JPS5928536B2 - ヒト蛋白質を基礎とする血液凝固促進製剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は凝固ファクター■、■、■およびＸを含有し、
かつファ・フタ−■阻害物質迂回作用を有するヒト蛋白
質を基礎とする血液凝固促進製剤に関する。

ファクター■阻害物質迂回作用、略して、’ＦＥＩＢＡ
“（Ｆａｃｔｏｒ Ｅｉｇｈｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒ−ＢｙｐａｓｓｉｎｇΔｃｔｉｖｉｔｙ ）を示す
血液凝固促進製剤は知られている。

このような製剤の製造法はオーストリア特許第３５０７
２６号（米国特許第４１６００２５号および西独特許公
開第 ２７３４８２１号に対応）に記載されている。

その血液がファクター■に対する阻害物質を含有してい
る血友病Ａ患者の治療に該製剤が成功裡に適用されてい
る。

ＦＥＩＢＡファクターの化学構造はこれまで知られてい
ない。

このファクターには分子量約１０００００の蛋白質が含
まれていることだけが知られている。

上記特許明細書による製剤の製造法は、遊離カルシウム
イオンの不存在下にクエン酸イオンを含有するヒト血漿
を水不溶性無機凝固性生理的界面活性剤、例えばシリカ
ゲルやカオリンなどで処理したのち、吸着、溶離させ、
その組成の記載がないファクター■、■、■およびＸ、
ＦＥＩＢＡファクターおよび他の蛋白質の混合物を得る
ことからなる。

上記のように、西独特許第２７３４８２１号による製造
法はファクター■阻害物質を持った患者の治療に有効で
あることが判明したが、適応範囲の拡大やさらにＦＥＩ
ＢＡ製剤の適合性改良、とくに凝血形成効果や血管への
作用などの好ましくない副作用を最小限に低下させる作
業が必要となる。

本発明によれば、この課題は、 ウニスラー（Ｗｅｓｓｌｅｒ ）の血栓症誘発活性試験
において家兎体重１ｋｇ当りＦＥＩＢＡ少くとも２単位
相当量まで凝血形成作用を示さず、 少なくとも、ＦＥＩＢＡ濃度が１０単位／ｍｌまでの該
製剤の水溶液は、カリクレイン活性およびブレカリクレ
イン賦活剤活性を示さず、 ファクター■活性を有する蛋白質がＦＥＩＢ活性を有す
る蛋白質よりも低いＮａＣ１濃度で溶離するようにＮａ
Ｃ１濃度勾配を設けることによって硫酸デキストランア
ガロースを用いた親和性クロマトグラフィーにて分離可
能であり；そして上記のファクター■活性を有する蛋白
質およびＦＥＩＢ活性を有する蛋白質を含有する溶離液
は、電気泳動にて分離するとき、α−グロブリンおよび
β−グロブリンを含み、その分離曲線にはα−グロブリ
ン領域に全蛋白質の６０〜８０％に相当する主ピーク、
それに引続いて全蛋白質の１０〜２０％に相当する肩部
、ならびにβ−グロブリン領域に前記肩部に続く全蛋白
質含量の１０〜２０％に相当する僅かにそれとわかるピ
ークが存在する、ことを特徴とする凝固ファクター■、
■、■およびＸを含有し、かつファクター■阻害物質迂
回作用を示す、ヒト蛋白質を基礎とする血液凝固促進製
剤を提供することによって解決された。

本製剤の上記特長、すなわち凝血形成作用の不存在およ
びカリクレイン作用またはプレカリクレイン賦活剤活性
（血管作用の原因）の不存在は、本製剤が優れた適合性
を有することを示している。

血栓症誘発活性試験、カリクレイン活性試験およびブレ
カリクレイン賦活剤活性試験は当該技術の専門家にはよ
く知られている。

これらの試験は実施例の後でさらに詳細に記載する。

本発明による製剤の第３の特長、すなわちこの製剤をＮ
ａＣ１濃度勾配により、硫酸デキストランアガロースを
用いた親和性クロマトグラフィーで分離し得ることを第
１図に例示した。

硫酸デキストランアガロースを用いた親和性クロマトグ
ラフィー法は当該技術の専門家にはよく知られている〔
ティー・ニス・ペラパーおよびシー・プロウゼ（Ｄ、
Ｓ、ＰｅｐｐｅｒｌＣ，Ｐｒｏｗｓｅ）、トロンボシス
。

リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）
、１１（１９７７）、６８７−６９２）。

硫酸デキストラン（分子量５０００００）をＣＮＢｒ活
性化セファロース４Ｂ〔ファルマシア・ファイン・ケミ
カルズＡＢ、ウプサラ、スエーデン（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａＦｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＡＢ、ＩＵｐｐ
ｓａｌａｌＳｗｅｄｅｎ）に結合する。

かくして得られる硫酸デキストラン・セファロースを０
．４％クエン酸トリナトリウム２Ｈ２０溶液（ｐＨ＝７
．４ ）中で平衡化し、カラムに充填する。

検査される試料をカラムに注加したのち、塩化ナトリウ
ム含有０．４％クエン酸トリナトリウム２Ｈ２０溶液（
ｐＨ＝ ７．４ ）を用い、その塩化す） ＩＪウム濃
度を増加させて分別溶離を行う。

第１図には横座標上に溶離液のフラクション数を記入し
た。

左縦座標上には凝固ファクター活性をｍ１当りの単位と
して記入し、右縦座標上には塩化ナトリウム濃度勾配を
モル／ｌとして記入した。

濃度勾配の直線をＧ線として記入した。

第１図から明らかなように、ファクター■活性を有する
蛋白質は塩化ナトリウム濃度０．１〜０．５モルの領域
で溶出し、０，３モルで最大値をとる。

ＦＥＩＢ活性を有する蛋白質は０．３〜０．５モルの領
域で溶出し、０．４モルで最大値をとる。

増大する塩化ナトリウム濃度は塩化ナトリウム０〜０．
６５モルにわたる塩化ナトリウム勾配Ｇによって示され
ている。

最後に本発明による製剤の第４の特長は、電気泳動的に
分離した場合の特徴的なグロブリン含量であって、これ
を第２図に示す。

第２図の上部は、ファクター■活性を有する蛋白質およ
びＦＥＩＢ活性を有する蛋白質を含有する本発明による
溶離液の、一例として硫酸デキストランセファローズク
ロマトグラフィーによる分離曲線を示すが、第２図の下
部は純粋なヒト血漿の電気泳動による分離曲線を示す。

この例においてα−グロブリン領域の主ピークは全蛋白
質量の７０％に達することがわかる。

α−グロブリン領域で主ピークに次いで全蛋白質含量の
１４％に達する肩部が続き、その肩部に続いて全蛋白質
の１６％に達する僅かに目立ったピークがβ−グロブリ
ン領域にある。

本発明による製剤のさらに有利な特長点は、ファクター
■阻害性血漿中で１時間インキュベートしても、ＦＥＩ
Ｂ活性は少くとも５０％まで保持される点である。

この性質は、ファクター■阻害性患者に適用した場合一
層長い持続効果を示す。

本発明による製剤の別の利点は、ファクター■欠乏血漿
中で１時間インキュベートしてもファクター■活性は少
くとも５０％まで保持される点にある。

このことは該製剤が活性化ファクター■をほとんど含ま
ないか、あるいは極く僅かしか含まないことを意味する
。

活性化ファクター■はヒト血漿中で不活化されることが
知られている。

活性化ファクター■は有害な血栓形成効果を惹起し得る
。

ファクターＸαやファクター■α（トロンビン）など他
の活性化凝固ファクター類とは反対にファクター■αこ
そ最高の血栓形成効果を有することが知られている〔プ
ロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス・オブ・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ 、
Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ 、Ｓ ｃｉ 。

ＵＳＡ）第７４巻、第７号、３０２８−３０３２゜１９
７７年７月、ニス・エヌ・キテル、アール・シー・ステ
フエンソンおよびニス・ウニスラー（Ｓ、Ｎ、 Ｇｉｔ
ｅｌ 、 Ｒ，Ｃ，５ｔｅｐｈｅｎｓｏｎ ａｎｄ
Ｓ。

Ｗｅｓｓｌｅｒ ）によるクロツチングプロテアーゼ活
性のインビトロおよびインビボの相関関係１ヘパリンの
効果“〕。

本発明による血液凝固促進製剤の最後の有利な特長は、
該製剤がＦＥＩＢＡＩ単位当り０．０５〜５■のインタ
ー−α−トリプシン阻害物質（ＩＴＩ）を含有する点に
ある。

ＩＴＩの上記含量はウニスラー試験において本発明製剤
の血栓形成を低下させる。

さらに本発明は、ヒト血漿を硫酸化した高分子炭水化物
で処理する第１工程とデキストランを基材とする塩基性
イオン交換樹脂で処理する第２工程とからなる２工程処
理、または塩基性イオン交換樹脂に吸着させる１工程処
理に付し、次いで発生したＦＥＩＢ活性を有しイオン交
換樹脂上に吸着された蛋白質混合物を溶離、濃縮により
回収することを特徴とする、凝固ファクター■、ファク
ター■、ファクター■およびファクターＸを含有し、か
つファクター■阻害物質迂回活性を有するヒト血漿を基
礎とする血液凝固促進製剤の製造法に関する。

上記製造法を実施するにあたり、血漿および試剤はヘパ
リンやヘパリノイドなど抗トロンビン■活性を増加させ
る物質から遮断すべきことを注意しなければならない。

本発明の一態様によれば、まず第一に血漿を硫酸化した
高分子炭水化物で簡単に処理し、次いで発生したＦＥＩ
Ｂ活性を有する蛋白質混合物をデキストランを基材とす
るイオン交換樹脂に吸着させ、続いてただちに溶離し、
濃縮する。

本発明の別の態様によれば、血漿をデキストランを基材
とするイオン交換樹脂で処理し、少くとも２時間の処理
ののち、イオン交換樹脂上に吸着した発生したＦＥＩＢ
活性を有する蛋白質混合物を溶離し、次いで濃縮する。

この態様の場合、ＦＥＩＢ活性の発生は露出時間に依存
する。

これは４８時間まで持続してもよい。

適用される方法は臨界的ではなく、大きな範囲内で変化
され得る；すなわち、ｐＨは６〜９、温度は０〜４０℃
、使用される硫酸デキストランの量は血漿ｌ当り０．１
〜５００ｍ９、ＤＥＡＥセフ７デツクスの量は血漿ｌ当
り０．０１〜１０グであってもよい。

本発明方法の原料物質としては、純粋な（なまの）ヒト
血漿のみならず血漿フラクション、例えば低温上澄液や
コーン（Ｃｏｈｎ ） Ｉ−上澄液（８％アルコール）
も使用できる。

本発明による製剤およびその製造法を下記の実施例によ
ってさらに詳しく説明し、その後適用される測定方法を
説明し、かつ結果をその後の表に示す。

実施例 １ 新鮮な凍結し、クエン酸塩を添加したヒト血漿１０００
１を０〜＋４℃で解凍し、得られる低温沈澱を＋２℃で
遠心分離する。

得られる１低温上澄液“に硫酸デキストラン（分子量５
０００００）１０グをｐＨ７，７のままで加えたのち、
＋４℃で１５分間攪拌してＦＥＩＢＡ物質を発生させる
。

その後、アニオン交換樹脂ＤＥＡＥ−セファデックスＡ
−５０（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ・ニー・
ビー、ウプサラ、スエーデン）５００グを加えたのち、
＋４℃で３０分間攪拌してプロトロンビン複合体のファ
クター（■、■、■、Ｘ）および不活性蛋白質とともに
発生したＦＥＩＢＡ物質を不溶性ＤＥＡＥセファデック
スに吸着させる。

吸着操作の後、直ちにＤＥＡＥセファデックスを遠心分
離または濾過によって分離する；上澄液血漿をγ−グロ
ブリンおよびアルブミンの回収のために使用してもよい
。

ＤＥＡＥセファデックスを二重洗滌過程に付す；まず第
一にＤＥＡＥセファデックスをクエン酸トリナトリウム
２Ｈ２０４グ／ｌ、塩化ナトリウム７ ？／ｌ：、リン
酸水素ジナトリウム１２Ｈ２０１８？／ｌおよび蒸留水
からなる溶液５０１（ｐＨ７，５）とともに＋４℃で１
５分間攪拌する。

沢過して分離したのち、このＤＥＡＥセファデックスを
クエン酸トリナトリウム・２Ｈ２０４１／ｌ、塩化ナト
リウム７？／ｌおよび蒸留水からなる溶液５０１（ｐＨ
７，５）とともに４℃で１５分間攪拌し、次いで再び濾
過して分離する。

溶離のためにこのＤＥＡＥセファデックスを塩化ナトリ
ウム３０？／ｌ、クエン酸トリナトリウム・２Ｈ２０１
？／ｌ：および蒸留水からなる溶液２５．ｆｆ （ｐＨ
７，０’）とともに＋４℃で２０分間攪拌する。

沢過すると、発生したＦＥＩＢＡ物質、プロトロンビン
複合体のファクター（■、■、■、Ｘ）ならびに不活性
蛋白質を含む溶離液が得られる。

ＤＥＡＥセファデックスは捨てる。溶離液を蒸留水１０
００１にて＋４℃で一夜透析し、次いで凍結し、初めの
凍結乾燥過程に付す。

得られるかさだかい物質中のＦＥＩＢ活性を西独公開公
報第２７３４８２１号に記載の方法によって測定する。

ＦＥＩＢ活性を有する医薬として使用できる製剤の製造
のためには、そのかさばった物質を、ＦＥＩＢ活性が１
０〜５０ＦＥＩＢＡ単位／７７１１（本例の場合２５Ｆ
ＥＩＢＡ単位／ｒｕｌ）になるように十分な量のパイロ
ジエンを含まない蒸留水に溶解する。

等張にし、かつｐＨ７，０〜７．５に調節するために必
要とされる塩を添加したのち、溶液を膜沢過器をとおし
て清浄化したのち、最後に０．２μｍの膜ｐ過器で滅菌
沢過する。

溶液を滅菌条件下に最終容器に２０ｒｒｔｌづつ充填し
、冷凍し、凍結乾燥に付す。

実施例 ２ 新鮮な凍結した、クエン酸塩を添加したヒト血漿１００
０１をＯ〜＋４℃で解凍し、得られる低温沈澱を＋２℃
で遠心分離する。

得られる１低温上澄液“に陰イオン交換樹脂ＤＥＡＥセ
ファデックスＡ−５０（ファルマシア・ファイン・ケミ
カルズ・ニー・ビー）５０Ｍ’をｐＨ７，７のままで加
え、＋４℃で３０分間攪拌し、プロトロンビン複合体の
ファクター（■、■、■、Ｘ）および不活性蛋白質をＤ
ＥＡＥ−セファデックスに吸着させる。

その後、混合物を＋４℃で１２時間放置する；この１接
触時間“のうちにＦＥＩＢＡ物質が発生する。

１２時間の３接触時間“ののちに、ＤＥＡＥセファデッ
クスを遠心分離またはｒ過によって分離する；上澄液血
漿はγ−グロブリンおよびアルブミンを回収するために
使用できる。

ＤＥＡＥセファデックスのその後の処理（二重洗滌、溶
離なと）は実施例１の場合と同様に実施する。

スタンホード・ウニスラー（Ｓ ｔａｎｆｏｒｄＷｅｓ
ｓｌｅｒ ）、スタンリー・エム・ライマー（５ｔａｎ
ｌｅｙ Ｍ、Ｒｅｉｍｅｒ ）およびミンデル・シー・
シエツプス（Ｍｉｎｄｅｌ Ｃ，５ｈｅｐｓ ）、ジ
ャーナル・オブ・ザ・アプライド・フイジオロジー（Ｊ
、Ａｐｐｌ 、Ｐｈｙｓｉｏｌ 、 ）す（１９５９）
、９４３−９４６、′ヒト血漿における血栓症誘導活性
の生物学的検定“に記載されているウニスラー （Ｗｅ
ｓｓｌｅｒ ）による血栓症誘導活性試験は下記の方法
で実施される。

家兎３羽を試験ごとに使用する。

動物をネムブタールで麻酔し、さらに局所麻酔したのち
、心臓側頚静脈を開き、１〜２ｃｍの距離をおいて２ケ
所を結紮する。

試験すべき製剤を、開いた頚静脈の反対側の耳静脈に所
望の投与量だけ１５秒以内に注射する。

製剤の注射から１０〜２５秒以内に手術された結紮は収
縮する。

この分離された静脈片はそのまま１０分間家兎の体内に
いれてお（。

その後、この静脈片を動物から分離し、ペトリ皿上で５
％クエン酸ナトリウム液中で解剖したのち、内容物を下
記大要に従って評価する。

０−かたまりが全くない １−肉眼で見て二重のフィブリン粒子が見える２−若干
の小さな血栓 ３−２個またはそれ以上の大きな血栓 ４−単離した血管片の全体を充たす１個の血栓試験は反
応４の場合に陽性と判定される。

実験動物体重１ｋｇ当りＦＥＩＢＡ少くとも２単位を含
有する製剤の注射によって全く反応４が生起しないこと
が本発明による製剤にとって必須である。

カリクレイン活性およびブレカリクレイン賦活剤活性の
定量は下記の方法で実施される。

カリクレイン： ■ 方法： カリクレインは特定の色素形成基質からｐ −ニトロア
ニリン（ｐＮＡ）をアミド分解的に分離する。

ｐＮＡ濃度は４５０ｎｍの波長で光度計で測定する。

２、試剤： バツファ一： 溶液Ａ：’ＴＲｌ５“３．０３１およびイミダゾール１
．７Ｐを０． Ｉ Ｎ塩酸５００ｍ１に溶解したのち、
水を加えて１０００ＴＬｌとする。

溶液Ｂ：’ＴＲｌ５ “４，０４１およびイミダゾ−ル
２．２７ ？を０． Ｉ Ｎ塩酸５００ｍ１に溶解した
のち、水を加えて１０１００Ｏとする。

溶液Ｃ：塩化ナトリウム１１．６９Ｐを水に溶解して１
０１００Ｏとする。

溶液Ａおよび溶液ＢをｐＨ７，９となるまで混合する。

この混合物に同量の溶液Ｃを加える。色素形成基質Ｓ−
２３０２（カビ（Ｋａｂｉ）、ストックホルム）：Ｈ−
Ｄ−プロリル−し−フェニルアラニル−Ｌ−フルギニン
ーｐ−ニトロアニリドジ塩酸塩 Ｓ−２３０２の１ミリモル溶液：２５叩を水４１ｒＩｌ
ｌニ溶カス。

試料： 試料をもとの容量になる様に溶解し、希釈せずに本試験
に供する。

３、試験： ３７℃の水浴中で、予め３７°Ｃに加熱したバッファー
１．０ｍｌ、試料０．１ｍｌおよび色素形成基質Ｓ−２
３０２をプラスチック管にピペットでとる。

この混合物を３７°Ｃに加熱した光度計に入れ、層長１
０ｍｍ層、波長４０５ｎｍで分当りの光学濃度の増加（
△ＯＤ／分）を測定する。

試料の活性は△ＯＤ／分で表わされる。

プレカリクレイン賦活剤： ■、方法： 精製したプレカリクレイン製剤（ＰＫＫ）からカリクレ
イン（ＫＫ）がプレカリクレイン賦活剤（Ｐ ＫＫＡ
）によって発生する。

カリクレインは特定の色素形成基質からｐ−ニトロアニ
リン（ｐＮＡ）をアミド分解的に分離する。

ｐＮＡ濃度は波長４０５で光度計で測定される。

２、試剤： バッファーおよび色素形成基質はカリクレイン定量に関
して記載された試剤に相当する。

プレカリクレイン製剤： 本製剤の製造はエム・ニス・ホロビッツ（Ｍ。

Ｓ、Ｈｏｒｏｗｉｔｚ ） （ニー’−−ヨーク・ブラ
ッド・センター）により改良されたハルペル （Ｈａｒｐｅｌ ）の処方によって実施される。

そこではクエン酸塩付加したヒト血漿をＤＥＡＥセルロ
ーズで処理する。

ＤＥＡＥセルローズに結合しないフラクションがプレカ
リクレインを含有する。

陽性対照（スタンダード）ニ スタンダート（＝対照値）として、食料医薬品省（ＦＤ
Ａ）生物学的製剤局（ＢｏＢ）、ベセスダ、メーリイラ
イド２０２０５、米国のアルブミン製剤を使用する。

この製剤はプレカリクレイン活性物質を含有する。

このＢｏＢスタンダードによるカリクレイン発生を対照
値１とし、かつ１００％とする。

試料： 試料をもとの容量になる様に溶解し、希釈せずに試験に
使用する。

３、試験： ３７℃の水浴中でプレカリクレイン製剤 ０．０５ｍ１および試料０．０５ ｒｎｌ（ａ） 対
照値用のＢｏＢスタンダード（ｂ） 試験試料（二番
目の試験用） をプラスチック管ヘビペットでとる。

３７℃で１０分間インキュベートしたのち、バッファー
溶液０．７ｍｌおよび色素形成基質Ｓ−２３０２０，１
ｍｌをピペットでとる。

この混合物を３７°Ｃに加熱した光度計に入れ、分当り
の光学濃度の増加（△ＯＤ／ｍ１ｙｔ ）を層長１０ｍ
ｍ、波長４０５ｎｍで測定する。

試料の活性（△ＯＤ／ｍ１ｎ）はＢｏＢスタンダードの
数字１に対比しであるいはＢｏＢスタンダードの％とし
て因数的に表わされる。

硫酸デキストランセファローズによる本発明による製剤
の親和性クロマトグラフィーでの分離による該製剤の特
色はすでに第１図を参照しながら説明した。

第２図に関連して述べたファクター■活性を有する蛋白
質およびＦＥＩＢ活性を有する蛋白質の電気泳動による
分離は下記の方法で実施され得る。

種々の蛋白質の電気泳動による分離のための担体として
、電気泳動バッファー（ｐＨ８，６、イオン強度０．０
７５）で湿らせた酢酸セルロース膜が役立つ。

この膜上に分析すべき試料−スタンダートとして正常な
ヒト血漿とともに−を塗布し、次いで電場で分離する；
相異って荷電した蛋白質が電場では相異る速度で移動す
る点で分離が達成される。

この目的で試料を入れた膜を電気泳動バッファーで充た
した特別のセル中で電圧２５０ボルトおよび初電流４〜
６ミリアンペアで１６〜１８分間処理する。

分離操作終了後、種々の蛋白質は該膜を固定溶液または
染色液に浸すことによって目に見えてくる。

若干のすすぎ浴のあとで、該膜はさらにある種の浴に入
れて透明とし、ガラス板に当てたのち、乾燥室で１００
℃で乾燥する。

次に、乾燥した膜を自動的記録積分濃度計で分析すると
、それは第２図に示される分離曲線を与える。

種々の蛋白質は相異なる厚みをもつ帯として現われ、そ
の面積は対応する蛋白質の相対的なパーセント値に比例
し、かつこれらの面積は濃度計の自動積分によって計算
される。

試料の種々の帯または蛋白質を規定の蛋白質または蛋白
質群にあてはめるには、同時にスタンダードとして分析
した正常なヒト血漿の帯と比較することによって行なう
。

電気泳動分析によって後者は５蛋白質群に分離され、こ
れらは電場での移動速度の減少順にアルブミン、α−グ
ロブリン、β−グロブリン、フィブリノーゲンおよびγ
−グロブリンであることがわかった。

ＦＥＩＢＡ単位の定義ならびにその定量（効力試験）は
文献、すなわちオーストリア特許第３５０７２６号（米
国特許第４１６００２５号、西独特許公開第２７３４８
２１号）に記載されている。

凝固ファクター■、■、■およびＸの活性定量もまた上
記文献に記載されている。

ファクター■阻害性血漿とインキュベートした後のＦＥ
ＩＢＡの残留活性の定量は下記の方法で実施する。

■、試剤： 使用される試剤はＦＥＩＢＡ単位の定量（効力試験）に
関連してオーストリア特許第 ３５０７２６号（米国特許第４１６００２５号、西独特
許公開第２７３４８２１号）に記載されている。

２、試験： ５０ＦＥＩＢＡ単位／Ｔｌｌに調節された製剤から希釈
剤として塩化ナトリウム７ ？／ｌ：およびクエン酸ナ
トリウム２Ｈ２０７グ／ｌを含む溶液を使用して下記の
希釈液：１：２．１：４．１：８．１：１６．１：３２
および１：６４を調製する。

これら６希釈液からファクター■阻害剤の血漿の１：１
０希釈液（予め希釈した試料０．０５ ｍｌ＋ファクタ
ー■阻害剤の血漿０．４５７７１１）をそれぞれ調製す
る。

次いで、これらのファクター■阻害剤血漿の１：１０希
釈液（１インキユベ一ト混合物“）を下記の試験手順に
より直ちに、および３７℃で１時間インキュベートした
後に分析する：１１インキユベ一ト混物“
０．１１ｒＬｌ燐脂質−カオリン懸濁液（３７℃で
０．１ｍ１１分間インキュベート） ｍ／４０塩化カルシウム溶液 ０．１ ＴＬｌ
塩化カルシウムの添加からかたまり生成までの時間を効
力試験の場合と同様にタイマーで測る。

３、残留活性の計算： 効力試験で記載した様に、直ちに定量された希釈液（未
希釈試料：５０ＦＥＩＢＡ単位／ｒｒｔｌｌ）の凝固時
間を用いて検量曲線を作成する。

次いで、１時間インキュベートした種々の希釈液の活性
（ＦＥＩＢＡ単位／ｍｌ）を検量曲線を用いて計算し、
インキュベートしていない希釈液の個々の活性のパーセ
ントで表わす。

かくして計算される活性の平均値は、インキュベート前
の初期活性に対するパーセントで表わされた１時間イン
キュベートした後の試料の平均残留活性である。

ファクター■欠乏血漿中でインキュベートした後のファ
クター■の残留活性の定量は次の方法で実施される： ■、試剤： ファクター■欠乏血漿：重い血友病Ｂの患者のクエン酸
塩添加血漿（ファクター■１％以下）。

燐脂質／カオリン懸濁液： ＰＴＴ−試薬、イミュノ・
ディアグノステイカ・ゲス・エム・ビー・エイチ（Ｐ
Ｔ Ｔ −Ｒｅａｇｅｎｚ ｏｆ Ｉｍｍｕｎ。

Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｇｅｓ 、 ｍ、 ｂ 、
Ｈ，）。

試験に際し、必要量のファクター■欠乏血漿を同容量の
燐脂質／カオリン懸濁液と混合し、３７℃で５分間イン
キュベートしたのち、試験期間中氷浴中に保持する。

試料希釈剤としてのクエン酸塩／食塩水溶液：クエン酸
トリナトリウム２Ｈ２０７グ／ｌおよび塩化ナトリウム
７ ？／１０塩化カルシタカルシウムｍ／２０．０５モ
ル）：試験中３７℃に保持。

２、試験： ５０フアクタ一■単位／ｍ１．に調節した製剤からクエ
ン酸塩／食塩水溶液を用いて７等比数列希釈液（１：２
．１：４など１：１２８まで）を調製する。

未希釈試料および７等比級数希釈液からそれぞれファク
ター■欠乏血漿の１：１０希釈液を調製する（希釈試料
０．０５ ｍ、１．＋ファクター■欠乏血漿Ｑ、４５ｍ
１）。

次いで、これらのファクター■欠乏血漿の１：１０希釈
液にインキュベート混合物“）を次の手順により直ちに
、および３７℃で１時間インキュベートした後に分析す
る。

それぞれのインキュベート混合物は定量前にクエン酸塩
／食塩水溶液を用いて１：１０に希釈する： ファクター■欠乏血漿お ０．２ｍｌ よび燐脂質／カオリン混 合物 クエン酸塩／食塩水溶液 ０．１ｍ１（３７℃でを用
いて１：１０に希釈 １分間インキュベした１インキ
ユベート混 −ト） 合物“ ｍ／２０塩化カルシウム ０．１ｄ 液 塩化カルシウムの添加からかたまり形成までの時間をタ
イマーで測定する。

３、残留活性の計算： 両対数グラフ用紙上に対応する希釈液に対する凝固時間
を記入することによって直ちに定量された希釈液（未希
釈試料−５０フアクタ一■単位／ｍｌ）の凝固時間を用
いて検量曲線を作成する。

次いで、１時間インキュベートした種々の希釈液の活性
（ファクター■単位／ｍｌ）を検量曲線を用いて計算し
、非インキュベート希釈液の個々の活性のパーセントで
表わす。

かくして計算される活性の平均値は、インキュベート前
の初期活性に対するパーセントで表わした１時間インキ
ュベートした後の試料の平均残留活性である。

インター−α−トリプシン阻害剤（ＩＴＩ ）の免疫学
的定量： １、方法： 特定の抗体が抗原含有試料に対して寒天培地中で拡散す
るウーフター口二一（０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）方式に
よって定量を行う。

抗原は抗体に特異的に反応して、プラス反応と評価され
る免疫沈澱帯を形成する。

２、試剤： 兎のＩＴＩに対する抗血清、ベーリングヴエルケ・アー
・ゲー、マルブルグ／ラーン、西ドイツ（Ｂｅｈｒｉｎ
ｇｗｅｒｋｅ ＡＧ、 Ｍａｒｂｕｒｇ／Ｌａｈｎ、Ｂ
ＲＤ ） 寒天： 寒天１．２５ Ｐ、塩化ナトリウム０．９１、ナトリウ
ムアジド１００〜を水１００ｍＡに溶解し、しばらく煮
沸したのち、この熱い均質な溶液を厚み約２ｍｒｎの板
に流し込む。

冷却して固化したゲル中に５７１ＬｒＩＬの距離をおい
て２列に大きさ約２ｍｍの穴をあげる。

スタンダードおよび試料： 検量線用物質として所定含量のＩＴＩを含むベーリング
ベルクの標準蛋白血清が役立つ。

この対照血清から生理食塩水（ＮａＣ１９？／ ｌ ）
を用いて一連の等比級数希釈液を調製する。

試験すべき試料をスタンダードと同様に処理する。

３、試験： １列の寒天の穴には検量線用物質の希釈液または試験す
べき試料を充填し、これに隣接して並んだ穴には未希釈
の特定の抗血清をピペットで入れる。

かくして充填された寒天板を３７°Ｃで１５時間インキ
ュベートする。

その後、免疫沈澱の判読を行う。

４、ＩＴＩ濃度の計算： 試料のＩＴＩ濃度の測定手段として、沈澱が丁度口に見
える希釈法を採用する（試料の１力価“）。

試験すべき試料のＩＴＩ濃度は次のようにして計算され
る。

ＩＴＩ濃度は〜％（■／ １００ｍ１）テ表わされる。

実施例１および２によって得られた製剤は、上記定量法
を実施すると下記の特性値を示した二親相性クロマトグ
ラフィーおよび電気泳動による分離に関し、図面の第１
〜２図の図表は実施例２の下記データに対応している。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図はそれぞれ実施例２で得られた製剤
の親和性クロマトグラフィーおよび電気泳動によって得
られたチャートを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 凝固ファクター■、■、■およびＸを含有し、かつ
   ファクター■阻害物質迂回作用を有するヒト蛋白質を基
   礎とする血液凝固促進製剤であって、（イ）該製剤はウ
   ニスラーの血栓症誘発活性試験において家兎体重１ｋｇ
   当りＦＥＩＢＡ少くとも２単位相当量まで凝血形成作用
   を示さず、 （ロ）少なくとも、ＦＥＩＢＡ濃度が１０単位／ｍｌま
   での該製剤の水溶液はカリクレイン活性およびプレカリ
   クレイン賦活剤活性を示さず、ヒ→ 該製剤は、ファク
   ター■活性を有する蛋白質がＦＥＩＢ活性を有する蛋白
   質よりも低いＮａＣ１濃度で溶離するように塩化ナトリ
   ウム濃度勾配を設けることによって硫酸デキストランア
   ガロースを用いた親和性クロマトグラフィーによって分
   離可能であり、 に）上記のファクター■活性を有する蛋白質およびＦＥ
   ＩＢ活性を有する蛋白質を含有する溶離液は、電気泳動
   で分離するとき、α−グロブリンおよびβ−グロブリン
   を含み、その分離曲線にはα−グロブリン領域に全蛋白
   質の６０〜８０％に相当する主ピーク、それに引続いて
   全蛋白質の１０〜２０％に相当する肩部ならびにβ−グ
   ロブリン領域に前記肩部に引続いて全蛋白質含量の１０
   〜２０％に相当する僅かにそれとわかるピークが存在す
   る、ことを特徴とする血液凝固促進製剤。 ２ ファクター■活性蛋白質がＮａＣ１濃度０．１〜０
   ．５モルにて溶離し、ＦＥＩＢ活性蛋白質がＮａＣ１濃
   度０．３〜０．５モルにて溶離し、ファクター■活性蛋
   白質は０．３モルで最大溶離値を示し、ＦＥＩＢ活性蛋
   白質は０．４モルで最大溶離値を示すことを特徴とする
   特許請求の範囲第１項による製剤。 ３ ファクター■抑制物質含有血漿中で１時間インキュ
   ベートしたのちＦＥＩＢ活性が少くとも５０％まで保持
   されることを特徴とする特許請求の範囲第１または２項
   による製剤。 ４ ファクター■欠乏血漿中で１時間インキュベートし
   たのちファクター■活性が少くとも５０％まで保持され
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１または２項によ
   る製剤。 ５ ＦＥＩＢＩ単位あたりα−トリプシン間阻害物質
   （ＩＴＩ ）を０．０５〜５ｍ９含有することを特徴と
   する特許請求の範囲第１〜４項のいずれかによる製剤。 ６ 凝固ファクター■、■、■およびＸを含有し、かつ
   ファクター■阻害物質迂回作用を有するヒト蛋白質を基
   礎とする血液凝固促進製剤であって、（イ）該製剤はウ
   ニスラーの血栓症誘発活性試験において家兎体重１ｋｇ
   当りＦＥＩＢＡ少（とも２単位相当量まで凝血形成作用
   を示さず、 （ロ）少なくとも、ＦＥＩＢＡ濃度が１０単位／ｍｌま
   での該製剤の水溶液はカリクレイン活性およびブレカリ
   クレイン賦活剤活性を示さず、ｅ→ 該製剤は、ファク
   ター■活性を有する蛋白質がＦＥＩＢ活性を有する蛋白
   質よりも低いＮａ Ｃｌ濃度で溶離するように塩化ナト
   リウム濃度勾配を設けることによって硫酸デキストラン
   アガロースを用いた親和性クロマトグラフィーによって
   分離可能であり、 に）上記のファクター■活性を有する蛋白質およびＦＥ
   ＩＢ活性を有する蛋白質を含有する溶離液は、電気泳動
   で分離するとき、α−グロブリンおよびβ−グロブリン
   を含み、その分離曲線にばα−グロブリン領域に全蛋白
   質の６０〜８０％に相当する主ピーク、それに引続いて
   全蛋白質の１０〜２０％に相当する肩部ならびにβ−グ
   ロブリン領域に前記肩部に引続いて全蛋白質含量の１０
   〜２０％に相当する僅かにそれとわかるピークが存在す
   る、ことを特徴とする血液凝固促進製剤の製造法であっ
   て、ヒト血漿を、硫酸化高分子炭水化物で処理する第１
   工程とデキストランを基材とする塩基性イオン変装樹脂
   で処理する第２工程とからなる２工程処理、または塩基
   性イオン交換樹脂と少な（とも２時間接触させて上記イ
   オン交換樹脂に吸着させる１工程処理に付し、次いで発
   生したＦＥＩＢ活性を有しイオン交換樹脂上に吸着され
   た蛋白質混合物を溶離、濃縮により回収することを特徴
   とする血液凝固促進製剤の製造法。 ７ まず血漿を硫酸化高分子炭水化物で処理し、次いで
   発生したＦＥ Ｉ Ｂ活性を有する蛋白質混合物をデキ
   ストランを基剤とするイオン交換樹脂に吸着させ、そこ
   でただちに溶離、濃縮することを特徴とする特許請求の
   範囲第６項による方法。 ８ 血漿をテキストランを基剤とするイオン交換樹脂で
   処理したのち、該イオン交換樹脂上に吸着させた、発生
   したＦＥＩＢ活性を有する蛋白質混合物を少くとも２時
   間該樹脂に接触させたのち溶離、次いで濃縮することを
   特徴とする特許請求の範囲第６項による方法。