン酸塩：資化 糖：陽性、しかしグルコースからはガスを発生せず アンモニウム塩：陽性。

でん粉の加水分解：陽性。

馬尿酸塩の加水分）盾：陰性。

酸素Ｗ−１係：好気性。

温度関係：至適温度は６７〜４０”０．４５°Ｃで充分
生育、５”Ｃでは生育不良。

ビオチンは抽助的生育因子として必須；新分離株、Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉａ　（ｎａｔｔｏ＋Ａｓ
ａｈｉｋｎｗａは液面下の好気的栄件下に生育させつる
。この微生物は、炭素源例えば同化できる炭水化物と、
窒素源、例えば、同化できる窒素化合物又は蛋白質材料
を含有する栄養培地中で生育させることができる。好ま
しい炭素源は、グルコース、黒砂糖、蔗糖、グリセロー
ル、ＩＦ粉、）・ウモロコシ殿粉、乳糖、デキストリン
、糖蜜等を包含する。

好まゞしい窒素源は、コーンスチープリカー、酵母、固
型乳を伴った自己消化醸造酵母、大豆粉、綿実粉、コー
ンミール、固型乳、カセインのすい液消化物、魚粉、デ
イスナラーズソリッド、動物はゾトン液、肉と骨の砕片
等を包含する。これらの炭素源と窒素源の組合わせを利
用するのが有利である。痕跡量の金属に１、例えば、亜
鉛、マグネシウム、マンガン、コバルト、鉄等は、培地
の滅菌に先立って培地成分として水道水及び未精製の成
分を使用するため、添加する必要はない。

培養は微生物の満足な生育に導く任意の温度、例えば、
約２０〜５０’Ｑ、そして好ましくは約３０ないし３７
°Ｃで振盪培地を培養させることができる。普通にはＪ
、Ａ生°育は約３〜４，５時間で得られる。この場合、
用いる微生物は、をンらがしめ１２時間程度前培養した
培養、物が好ましい。

得られた培養物は遠心分離によって集菌される。

得られた菌体は、実施例に示す如く、洗滌、溶菌、精製
を行って、プラスミドｐＵＨ１を得ることができる。

本発明でｆｑられたプラスミドｐｌＪＨ１は全く新規な
プラスミドであり、従来報告された例はない。

本発明のプラスミドｐＵＩ１１は、納豆の粘質物の生託
する１ｖ［報がコードされた遺伝子が組み込まれている
点できわめて特異的である。そして、このプラスミドｐ
ＵＩＩ　１を制限酵素で９Ｊ断し、この切断部位に他の
有効物質を生ｔａする情報がコードされた遺伝子フラグ
メントをリガーゼにより結合させて新たなプラスミドと
して、これを粘性のない宿主に移入し／ことき、納豆菌
の粘質物の生産がはじまり、宿主のコロニーが著しるし
い粘性を持つようになり、コロニーを針先で引くだけで
粘性を知り、その結果、新たなプラスミドが移入された
ことが確認されるのである。このようなプラスミドｐＵ
Ｈ１、の特性は遺伝子ＩＩ′！！作に新たな一つのユニ
ークな技術を提供するもので、きわめてすぐれたもので
ある。

プラスミドｐＵＨ１は、１３ａｃｉｌｌｕｓ　ｇｕｂｔ
ｉｌｔｓ（ｎａｔｔｏ）　Ａｓａｈｉｋａｗａの一細胞
当り約３コピー得られ、約５７キロベースの分子量を有
し、その制限酵素開裂地図は第１図に示される。

第１図はｐｔｎ、ｔ　１の制限酵素開裂地図を示したも
のである。この地図は約５７キロベースの分子量を持つ
プラスミドｐＵＩＩ　１　ｆ基にして作成されている。

地図上の種々の制限位置は［１，０／　５．７キロベー
スのＴｒｉユａｎ制限位置に比例しだキロペースＫｒ５
標として記載されている。制限酵素の略字は次のとおり
である。（１１１ｆｉｎｃ［はへモフイラスインフルエ
ンザＲｃ（Ｉ（ａｅｍｏｐｈｉｌｕｇ　１ｎｆｌｕｅｎ
ｚａｅ　Ｒｃｌからの酵素である。（２）Ｐｖｕｌｌは
ゾロテラスバルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒ
ｉｓＪからの酵素である。（ろ）ｎａｍ）Ｉ　１　ｉ７
ｉ　バチルス　アミロリクエファシーンズＨ（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏＮｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　Ｈ＋か
らの酵素である。（４）ＥｃｏＲｌ　はニジエリシャ　
コリＲＹ　１５　（Ｅｓｃｈｅｒｊｃｈｉａ　ｃｏｌｔ
　ＲＹｔ−３１からの酵素である。（５）Ｈ１ｎｄ■は
ヘモフィラス　インフルエンザ　Ｒｄ　（Ｈａｃｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ　Ｒｄ）からの酵素
である。

仄に、プラスミドｐＵＨ１の理化学的性質を示す。

（１）納豆の粘質物を生産する情報がコードされた遺伝
子が組み込まれている。

（２）第１図に示す制限酵素開裂地図を示す。これらの
結果は、過剰量の１ｌｔｌＪ限酵素の存在下におけるＴ
ＩＵＨｌ　ＤＮＡの消化によって得られた。制限位置数
ハ０．７％又は１．４％アガロースゲル中における分割
可能な断片の数から決定された。

（３）分子量：約５．７キロベース。

（４）細胞当りのコピー数：６゜ （５）浮上密度ρ：　１．５７５　ｙ−／１ｒｌ（６）
異種ＤＮＡの組み込みニ プラスミドｐＵＨ１は、形質転換によ゛り宿主細菌へ導
入できる組換型プラスミドをつくるのに使用できる。組
換型プラスミドをつくる方法はこの技術分野で周知であ
る。プラスミドｐＵＨ１の特定的な位置を、制限酵素、
例えばＨｉｎｅ　ｎｔ　Ｐｖｕ　Ｉ［等によって開裂さ
せることができる。

環状ＤＮＡ分子であるプラスミドは、二本のＤＮＡ鎖を
特定の位置で切断する酵素により切断されるが、その個
所に異種ＤＮＡを組み込むことが可能である。異１．′
ｉｉｔ　Ｄ　Ｎ　Ａの組み込みは、開裂されたプラスミ
ドｐＵＨ１と異ｉＱ　Ｄ　Ｎ　Ａ及び７Ｆリヌクレオチ
ドリガーゼの存在下でインキュベートすることによって
新たなシラスミドを形成させることができる。

（力　形質転換の検知：粘質物を生産しない宿主に異ｆ
ｆｆｌ　Ｄ　Ｎ　Ａが組み込１れたシラスミドｐＵＨ１
を移入した場合、発現した菌はコロニーが著じるしい粘
性を示すようになるので検知が容易である。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１・・・バチルス・ズプチルス（ナツト−）アサ
ヒカワの微生物学的に純粋な培養基 からのプラスミドｐＵＨ１の単離： バチルス・ズプチルス（ナツト−）アサヒカワＦＥＲＭ
Ｐ−／）６２０の微生物学的に純粋な培養基からの胞子
を次のブイヨン培地（肉エキス１％、ポリズブトン１％
、及び０，５％ＮａＣＡ）の２００ａへ接種する。

培地ｕ　５１１　Ｑ　ｍｌ振トウフラスコ中で予め滅菌
しておく。接種後、フラスコを６７′Ｃで、往復振トウ
機上で１２時間培養する。栄養プロスで１２時間生育し
た培養物は新しい培地２００Ｈ＋ｔに接種され、６７°
０で６〜４５時間、往復振トウ機上で培養された。細胞
は遠心分離により収穫され、０．０２ＭＴｒｉｓ　（ハ
イドロキメチル）アミノメタｙ　−ＩＣ，＃　（１）１
１８．０　）、０．１　Ｍ　ＮａＣＡ及び５ｍＭＥＤＴ
Ａを含有する冷緩衝／’ｉ　（ＴＥＳ　　ｂｕｆｆｅｒ
）で洗滌された。

細胞は蔗糖２５％含有のＴ［＞Ｓ緩衝液３閏ｌに懸濁す
れた。エチレンディアミノテトラアセティクアシド（Ｅ
Ｉ）ＴＡ）（０２５門、Ｐ［１Ｂ、Ｏ＞を［１，５ｍｌ
とりゾチーム（２５％の蔗糖を含有するＴＥＳ緩衝液に
５　ｍ９７　ｍｅ　）の１．０　ｍｌを添加した。そし
て、混合物を６７°Ｃで３０分間インキュベートした。

プロナーゼＥ（３７°Ｃで１，５時間前身って消化した
ＴＥＳ緩衝液に５　’ｍ９　／　ｍｌ　）をＱ、　５　
ｍｌ添加し、そして、更に６７°Ｃで６０分間、インキ
ュベートを続けた。溶閃け、ソデイウム　ドデシルサル
フエイ）（ＳＤＳＩを１０チバ有するＴＥＳ緩衝故０５
ｍ１の添加によって室温で行われた。ＮａＣ，ｅ　（０
，５ｍｅ、５Ｍ）が添加され、そして全りＪモ合物は４
　’Ｃで一皮置力４−だ。その混合物は４８．０００　
Ｘ？で３０分間遠心分離され、そして、上澄液が１「明
な溶）膵液として得らノｔだ。

固型の塩化セシウムを６９ノと臭化エチディウム（Ｔ　
Ｅ　Ｓ　ｆＪｊ伽液に１　ｒｎ９／ｖｒｌ　）　３　ｍ
ｌが澄明な溶解液の０．５　ｍｌに添加された、そして
、溶液の密度は１、５７５ノ／　ｍｌに調節さｔ’ｔた
。その後、混合物はＢｅｃｋｍｎｎ　５０　Ｔｉ　ｏ−
ターを使って、１５°０で４０時間、６６．０００　ｒ
ｐｍで遠心分離された。かくして、共有的に閉場された
環状プラスミドＤＮＡの存在は、遠沈管内において、長
波の紫外線（３２０ｎｍ）照明下に、線状の染色体ＤＮ
Ａ及び線状プラスミドＤＮＡの強い螢光帯より下に淡い
螢光帯として目で認めることができる。

共有的に閉場された環状プラスミドＤＮＡは、特性化用
にはこれを勾配平衡物からとり出し、１　／　３１’ｉ
ｔのイソプロピルアルコールで２回処理して臭化エチジ
ウムを抽出し、水相を適当な緩衝液、例えば０．　Ｉ　
Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃｉｌｊ液（ＭａＣＡ　０．０１５　Ｍ、
−ニジ３Ｑ６Ｈｓ０７・２Ｈλｏ　Ｏ，ＯＯ１５Ｍ、　
ｐＨ７，４１に対して透析することによって本質的に純
粋なｐＵＨｌがイ１ｔられる。

ｐＵＨ１の特性化と早離手順； 分子量の＋９１ｑ、（、として、ファージＤＮＡのＩＩ
　ｉ　ｎ　ｄ１１１フラグメントを使って、０．７％ア
ガローズ　ゲル電気泳動によってｐＵＩ（１のサイズは
決定された。

ｐＵｒ（１の分子ｌは、ウエルアウアー等（ウエルアウ
アー・ヒ０−・ケイ、リーダー−アール・エイチ、キャ
ロル・シー・ブラウン、ディー・ディー・ダツチ、エイ
Φヒガイナカガワ、エイチ　＆　ダウイツト・アイ・ビ
ー、１９７４年、キセノプスラエビス〃）らの増幅され
た染色体ＤＮＡは不均質な開鎖長さを持つ、Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ、　Ｓ。

Ａ、７１．２８２３−’？８２７）。に従い５．７キロ
ベースであると割算された。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＵＨ１の制限酵素開裂地図を示す
図である。 代理人　弁理士　　戸　１）親　男

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）第１図に示される制限酵素開裂地図を有するプラ
   スミドｐＵＨ１゜
2. （２）プラスミドｐＵＨ１を含有するバチルス・ズブチ
   リス（ナツトｒ）アザヒカワ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｇｕｂ
   ｔｉｌｉｓ（ｎａｔｔｏ）　Ａｓａｈｉｋａｗａ）。