JPS5928257B2 - 免疫化学的固定化用の疎水性膜、該膜の製法、および該膜を用いた定量的検出装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は有機質膜ならびにその製造および使用に関し
ている。

ある蛋白質と他のある種の蛋白質との特異的反応は公知
であり、例えば動物体内でのある種の抗原に対抗する特
定の抗体の発生は公知である。このある蛋白質の他に対
する特異性は、特定の溶液中に存在する特定の蛋白質を
分離する親和性（Ａｆｆｉｎｉｔｙ）クロマトグラフイ
に既に用いられている。２種の化合物の間の撰択的反応
は、多数の物質について存在する；したがつて、ホルモ
ンおよび酵素を含む蛋白質、ポリおよびモノサッカラー
ドは撰択的に特定の化合物と反応し、そしてこれらのす
べての反応はこの明細書では免疫化学反応（Ｉｍｍｕｎ
ＯｃｈｅｍｉｃａｌｒｅａｃｔｉＯｎ）と称する。

便宜上、以下においては主として蛋白質反応性基同志に
ついて述べるが、特異的共反応性化合物または基の適当
な他の組合せも、蛋白質反応性基同志の代り用いられる
ことが理解できる。親和性クロマトグラフイ物質、例え
ば充填カラムは、蛋白質反応性化合物が結合できる反応
性サイト（極性性質に基ずく）を有する親水性重合性表
面から作られる。

基質の親水性は蛋白質の結合により悪影響を受けない。
蛋白質分子例えば緩衝溶液の抗体または抗原は正昧電荷
を有し、その強度および極性は蛋白質の等電点および緩
衝溶液の組成に左右される。

この電荷は抗体一抗原反応の結果変化する。電荷の正昧
変化は検知すべき強度であるが、親水性膜上の蛋白質の
固定は不満足である、なぜならば親水性基質の極性基へ
の水のイオン作用は免疫化学反応によりもたらされる電
気的ポテンシヤル変化を打消す程大きいからである。こ
こに本発明者等は、導電体上に沈着されている疎水性重
合体の表面に対してすべての抗体が共有結合されたとき
には、重合体／溶液界面の表面電荷がその固定化された
抗体の正昧電荷に左右されることが判明した。

その溶液中に対応する抗原が存在し、また抗体の結合サ
イトが固定化（すなわち重合体への結合）中に駆逐され
てしまつていないときには、免疫化学反応が該界面で起
き、表面電荷の変化をもたらす。この表面電荷の変化は
同じ溶液中に浸漬した参照電極との比較で電位差として
測定できる。蛋白質を固定する性質を有する疎水性膜を
発明した。

膜は溶剤の作用で膨潤できかつ適当な反応性基を有する
炭化水素、通常は脂肪族炭化水素化合物を溶剤系から吸
着できる疎水性重合体の基質よりなつている。得られる
疎水性膜はこれから側鎖状に伸びた蛋白質との反応性基
、例えばオキシラン基（エポキシ基）および他の蛋白質
反応性基を含む本質的に炭化水素鎖のを有している。こ
の炭化水素鎖は炭素一炭素結合以外の結合例えば工ーテ
ル結合を有することもあり、この発明の目的にはこれも
゛本質的に炭化水素の鎖１と考える。したがつて、この
発明の一態様によれば、ある化合物と特異的に反応性の
基を有する側鎖状の、本質的に炭化水素の鎖を有する疎
水性重合体よりなる特異反応性膜を提供する。好ましく
は膜は、ポリペプタイドと特異的に反応性の基を末端に
有する炭化水素鎖よりなつている。好ましくは、反応性
基を蛋白質反応性基と接触させて蛋白質反応基を鎖を介
して膜に結合させることにより特異的に蛋白質と反応す
る基に結合できる反応性基をそれぞれ有している炭化水
素鎖を有している。蛋白質反応性基は抗原または抗体で
あるのが便利である。蛋白質固定化能を有する疎水性膜
は、高導電性電極例えば白金をカプセル化するのに用い
る。

特定の蛋白質（例えは抗原）との反応に撰択性を有する
ある蛋白質（例えば抗体）を蛋白質反応性サイトで反応
させる。このような被覆電極を対照電極と結線して抗原
含有水溶液に浸漬すると、免疫反応抗体で電極による特
定蛋白質（抗原）の獲得により生じる溶液一重合体界面
の電荷の変化を測定できる電気的感受系を与える。さも
なければ、抗原を膜上に固定して抗体を撰択的に獲得す
ることもできる。したがつて、この発明の第２の態様で
は、特異的反応性膜の鞘の内にカプセル化した電極を与
える。

この発明のさらに別の態様によれば、混合物を化合物と
特異的に反応性の膜内に包んだ電極と接触させて得られ
る膜上の電荷の変化を検知することにより、他の分子例
えば溶剤分子とともにある化合物を含む混合物中の化合
物の存在および場合によつては濃度を検知する方法を提
供する。

これは適当な対照電極との比較により行うのが便利であ
る。撰択的免疫化学能力を有する疎水性重合性膜（即ち
、特異的反応性膜）は、疎水性重合体の膜を形成するこ
とで作られる。

重合体は、好ましくは有機溶剤または溶剤混合物、特に
脂肪族溶剤で膨潤できるものである。この発明の実施に
際し、特に有用な重合体は、側鎖状極性基を有しない疎
水性重合体である。

この目的に適した代表的重合体には、熱可塑性重合体例
えばポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポ
リプロピレン、シリコンラバー、ポリウレタン、ポリカ
ーボネート、ポリテトラフルオロエチレンおよび類似物
がある。熱硬化性重合体、例えばエポキシ樹脂および架
橋結合ポリエステルも用いられる。好ましい重合体は、
浸漬キヤステイングまたは収縮固着により電極上に被覆
したものである。重合体膜は、次いで膜を膨潤できる溶
剤系で、少なくとも炭化水素鎖が膜に充分に組込まれる
程に俣を膨潤させるに充分な濃度（後述してある）およ
び時間で膜を処理する。

溶剤系は、適当な溶剤以外に反応性サイトを好ましくは
炭化水素鎖の一端またはその近辺に有する炭化水素化合
物を含んでいる。重合体膜を膨潤するのに用いる溶剤は
、重合体の乾燥により容易に除去できるものが好ましい
。したがつて、高分子量溶剤よりも低分子量溶剤の方が
好ましい。後述の通り、低沸点で反応性サイトを有する
炭化水素化合物よりも易揮発性のものが好ましい。ポリ
塩化ビニル用の代表的溶剤混合物は、沸点範囲３０〜６
０℃の石油エーテルとトルエンよりなつている。他の溶
剤またはその混合物もポリ塩化ビニルまたは他の重合体
の膨潤に用いられ、これらは当業者に公知であるかまた
は簡単なテストで決定できる。代表的な反応性サイトを
有する炭化水素化合物は、ｎ−デカノ一ルである。

この発明に特に有用な他の化合物は、ｎ−へキサノ一ル
、ｎ−デシルアミン、ｎ−へキシルアミン、ｎ−デカノ
ン酸および移動し易い水素を有する類似化合物である。
重合体膜を、所望程度の膨潤を行うに充分な長さの時間
浴剤系に浸漬後、膜を反応性サイトを有する炭化水素化
合物の実質的量を除去することなく溶剤を除去するに適
当な温度で乾燥する。石油エーテル、トルエンおよび類
似沸点範囲の溶剤を用いたときには、代表的乾燥温度は
約５０〜１００℃、好ましくは５０〜６０℃で、減圧下
が好ましい。溶剤の除去は、各鎖は反応性基例えばヒド
ロキシ、アミンまたはカルボン酸基を有する側鎖状炭化
水素鎖の低濃度を有する膜を与える。溶剤の撰択（した
がつてその沸点）および溶剤除去に用いるべき圧力の撰
択は、膜および炭化水素化合物の特性および性質に関し
てなされる。

用いる重合体はその膨潤のために公知の溶剤を有してい
る。重合体膜への炭化水素鎖の結合に引き続き、連の処
理を行つて特異的反応性膜、即ち特定の化合物例えば免
疫化学的反応における蛋白質、酵素、またはモノまたは
ポリサツカライドを獲得する能力を有する膜を与える。

炭化水素鎖を膜に導入する前に、適当な特異性反応基を
炭化水素鎖に与えることができる（この場合はもちろん
反応基は反応性を示すのに自由にする、好ましくは膜か
ら約４〜６炭素原子以下に位置しないようにすることが
必要である）、あるいは反応性基を膜に結合後反応性基
を炭化水素鎖に導入する。

特異的反応性基は、膜を炭化水素鎖と反応して必要な特
異的反応性を与えられる適当な物質と接触させて得るか
、または結合基を用いて炭化水素鎖上の反応性基を適当
な特異的反応性基に結合させる必要がある。このような
変法は当業者には明白であり、適当な順序の撰択は関聯
する各種の物質および基の特性に関して行はれる。した
がつて、蛋白質に対する結合基の使用は次の順序である
。重合体膜を乾燥後、特異的蛋白質反応性サイトおよび
膜に結合した炭化水素鎖の反応性基と反応性の他の反応
性サイトを有する化合物を含む溶液に浸漬する。

例えば、もし炭化水素鎖の反応性基がヒドロキシ基であ
れば、用いられる代表的な蛋白質反応性化合物はエポキ
シドエーテル結合基を形成したエピクロルヒドリンであ
る。他の炭化水素分子でエピクロルヒドリンまたは一対
のオキシラン環が反応のために存在するビスエポキシド
と反応できるもの、例えば脂肪族アミン、好ましくは第
１級および第２級アミン、カルボン酸基含有脂肪族化合
物も膜に導入することができる。膜表面から側鎖状とな
つている一対の側鎖状基の間に架橋結合がないのが好ま
しい。重合体膜からの脂肪族アルコールペンダントに適
した一連の処理法を以下に示す。

アミノ基を有する蛋白質はオキシラン基と反応して膜に
結合し、免疫化学型反応において特定蛋白質を捕捉しう
る固定化蛋白質を膜に与えることができる。

固定化蛋白膜を調製するその他の技法としては例えば次
のものがある。

（ａ）チオフオスゲンまたはイソシアネート・カツプリ
ング別の蛋白カツプリング系においては、炭化水素鎖と
蛋白分子との間にジイミド結合を形成させる；カルボキ
シル基を有する脂肪族化合物とカルボジイミドと反応さ
せ、反応生成物を適当な蛋白と反応させる。

蛋白反応性結合化合物（すなわち固定化基を有する化合
物、例えばエピクロルヒドリンを、膜から垂架している
分子鎖の不安定水素と反応させて蛋白結合基を生成させ
た後、好ましくはそれを洗浄し、固定化されるべき蛋白
を含有する溶液中に置く。

好ましい反応温度は室温であり、一般に１〜２日間にわ
たつて反応を進行させるのが好ましい。反応は一般にわ
ずかに塩基性の媒質中で行なわれる。蛋白を結合させた
後、それを処理して未反応物質の残部を洗浄除去し；さ
らに、蛋白分子との反応後に残つた未反応蛋白反応性（
すなわち固定化）基を中和するための化合物と反応させ
る。

（未反応の蛋白反応性基は本来極性を示す傾向があり、
またそれらが諸蛋白と非特定的に反応して蛋白検出器に
おける誤差結果を与えるので望ましくない）。本発明の
方法の実施において、膜の表面から反応性基を、いく分
、離れた位置にする充分な鎖長を持つ炭化水素化合物を
用いるのが一般に好ましい。本発明によつて使用される
炭化水素化合物は、一般に、主鎖長に少なくとも６炭素
原子をもつ。好ましい鎖長は、炭化水素化合物の主鎖が
約８〜１２炭素原子を含むものであり、多くの場合好ま
しくは、特定反応性基が膜面から少なくとも４炭素原子
、好ましくは少なくとも６ないしは８炭素原子、離れる
ように選択される。炭化水素化合物と反応させられる蛋
白反応性結合化合物が充分な鎖長を有するものであり、
最終的な蛋白反応性基が膜面から少なくとも６炭素原子
によつて垂架されているような場合には、炭化水素化合
物の鎖長は前記の長さである必要はない。装置 本発明の新規な膜は、所定の混合物（例えば特定化合物
を含む溶液）中の特定化合物の存在を定性的にそして好
ましくは定量的に検出する装置に利用できるので、特に
有用である。

反応性基をもつ炭化水素鎖を含む疎水性重合体膜の鞘を
約１０〜５０ミクロンの厚さで測定用電極（免疫電極）
上に形成する。

約２０〜４０ミクロンの厚さが特に好ましい。膜は好ま
しくは１００ミクロンを越えず、そして厚さが５ミクロ
ンより小さくない。免疫化学対蛋白または他の特定化合
物は膜において固定される。測定用電極は参照電極と組
合せて用いられる。両電極は、同定されるベき目的タイ
プの蛋白または他の化合物を含む混合物（典型的には溶
液）中に浸漬される。測定用電極および参照電極は、極
めてわずかな電位差変化を感受するメーターに電気的に
接続されている。特定蛋白が測定用電極によつて捕捉さ
れると、重合体一溶液界面における電位差が変化する。
僅少な電位差変化は、電極回路において高インピーデン
スをもつメーターによつて検出され、かくして化合物の
存在が示される。キヤリブレーシヨンすることにより、
そのメーターを、溶液中に存在する化合物の量を定量的
に測定するのに用いることができる。参照電極は公知の
多くの適宜な電極材の広範囲のいずれのものでもよいけ
れども、参照電極として、測定用電極と実質的に同じで
あるが特定反応〜性部位を適切な反応性ブロツキング剤
でブロツクして参照電極が特定の被検物質にもはや応答
しないようにした、第二の免疫電極を用いるのが有利で
あることを見出した。

しかし、そのような参照電極は、測定用電極と同じく、
溶液中の他の分子の非特定的吸収に応答するので、その
ような非特定的吸収が生ずる場合は非特定的吸収の効果
は補償されうる；例えば活性測定用免疫電極の電位をブ
ロツク剤の固定化サイトを有する同型（参照）免疫電極
の電位に対して測定することにより、非特定的相互作用
の効果は効率的に除去されうる。実施例 １白金電極を
ポリ塩化ビニル溶液中に浸漬して白金電極上に蛋白固定
化膜を形成した。

その被膜を乾燥し、厚さ約２５ミクロンの被膜を得た。
ポリ塩化ビニルで被覆した電極を、室温で３時間、溶媒
溶液中に浸漬した。溶媒は４．５容量部の石油エーテル
および４．５容量部のトルエンからなり、１容量部の炭
化水素ｎ−デカノ一ルを含んでいた。電極を次いで、約
１６時間５０℃の減圧炉中に置いた。乾燥電極を、１モ
ル苛性ソーダ溶液に１０％のエピクロルヒドリンを含む
溶液中に、約６０℃で２時間浸漬した。

次いで電極を蒸留水で洗浄し、蛋白コンカナバリンＡを
含むＯ．５モル重炭酸ソーダ溶液中に室温で約４８時間
置いた。測定用免疫電極を次いで、その溶液から取り出
し；０．５モル重炭酸塩緩衝液で、１モルの食塩を含む
ＰＨ３．Ｏ＜１７）Ｏ．１モルフタル酸水素カリ緩衝液
で、蒸留水で、そしてＯ．５モルのエタノ一ルアミン溶
液を含むｐＨ７．８のＯ．１モルトリス（オキシメチル
）アミノメタン緩衝液で順次に洗浄した。

（エタノールアミンは未反応エポキシ基をブロツクする
ために用いた）。次いでこの測定用電極を測定メーター
を介して参照電極に電気的に接続した。

両電極間の接続系内に大きなインピーダンスを与えるこ
とは一般に望ましい。コンカナバリンＡは、非還元性の
アルフア−Ｄ−へキサピラノジルまたはベータ−Ｄ−フ
ラクトフラノジル末端基を含むある種の分技多糖類を選
択的に沈澱させることが知られている。酵母マンナンは
このような群に属し、最も反応性であることが知られて
いる。ＰＨ６．０およびｐＨ３．５における酵母マンナ
ンの濃度変化に対するコンカナバリンＡ免疫電極の応答
を第１図に示す。系の電位は酵母マンナン溶液の濃度に
よつて変ることが示された。しかし測定溶液に対して寒
天溶液を添加したときには、電位変化は観察されなかつ
た。寒天はコンカナバリンＡと反応しない多糖類である
。寒天を添加したときの系の電気特性が変化しないこと
は、コンカナバリンＡ選択性は疎水性膜によるその固定
化に拘らず保持されていたことを示す。実施例 ２ 第３図に免疫電極特性の他の例を示す。

免疫電極を実施例１のようにして作つた。

ラビツトの抗人間７Ｓガンマグロブリンを側鎖状エポキ
シ基と反応させた。免疫電極を次いでＰＨ５．００の人
間７Ｓガンマグロブリン溶液中に浸漬し、その溶液濃度
を変化させた。濃度変化は電気的に検出された。ラピッ
ド抗人間７Ｓガンマグロブリンと人間７Ｓガンマグロブ
リンとの間の免疫化学反応はＰＨ７．８で起らないこと
が知られている。

固定されたラピッド抗人間７Ｓガンマグロブリンを含む
免疫電極を、人間７Ｓガンマグロブリン溶液中に浸漬し
たとき、電気的応答は認められなかつた。疎水性重合体
膜土である化合物が固定されてもなお免疫化学反応は残
つていた。好ましい電極材は白金であるけれども、任意
の他の適当な導電物質である金属（例えば銅、銀）また
は非金属（例えば炭素）を使用できる。

電極は適宜な形状、例えばロツド、ワイヤまたはシート
状であつてよい。膜によつて被覆されていない電極の表
面域を絶縁することは望ましく、これは別の方法で電極
の露出部分（適当な場合にはそれに関連した導線の露出
部分をも）を適当な絶縁材内に封入することによつて都
合よく達成される。

例えば白金についてはガラス絶縁材を用いるのが好まし
いけれども、その他の材料例えはＰＴＦＥも使用できる
。

【図面の簡単な説明】

第１図はＰＨ６．ＯおよびＰＨ３．５におけるマンナン
の濃度変化に対するコンカナバリンＡ免疫電極の電気的
応答（２５℃において）を示す曲線グラフ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 免疫化学反応対の片方を表面に固定化して有する免
   疫化学的固定化用の疎水性膜であつて、（ａ）有機溶剤
   により膨潤されうる疎水性重合体の基質、（ｂ）上記重
   合体基質の表面中へ部分的に吸着されその長さが少なく
   とも６個の炭素原子に相当すす炭化水素鎖であり、かつ
   免疫化学反応対の片方の化合物と反応性の反応サイトを
   その吸着されていない部分に結合して有する上記炭化水
   素鎖、および（ｃ）上記炭化水素鎖の反応サイトと反応
   させて固定化した免疫化学反応対の片方、からなる免疫
   化学固定化用の疎水性膜。 ２ （ａ）疎水性重合体基質を、その重合体基質を膨潤
   しうる溶剤および一端部から少なくとも６個の炭素原子
   の位置に反応性サイトを有する脂肪族化合物からなる溶
   剤系で処理し、（ｂ）その溶剤を負荷した重合体基質を
   実質的にすべての溶剤を除去するように乾燥して、基質
   の表面に部分的に吸着されそしてその非吸着部分に上記
   反応性サイトを有する脂肪族鎖を、付着した基質とし、
   そして（ｃ）その乾燥基質を、上記脂肪族鎖の反応性サ
   イトと反応しうる反応性基を有する免疫化学反応対の片
   方で処理して、上記重合体基質から側鎖状に伸びた免疫
   化学反応性基をもちその免疫化学反応性基が免疫化学反
   応性対の他方と反応してそれを固定化しうるようになつ
   ている基質とする、ことからなる、免疫化学的反応性対
   の片方を側鎖として有する疎水性膜の製法。 ３ 免疫化学反応を利用して免疫化学反応対の片方の固
   定化された化合物と反応性の化合物の存在を検出するた
   めに電位差を定量的に測定する装置であつて、（ａ）参
   照電極と、 （ｂ）（ｉ）金属導電体、（ｉｉ）有機溶剤により膨潤
   されうる疎水性重合体の基質；上記重合体基質の表面中
   へ部分的に吸着され少なくとも６個の炭素原子に相当す
   る長さであり、しかも免疫化学反応剤の片方と反応性の
   反応サイトをその吸着されていない部分に有する炭化水
   素鎖；および上記炭化水素鎖の反応サイトと反応させて
   固定化した免疫化学反応対の片方；からなり、上記導電
   体を包囲被覆している鞘からなる反応性電極と、（ｃ）
   電位差の微小変化を測定しうるメーターを介して上記参
   照電極と上記反応性電極とを接続する導電手段と、から
   なる上記定量的測定装置。