JPS592700A - 総ポリアミンの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、試料中のポリアミン及びそのアセチル体を酵
素学的に直接測定する方法に関する。

ポリアミンは、非蛋白質性低分子量の脂肪族塩基性化合
物で各種生理活性アミンの１種であり、生体組織や微生
物に広く分布して生体反応と深くかかわっている。そし
て、ヒトをはじめ哺乳動物の体液中には主にプトレシン
、カタベリン、スペルミジン、スペルミンとこれらの抱
合型（アセチル体）が存在している。

ところで、近来、体液中の総ポリアミンはヒトの癌の有
用な指標であることが知られている。即ち、癌患者の尿
、胃液、血液、腹水、胸水などの体液中の総ポリアミン
は、正常者と比べて明らかに増加が見られ、患部摘出や
物理的・化学的療法を施こすと減少するため、癌の診断
や治療効果の判定、予後の経過観察に応用できるものと
考えられている。しかも、これら体液中の総ポリアミン
の増加は特定の癌に限定されないため、迅速・簡易かつ
正確に測定できれば、癌のスクリーニングテストとして
大いに期待できる。

従来知られている生体試料中の総ポリアミンの測定方法
は、試料中の各種抱合型ポリアミンを強酸性下で６時間
程度１００℃にて加熱分解して遊離型ポリアミンとなし
く試料が血清の場合、その前に除蛋白操作が必要）、更
に有機溶媒で抽出してその抽出物を電気泳動法、ダンシ
ル誘導体−薄膚クロマトグラフィー法、ガスクロマトグ
ラフィー法、アミノ酸アナライザー法、或は高速液体ク
ロマトグラフィー法等で分析するものである。しがし、
これらの方法はいずれも検体の前処理の手技が複雑で長
時間を要し、更に分析においても特殊な装置や熟練した
技術を必要とするため、日常の臨床検査として実用され
るに至っていない。

このような欠点を是正するために、本発明者は研究の結
果、総ポリアミンを酵素学的に測定する技術を開発した
（特公昭５６−３６９１８　）。この方法は、発芽大豆
から抽出したポリアミンオキシダーゼ及びパーオキシダ
ーゼを用いるものであり、先ず検体を従来と同様に酸・
熱加水分解して抱合型ポリアミンを遊離型に変え、次に
検体中に共存するアスコルビン酸などの還元物質を除く
ため陽イオン交換カラムに通し、カラム中に吸着された
ポリアミン酸で溶出して中和後、これにポリアミンオキ
シダーゼとパーオキシダーゼ及び色原体を添加し、比色
又は蛍光法により総ポリアミンを測定する。この方法で
もやはり加水分解処理や陽イオン交換カラムによる共存
物の除去などの検体の前処理のため不便であり、実際の
臨床検査としては有用性に乏しい。しかも、共存物の除
去処理は時間と手間がかかるだけでなく、ポリアミンの
分離・溶出が完全に行なわれがたく、誤差の原因になる
欠点もある。

本発明はこのような現状にかんがみてなされたものであ
り、迅速・簡易にしかも特殊な技術や設備を要せずに、
癌のスクリーニングテストとして充分な程度に精確な体
液中総ポリアミンの測定方法を提供することを目的とす
る。

この目的を達成するために本発明者らは鋭意研究を重ね
た結果、現在判明している動物や細菌から抽出したポリ
アミンオキシダーゼは、特定の遊離型ポリアミンのみを
酸化するが、ある種の植物例えば豆科植物より抽出した
ポリアミンオキシダーゼは、各種の遊離型ポリアミンだ
けでなく抱合型ポリアミンをも酸化することを見い出し
、これらを用いると抱合型ポリアミンを遊離型にするた
めの加水分解処理が不要になると考えた。しかし、豆科
植物から抽出したポリアミンオキシダーゼにおいて抱合
型ポリアミンを基質とする場合のＫｍ値（ミカエルス定
数）が遊離型のそれに比してきわめて大きいため、加水
分解処理を除いた場合、特公昭５６−３６９１８号に見
られる酵素学的分析法におけるより大量（高活性単位）
の当該ポリアミンオキシダーゼを使用するか、長い反応
時間が必要であることが判った。そこで更に研究を続け
、アスコルビン酸オキシダーゼで試料中に共存する妨害
物質たるアスコルビン酸を酸化分解し、遊離型及び抱合
型（アセチル体）のポリアミンの両方を酸化して過酸化
水素を生成する作用を有する酵素により遊離型及び抱合
型のポリアミンを酸化し、該生成した過酸化水素を基質
とするパーオキシダーゼ様活性を有する酵素系の作用に
より色原体を酸化し、得られた発色物質あるいは蛍光物
質を比色法あるいは蛍光法によって測定する総ポリアミ
ンの測定方法を完成させた。

この方法によれば、遊離型及び抱合型ポリアミンを同時
に酸化できるため検体を加水分解処理する必要がなく、
またアスコルビン酸オキシダーゼで共存する還元物質で
あるアスコルビン酸を過酸化水素の発生を伴なわず酸化
分解するため陽イオン交換カラムを使用することもない
ので、極めて迅速・簡易に総ポリアミンを実〜用的に測
定できる。

したがって、癌の診断、治療効果の判定、転移・再発の
発見及び予後の観察などを目的とする臨床検査に有用で
ある。

本発明による総ポリアミン測定法には、アスコルビン酸
オキシダーゼ、遊離型及び抱合型ポリアミンの両方を酸
化する酵素、パーオキシダーゼ様活性を示す酵素系、色
原体、ｐＨ綾衝剤などを使用する。更に必要に応じて防
腐剤、安定化剤、反応抑制剤、反応促進剤などの各種添
加剤を加えることもできる。

アスコルビン酸オキシダーゼはアスコルビン酸を酸化し
てデヒドロアスコルビン酸に変える作用を有する酵素で
あれば伺んでもよく、きゅうり　　　′（Ｃｕｃｕｍｉ
ｓ　ｓｐ）　　ヤカＩｒｆ：チ４？　（Ｃｕｃｕｒｂｉ
ｔａｃｅａｅ　ｓｐ）を起源とするものが具体的に挙げ
られる。遊離型及び抱合型ポリアミンの両方を酸化する
酵素は、主にプトレシン、カタベリン、スペルミジン、
スペルミンとこれらのアセチル体を酸化して過酸化水素
を生成するものであれば何んでもよく、例えば発芽大豆
やアルファルファ又はクローバ−などを起源とするもの
が挙げられる。しかし特開昭５５−９６０９３号、特開
昭５６−９２７８７号あるいは特開昭５６−９２７８８
号に見られるような微生物を起源とするポリアミンオキ
シダーゼは、遊離型のスペルミジンとスペルミンだけを
酸化する作用を有するので、本発明には使用できない。

パーオキシダーゼ様活性を有する酵素系としては、過酸
化水素を基質としてこれを分解することにより色原体を
酸化することができるなら何んでもよく、代表的には西
洋ワサビや馬鈴署を起源とする酵素や血色素が挙げられ
るが、これらの酵素以外にヨウ化物とモリブデン酸塩、
金属ポルフィリン、フェロシアン化鉄などの化合物も同
様な働きを有するので使用が可能である。

色原体としてはパーオキシダーゼ様活性を示す酵素系と
過酸化水素により酸化されて光学的検出が可能な物質及
び物質群であれば何れも使用可能である。この内、光学
的検出手段が比色法の場合は、オルトジアニシジン、２
，２−アジノジ（３エチルベンゾチアゾリン）−６−ス
ルホン酸（ＡＢＴＳと略される）、バラジフェニルアミ
ンスルホン酸塩、４−アミノアンチピリン（以下４−Ａ
Ａと略す）とフェノール、オルトトリジン、３−メチル
−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾンとＮ、Ｎ−ジメチル
アニリン、４−ＡＡとジアゾレッドＲＣ，４−ＡＡと３
．５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）アニリン・ナトリウ！　（Ｄ　Ａ
　ＯＳと略す）、４−ＡＡとＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）−メタ−トルイジン・
ナトリウム塩（ＴｏＯ８と略す）などが用いられる。ま
た蛍光法の場合は、チラミン塩酸塩、４−ヒドロキシ−
３−メトキシフェニル酢酸、ホモワニリン酸などが用い
られる。好適な例としては、４−ＡＡとＴＯＯ５。

４−ＡＡとＤＡＯ８並びにホモワニリン酸が感度が高い
理由で挙げられる。ｐＨｆｌ衝剤としては各酵素反応に
対して至適なｐＨ条件を与えることができるものであれ
ば何でもよく、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、ホウ酸緩
衝剤などが使用できる。

しかして、本発明の方法で体液中の総ポリアミンを測定
するには、ｐＨｗＩ衝液にアスコルビン酸オキシダーゼ
、ポリアミンオキシダーゼ、色原体を溶解した溶液に適
量の検体を添加し、反応が終了するまで一定温度に保ち
、反応系を光学的（比色法又は蛍光光度法）に測定し、
予め求めておいた検量線に基づき総ポリアミン量を決定
する。但し、体液の種類によって測定方法の詳細が異な
るので、以下に例示的に詳述する。

まず尿中の総ポリアミンを測定する場合、ｐＨ５，５〜
７５．０．０２〜０．１０　Ｍのｐｆ（緩衝液０．５〜
２．０−にアスコルビン酸オキシダーゼ０．１〜５０Ｕ
／ｄを溶解させた溶液に、検体量０．０１〜０．２０＋
＋ｔｌ！を加えて、３分間以上一定温度（２０−４０’
Ｃ）で反応させ、尿中に共存するアスコルビン酸を酸化
分解する。次にｐＨ７，０〜９．０．０．０５〜０．２
ＭのｐＨ綬衝液１．０〜４．ＯＷＬｌにポリアミンオキ
シダーゼ２０〜５０　Ｕ　／　ｙｐｔｌ　、パーオキシ
ダーゼを溶解させた溶液を添加して、反応が終了するま
で（はぼ３０分以上）一定温度（２０〜４０’Ｃ）に保
ち、この反応液を比色測定する。尚、上記の場合用いる
ポリアミンオキシダーゼは尿検体１４当り１００〜５．
０００　Ｕとなるが、２０００以上、特に６００　Ｕ以
上用いることが好ましい。

これは、ポリアミンオキシダーゼが遊離型（フリー）の
ポリアミンに対しては低単位でも比較的短時間（５分程
度）で反応を完了させるが、抱合型（アセチル体）の場
合は反応しにくいことによる。例えば、第１図はある正
常者（同一人）の尿検体（総ポリアミン量は約１７０ｎ
　ｍｏｄｅ　／　ａｔに種々な単位数のポリアミンオキ
シダーゼを作用させた場合の吸光度と反応時間の関係を
示すものであるが、図から明らかな如く検体量に対する
酵素の単位数が少ない場合には、反応を完全に終了させ
るこきができないか、できても長時間を要することにな
る−（６００Ｕの場合２０分で定常状態となるが２００
Ｕでは６０分１００Ｕでは７０分以上かかる）。

一方、第２図は複数の被検者の尿検体について夫々１ｄ
当り６００　Ｕの酵素を用いた場合の吸光度と反応時間
の関係を示すもので、正常者（曲線■、■）及び癌患者
（曲線■〜■）の場合とも、総ポリアミン量及びアセチ
ル体の割合に応じて様々なパターンを描くが、いずれも
６０分前後でほぼ正常状態となる（吸光度０．３５が１
．ＱＯＯｎ　ｍｏｂ　ｅ　／　ｍｅに相当、第３図参照
）。

しかして、水洗を癌のスクリーニングテストに用いる場
合、所要時間は短かいほどよく（例えば３０〜６０分）
、そのためポリアミンオキシダーゼはなるべく高単位（
例えば６００Ｕ以上）用いるのが好ましいが経済的制限
がある０従って、約６０分で完全に反応が終了しなくて
も概ね反応を終らせるのに必要な１００〜２００　Ｕ程
度の使用でも実用的には差しつかえない。ちなみに、本
発明に先行する特公昭５６−３６９１８の方法では、尿
検体１〜ｌ当り０．５〜１００程度のものを用いた。

次に、血清中の総ポリアミンを定量する場合に溝中の総
ポリアミンの濃度が極めて低いので色原体として蛍光試
薬を用いることが特徴である。即ち、血清を０．１〜ｌ
　ｒｔｔｌ採り、１〜５−の除蛋白剤を加えて蛋白質を
沈殿除去した上澄液０．０５〜１．Ｏｒｔｔｌを検体と
し、これを尿の場合と同様に操作し、最終の反応液の蛍
光強度を測定する。ただ血清の場合総ポリアミンの濃度
が尿に比べて数十分の−であるので、ポリアミンオキシ
ダーゼも比較的低単位のものである。例えば検体１４当
り１５０Ｕ程度以上であれば実用的である。

更に赤血球の総ポリアミンを定量する場合には、してや
はり蛍光試薬を用いて測定する。赤血球試料の場合も尿
と同様の総ポリアミンが存在するので、ポリアミンオキ
シダーゼの単位数は尿の場合と同程度とすることが好ま
しい。

尚、前記した尿、血清赤血球以外の体液例えば胃液、腹
水、腕木、精液、更には生体組織中の総ポリアミンも同
様に除蛋白処理等の簡単な前処理の後ポリアミンオキシ
ダーゼとパーオキシダーゼを作用させることにより、簡
単確実に得られるものである。但し、癌のスクリーニン
グテスト等には、簡単に採取できる尿、血液を試料とす
ることが望ましいので、以下、尿、血清、赤血球につい
て実施例により更に詳しく本発明を説明する。但し本実
施例によって本発明の技術的思想や範囲を何ら制限する
ものではない。尚前述したもの及び本実施例に示すもの
以外に本発明の技術思想の範囲内で各種の化合物や薬剤
が使用でき、更に防腐、安定化、反応の制御・促進等の
目的で各種添加剤を加えることも自由である０ 実施例　１　尿中総ポリアミンの定量 （試薬） 試薬 アスコルビン酸オキシダーゼ　　　　　　　　　　　４
Ｕ／ｍｌＤ　Ａ　ＯＳ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　Ｏ，２ｔｎｙ／ｄ０．０５Ｍ−リン酸緩衝液
（ＰＨ６，５）試薬Ｂ ポリアミンオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　３０
ｔＪ／ｄパーオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　
　　２Ｕ／ｎｔ１４−　Ａ　Ａ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　０．２ｍｙ／ｌｎｌｎ１００Ｉリン酸
綬衝液（ｐＨ８，ｏ）標準液（１ρ００ｎ　ｍｏｉｒｅ
　７〜ｌ　）スペルミジン・３塩酸塩　　　　　　　　
　　　２５．４６ｒｎｆ！精製水　　　　　　　　　　
　　　　全量１００尻ｌ（尿１ｍｇ当りポリアミンオキ
シダーゼ６００Ｕ）検体、標準、盲検の吸光度をそれぞ
れ（Ｓ）、　（Ｓｔ　）。

（ＢＪ、）　　とすると、検体中の総ポリアミン濃度は
、以下の式にて算出される。

尚、標準液及びその希釈液の濃度と、それぞれの吸光度
から盲検の吸光度を差し引いたものとの関係を第３図に
示す。

（再現性テスト） ３人の尿について再現性試験を行った結果表−２に示す
通りであった。

表−２ 再現性テスト （単位：ｎ・ｍｏｌｅ／ｍ１） （他ユｔとの相関） 本願発明者により特公昭５６−３６９１８号で明らかに
した方法（以下「加水分解ミニカラム法」と呼ぶ）と本
流との相関を調べた。結果番よ次のと初りであった（表
−３及び第４図）０ 表−３ 他流との関係 〔単位−がｍｏｌｌｅ／１ｔｔ１３ 相関係数　　０９４６ 回帰直線　　Ｙ　＝　１．０６３　＋　７．２０実施例
　２　血清中総ポリアミンの定量（試薬） 除蛋白試薬（０，３３Ｍ過塩素酸水溶液）６０％過塩素
酸　　　　　　　　　５５．２５ｆ精製水　　　　全量
１０００ｍ／ １％水酸化ナトリウム溶液 水酸化ナトリウム　　　　　　　　　　１ｆ精　　製　
　水　　　　　　　　　　　　　　全ｆｆ１ｌｏＯｄ発
色液 ポリアミンオキシダーゼ　　　　　　　　　　５　’／
ｙｔｌアスコルビン酸オキシダーゼ　　　　　　　　　
　　　１　　’／ｍＡ’パーオキシダーセ０．５　　ｕ
／ｍｅ ホモワニリン酸　　　　　　　　　　　　　０．０１〜
／−〇、ＩＭ−リン酸緩衝液 標準液（！ｉ　ｎ　ｍｏｌｅ　／ｎｔｌ）スペルミジン
　　　　　　　　　　　１．２７　ｍｇ精　製　水　　
　　　　　　　　　全量１０００ｄ（測定操作） 血清０．５ｄに除蛋白試薬２．Ｏｔｒｔｌを加え、十分
混和後３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄を検体と
する。

表−４ （血清１ｍＡ！当りポリアミンオキシダーゼ２５０Ｕ）
検体、検体盲検、標準液、盲検の蛍光強度をそれぞれ〔
Ｓ〕、（Ｓ　−Ｂｌ叉（Ｓｔ）、（Ｂｕ）とすると、検
体中の総ポリアミン濃度は以下の式にて算出される。

（測定結果） 正常人血清１０検体を用いて測定したところ０．７〜１
．３　ｎｍｏｊ！ｅ／　ｒｔｔｌの１直を得た。

表−５ 実施例　３　赤血球層ポリアミンの定量（試薬） ポリアミンオキシダーゼの濃度を１１５とするほかは、
実施例２と同じ。

（測定操作） 血液をヘパリン人採血管に採取し、十分混和後８．００
Ｏｒｐｍにて１０分間遠心分離する。血漿及び上層の白
血球、血小板をアスピレータで除去した後、生理食塩水
を数−加え十分混和洗浄し、３．００Ｏｒｐｍにて遠心
分離したのち、上層を除去する。さらに２回赤血球を生
理食塩水で洗浄し、遠心分離して上層を除去し赤血球層
を得る。この赤血球層より０．１０＋＋ｔＡ’を試験管
に採り、除蛋白液２：Ｏｍｌを加え、十分混和後８ρ０
０ｒｐｍで１０分間遠心した上澄を検体とする。

、／″′ 表−６ 反応液の組成 （赤血球１罰当りポリアミンオキシダーゼ４２０　Ｕ　
）検体、検体盲検、標準液、盲検の蛍光強度をそれぞれ
（Ｓ）、（Ｓ−Ｂｒ）、（Ｓｔ）、（Ｂｊ）　　とする
と検体中の総ポリアミン濃度は、以下の式にて算出され
る。

（測定結果） 正常人赤血球１０検体を用いて測定したところ加〜４０
ｎｍｏｌｅ／−の値を得た。

表−７ 以上詳述したように、本発明は、試料中の総ポリアミン
量を酵素を用いて測定する方法において、アスコルビン
酸オキシダーゼの使用によりアスコルビン酸を分解させ
、且つ遊離型とともに抱合型のポリアミンをともに酸化
させるものであるところから、分離分析のための特殊な
装置や手技を必要とせず、また試料検体の加水分解処理
や共存する妨害物質の除去のための陽イオン交換カラム
処理をすることなく、光学的に簡単に測定できるもので
ある。従って、従来特殊・高度な技能を必要とした総ポ
リアミンの測定が簡単な操作で迅速且つ正確に行なえ、
大量の試料の分析も容易に行なえるので、特に癌の臨床
検査分野に多大な貢献をなすものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は正常者の尿検体１ｎノ当りのポリアミンオキシ
ダーゼの単位数を変えた場合における反応時間と吸光度
の関係を示すグラフ、第２図は正常者（曲線■、■）と
癌患者（曲線■〜■）の尿検体の発色タイムコースを示
すグラフ、第３図はポリアミン１ρ００ｎ　ｍｏｄｅ　
／　ｍｌの標準液及びその希釈液の濃度と吸光度の関係
を示すグラフ、第４図は加水分解−ミニカラム法と本発
明方法との測定値の相関関係を示すグラフである０ 時間　−一中 正党考の束１ｍｌ当りの　ｒり了ミンイキシダーゼ阜住
数１」る吸光度と反応時間の関係 第２図 犀孜伴の令色タイムコース （生麩ｅ　Ｉ　ｍｌ　当’Ｊ　　百ｕｌｌ！　６０ｐ　
Ｌｌ　）第４ｒｉＪ −５５６

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １　アスコルビン酸オキシダーゼにより試料中に共存す
   るアスコルビン酸を酸化分解し、遊離型及び抱合型のポ
   リアミンを酸化して過酸化水素を生成させる作用を有す
   る酵素により遊離型及び抱合型のポリアミンを酸化し、
   生成した過酸化水素と色原体をパーオキシダーゼ様活性
   を有する酵素系の作用により反応させ、得られる物質を
   光学的に測定することを特徴とする総ポリアミンの測定
   方法。