JPS5933355B2 - 固定化耐熱性酢酸キナ−ゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化耐熱性酢酸キナーゼ、該酢酸キナーゼの
固定化方法並びに該固定化酢酸キナーゼを利用するサブ
リアクターに関する。

近時、酵素反応の特長である反応、基質、光学の各特異
性にすぐれている点、あるいは反応条件が温和である点
が注目され、酵素は、工業的にも広く触媒として利用さ
れてきている。

しかし、それらは現在のところ、デンプンを糖化するア
ミラーゼ、Ｎ−アシル−Ｌ−アミノ酸からＬ−アミノ酸
を製造するＬ−アミノ酸アシラーゼ等に見られるように
、はとんどがエネルギー源を必要としない加水分解酵素
に限られている。

しかるに、生体内においては、主に、アデノシンニリン
酸（ＡＴＰ）をエネルギー源として、それがアデノシン
ニリン酸（ＡＤＰ）とオルトリン酸に加水分解する時に
放出される化学エネルギーを利用して、多くの合成酵素
により生合成が行なわれている。

そこで、酵素の工業的利用を広げる為、それらの合成酵
素、あるいは酸化還元酵素等をとりだし固相化し、さら
にＡＴＰ等を供給する事により生体外において、生体内
で行なわれていると同様な生合成をめざそうとするまっ
たく新しい生産システム、即ち一般に、バイオリアクタ
ーとよばれているシステムを創造することが試みられて
きている。

第１図はメインリアクターとサブリアクターとからなる
簡単なバイオリアクターの一例をフロー・ダイアグラム
で示すものである。

その様なバイオリアクターを構成、実施するためには、
エネルギー源として安定かつ多量（７）ＡＴＰが必要で
あり、かつ、使用したＡＴＰをＡＤＰより再生産するこ
とが必要である。

前記のバイオリアクターの中で、エネルギー供給系もし
くは補酵素の酸化還元系として機能するサブリアクター
が、ＡＤＰを高エネルギー物質ＡＴＰに再生する役目を
果すものであり、このためにフォスフオドランスフェラ
ーゼと総称される酵素の使用が考えられている。

かかるフォスフオドランスフェラーゼを工業的に利用す
る際に必要さされる要件は、特に（１）平衡反応をＡＴ
Ｐ合成側に片寄らせるものであること、 （２）極めて安定であること（長時間の使用が可能なこ
と） （３）精製が容易であるか、不純物としてＡＴＰ分解酵
素もしくは阻害因子を混在しないこと、などであるが、
このような要件を満足する例として、本発明者は既に好
熱菌バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ−ｉｌｕｓ ）の
−菌株により生産される耐熱性酢酸キナーゼ（特開昭５
２−２５０８８号）並びに高度好熱性細菌サーマス・サ
ーモフィルス（ＴｈｅｒｍｕｓＴｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ ）により生産されるピルビン酸キナーゼ（特開昭５
３−９３９２号）を得ている。

しかしながら、上述の如き諸要件を満足するだけでは依
然として工業的利用において十分とはいえない。

というのはかかるフォスフオドランスフェラーゼは依然
として水溶性（かつ不安定）であるので、再生反応後膣
酵素を回収して再利用することが困難であるからである
。

このことは、酵素が現状では極めて高価であるので、酵
素を産業的に利用するためにはどうしても解決しなけれ
ばならない重要な課題である。

このような酵素の有する欠点を解消するため、酵素を水
不溶性担体に固定化する技術、すなわち酵素複合体の製
造技術が、色々試みられ、種々の酵素の固定化法が提案
されている。

酵素の固定化方法としては、担体結合法、架橋法および
包括法が知られているがこれについては「固定化酵素」
千畑編、講談社サイエンティフィック（１９７５）に詳
しい記載がある。

しかしながら、一般に固定化された酵素の活性は、遊離
の状態における活性に比して著しく低下してしまうこき
が知られている。

これは、酵素が熱、酸、アルカリ等の固定化における諸
条件に対して不安定であるという事実、並びに固定化の
際に活性サイトが利用されてしまう等の理由によるもの
と考えられる。

そこで、本発明者は先の特開昭５２−２５０８８号にお
いて開示した酢酸キナーゼが熱安定性に優れていること
に着目し、これを固定化した結果、十分な安定性と活性
を保持していることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。

本発明によれば、ＡＴＰ再生産用のサブリアク）ター中
に於ての使用にたえる、活性の高い、かつ回収し再利用
に付することの可能な、固定化酢酸キナーゼが提供され
る。

これによって、酵素の工業的利用化が一層容易となるも
のである。

そこで本発明の目的は、固定化後も高い酵素活性を保持
する固定化酢酸キナーゼを提供することである。

本発明の別の目的は、該酢酸キナーゼの固定化方法を提
供することである。

本発明の更に別の目的並びに特徴は以下の記載から明ら
かとなろう。

即ち、本発明は耐熱性酢酸キナーゼと固定化用担体とか
らなる、固定化耐熱性酢酸キナーゼに関する。

また、本発明において使用する酢酸キナーゼは、バチル
ス属に属する耐熱性酢酸キナーゼを生産する、例えばバ
チルス・ステアロサーモフィルス（Ｆ３ａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）を培養し
、その培養液、培養物、分離性菌体、分離菌体、その処
理物、粗製並びに精製酵素等あらゆる段階で採取するこ
とができる。

精製法としては通常の酵素精製法を用いる事が出来る。

即ち、例えば遠心分離等により菌体を得た後、菌体をフ
レンチプレス、超音波処理等により細胞破砕後、遠心分
離により細胞片を除去し、細胞抽出液を得、これに硫酸
ストレプトマイシン又は、硫酸プロタミン処理を行い、
さらには、硫酸アンモニア沈澱、アセトン沈澱、加熱処
理等を行う。

さらに精製する為にはＤｇＡＥ−セルロースカラム等の
イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト
カラム等の吸着クロマトグラフィー、セファデツクヌク
ロマトグラフイー等のゲル濾過クロマトグラフィー、Ａ
ＭＰ−セファデックスカラム等のアフイニテイク口マト
グラフイ−を組合せて行うとよい。

かくして精製した耐熱性酢酸キナーゼ中に含まれるアミ
ノ酸残基の主なものは以下の如くであった。

ヒヌチジン ３６残基（２，２％）リジン
７６残基（５％）グリシン、アスパラギ
ン ３００残基（１９，５％）チロシン
４４残基（２，８％）これらの値は該酢酸キナーゼを塩
酸により加水分解した後にアミノ酸分析機にかけて解析
したものである。

その他、耐熱性酢酸キナーゼの諸特性については特開昭
５２−２５０８８号に詳しい記載がある。

本発明において、酢酸キナーゼの固定化用担体としては
公知のいかなるものも使用することができる。

例えば、多孔性ガラス、多糖類の誘導体およびポリアク
リルアミド等を挙げることができる。

具体的には、セルロース、セファデックス（５ｅｐｈａ
ｄｅｘ）、セファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）、バイ
オ・ゲル（Ｂｌｏ−Ｇｅ１ ）、ナイロン、多孔性シリ
カガラス、アルミナ等を挙げることができる。

これら担体は固定化法により種々の形状で使用され、例
えば共有結合法では一相活性化する必要がある。

本発明において使用し得る活性化セファロースとしては
、ＢｒＣＮ活性化セファロース、グルタルアルデヒド化
セファロース、ジアゾ化セファロース、ナイトレン化セ
ファロース、Ｎ−ヒドロキシヌクシンイミド化セファロ
ースなどがあり、この中でＢｒＣＮ活性化セファロース
およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドセファロースは市
販品として容易に入手できる。

また、その他の活性化セファロースも例えば以下のよう
にして得ることができる。

まず、ジアゾ化セファロースは次式： （ただし、５ｅｐｈはセファロース残基を示す）に従っ
て、Ｂｒ０Ｎ活性化セフアローヌにメタフェニレンジア
ミンを作用させた後、常法に従って亜硝酸すｔ−ＩＪウ
ム・塩酸で処理してジアゾニウム塩として得た。

グルタルアルデヒド化セファロースは、アミンへキシル
セファロース（市販品）をグルタルアルデヒドで処理す
ることにより調製したものである。

ナイトレン化セファロースは、次式の如く前記ジアゾニ
ウム塩をアジ化ナトリウムと反応させ、これに紫外線を
照射することにより得られる：ただし、この場合、紫外
線照射は酢酸キナーゼの共存下で行う。

なんとなれば、前記反応式のラジカルは非常に不安定で
あるからである。

本発明の固定化耐熱性酢酸キナーゼは以下のような種々
の方法により製造することができる。

１、共有結合法 ａ）芳香族アミン基を有する担体をジアゾニウム塩とし
、これと酢酸キナーゼとをジアゾカップリングする。

ｂ）カルボキシル基を有する担体をアジド、ハライド、
カルボジイミド、インシアネート等の誘導体とした後、
酢酸キナーゼとペプチド結合させる。

Ｃ）ハロゲンなどの活性脱離基を有する担体に該酵素を
直接結合する。

ｄ）トルエンジイソシアネート、エピクロルヒドリン、
グルタルアルデヒド、２−アミノ−４，６−ジクロロ−
８−トリアジン等の２官能性試薬を用いて担体と該酵素
とを結合させる。

２、イオン結合法 カルボキシメチルセルロース、ジエナルアミノセファデ
ツクス、ダウエックス−５０等のイオン交換体に該酵素
を結合させる。

３、物理吸着法 活性炭、アルミナ、シリカゲルなどに該酵素を吸着させ
る。

４、包括法 ａ）架橋ポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコー
ルゲル等のゲル格子中に該酵素を包括する。

ｂ） ナイロン、ポリスチレン、コロジオン等の皮膜
中に該酵素を包括する。

反応条件、特に反応温度は酢酸キナーゼの失活の問題と
関連するので注意を要する。

従って、反応温度はＯ〜７０’Ｃ，好ましくはＯ〜６０
’Ｃである。

また、反応溶液のｐＨにも注意する必要があり、６．０
〜９．５なる範囲の一条性下で行うことが好ましい。

ｐＨ調節のためには、ホウ酸バッファー、リン酸バッフ
ァー等、前記ｐ）ｌ範囲を有する緩衝液を使用する。

反応時間は、各固定化法などにより広く変えることがで
き、臨界的ではない。

この耐熱性酢酸キナーゼは上記の如き化学修飾の結果、
イミダゾール基、アミン基およびカルボキシル基がその
活性に関与しているものと考えられる。

一方、テトラニトロメタンによる処理で失活が認められ
なかったことから、チロシン残基はこの酵素の活性にお
いてそれ程重要ではないものと考えられる。

従って、チロシン残基のみを選択的に修飾して固定化す
る方法が見出されれば、該酵素の高い活性をそのまま保
持できるものと考えられる。

しかしながら、現状ではこのような方法は知られていな
い。

前記の固定化法においては、セファロースとの結合にお
いていずれも酢酸キナーゼのアミノ基が主として関与し
ているものと考えられ、固定化酢酸キナーゼの活性は最
も高いもので１６．１％、その他の場合は６〜８％であ
った。

この結果から、酢酸キナーゼの活性に寄与しているもの
と思われるアミン基が該酢酸キナーゼの固定化に使用さ
れていることが推定される。

また、固定化酢酸キナーゼは、粒状、膜状、管状、繊維
状等様々の形状で得ることができる。

例えば、膜状の固定化酵素は膜状担体に前述の担体結合
法を適用するか、半透膜状のポリマーに酵素を包み込む
際に膜状に成形することにより得られ、また管状固定化
酵素ではナイロン管、ポリアミノヌナレン管などの内部
を部分氷解し、これにジアゾ法で酵素をカップリングさ
せることにより得ることができる。

本発明の固定化耐熱性酢酸キナーゼは、遊離の酢酸キナ
ーゼの有する活性の大部分を保持しており、かつ安定性
は遊離の酢酸キナーゼよりも安定で、６ケ月放置後にお
いて初期活性のほぼ１００％を維持しており、９ケ月放
置後においても９０％以上の活性を保持している。

一方、熱安定性の点においても、遊離の酢酸キナーゼよ
りも少くとも１０’０失活温度が高められることがわか
った。

本発明の固定化耐熱性酢酸キナーゼの利用法の一例を添
付第１図に従って説明する。

まず、メインリアクター１でＡＴＰのエネルギーを直接
または間接的に利用して、原料Ａから目的物Ｂを合成す
る。

目的部ＢはメインリアクターからＡＤＰと共に出てくる
のでセパレーター２でＢ（！：ＡＤＰとを分離する。

この場合セパレーターはフィルター、遠心分離器等であ
り得る。

分離されたＡＤＰは固定化酢酸キナーゼを包含するサブ
リアクター３でアセチルリン酸（ＣＨ３Ｃ００Ｐと略記
）と共に次式： ％式％ に従ってＡＴＰに転換され、酢酸と共に出てくる。

サブリアクターから得られるＡＴＰと酢酸との混合物は
、第２のセパレーター４で夫々ＡＴＰと酢酸とに分離さ
れる。

第２のセパレーター４もフィルター、遠心分離器等であ
り得る。

以下、実施例により本発明を更に説明する。

実施例 １ 電気泳動法により単一に精製した、バチルス・ステアロ
サーモフィルスを培養することにより得た耐熱性酢酸キ
ナーゼ０．１２１１１９／ｍｌとＢｒ０Ｎ 活性化セフ
ァロース（セファロース−４Ｂ）、グルタルアルデヒド
化セファロース（ＡＨ−セファロース）、ジアゾ化セフ
ァロース（ＡＰ−セファロース）、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド化セファロース（ＯＨ−セファロース）、カ
ルボジイミド化セファロース（ＣＨ−セファロース）お
よび比較のためのＡＨセファロース（ただし、ＡＨ。

ＡＰおよびＣＨは夫々アミノヘキシル、アミノフェニル
およびカルボキシメチルを表す）夫々５０■ヲｐＨｓ、
３のホウ酸バッファー中で２時間、室温で攪拌すること
により反応させた。

ただし、ジアゾ化セファロースの場合は０°Ｃで反応さ
せた。

また、カルボジイミド化セファロースの場合は純水中で
反応させた。

更にナイトレン化セファロースの場合には、９０Ｗ Ｕ
Ｖ（３６０ｎｍ ｍａｘ）ランプを照射して反応を行っ
た。

次いでガラスフィルターで生成物を炉別し、０．１Ｍｔ
−リス−〇、５ＭＮ ａ Ｏ／／ ＜ツファー（ｐＨ８
，３）および２５ｍＭリン酸バッファ＝（ｐＨ７，２）
により洗浄した後、生成物の活性、前記濾過の際に得ら
れたｐ液の残存活性および得られた固定化生成物の固定
化収率：固定化酢酸キナーゼの活性 １００ 役人した酢酸キナーゼの活性 を決定した。

前記諸特性の測定において、活性（力価）の決定は以下
の如〈実施した： ｐＨ７，２，７ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液中酢酸
ソーダ０．３５ ＭｌＡ Ｔ Ｐ １５ ｍＭ、塩化マ
グネシウム３０ｍＭ、塩化カリウム６２．５ｍＭ、ホス
ホエノールピルビン酸０．４ｍＭニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドの還元型（ＮＡＤＨ）０．１５ｍＭ、
ビリビン酸キナーゼ５ｕ／ｍｌ、ラクテートデヒドロゲ
ナーゼ１４ ｕ ／ｍｌになるように調製し、その混合
溶液に適当量の固定化酢酸キナーゼを加えて、ＨＡＤＨ
の単位時間あたりの３４０ｎｍの吸光度の減少値より力
価を測定し、１分間あたり、１マイクロモルのＮＡＤＨ
の３４０ｎｍにおける吸光度を減少せしめる酵素活性を
１単位とした。

（ジャーナル・オブリＡオロジカル・ケミストリー、２
４９巻、２５６７頁、１９７４年）。

（以下同じ）更に、かくして得られた固定化耐熱性酢酸
キナーゼについて、貯蔵安定性、耐熱性、至適ｐＨおよ
びＡＤＰとアセチルリン酸とに対するＫｍを測定した。

まず、貯蔵安定性は、Ｂｒ０Ｎ活性化セフアロース４Ｂ
およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド化ＯＨ−セファロ
ースに固定化した耐熱性酢酸キナーゼ（夫々ＣＮＢｒお
よびｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）および比較のためにニジ
エリシア・コリを培養して得られた酢酸キナーゼをＢｒ
０Ｎ活性化セフアロース４Ｂに固定したもの（Ｅ ｃｏ
ｌｌ（ＯＮＢｒ））および遊離の耐熱性酢酸キナーゼ（
ｆｒｅｅ ）を、夫々２５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ
７，５）中に分散させ、室温で放置し、その活性の経時
変化を測定することにより決定した。

結果を第２図に示す。耐熱性は、貯蔵安定性について使
用した、ニジエリシア・コリ起源の酢酸キナーゼの試料
以外のものおよびジアゾ化ＡＨ−セファロースに固定し
た（ｄｉａｚｏ）各固定化酢酸キナーゼをｐＨ６，９の
２０ｍＭ’Ｊン酸バッファー中に溶解し、各温度での残
存活性を追跡することにより決定した。

結果を第３図に示す。

第３図から明らかな如く、固定化することにより耐熱性
は遊離の酢酸キナーゼよりも少くとも１０℃向上したこ
とがわかる。

至適ｐＨは、スクシンイミド法で固定化した酢酸キナー
ゼ（ＢＯＵＮＤ ）を、２５ｍＭリン酸バツフアー中に
分散させ、室温にて、各ｐＨにおける活性を追跡するこ
とによって決定した。

結果を第４図に示す。

遊離のもの（ＦＲＥＥ）と比較して、固定化したものは
０．５ ｐＨ単位酸性側に移動したが余り大きな差はみ
られなかった。

常法に従って、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド化ＣＨ−
セファロースに固定化した耐熱性酢酸キナーゼ（ＡＫ）
および遊離のものについて、Ａ、ＤＰとアセチルリン酸
に対するＫｍをバッチ法で測定した。

結果は下表の通りである。また、ＢｒＣＮ活性化セファ
ロース４Ｂ上に固定化したＡＫについても同様にしてＫ
ｍを測定したが、同様なＫｍの値が得られた。

実施例 ２ ナイロンチューブへの固定 内径０．２韮のナイロンチューブ内部に、７％テトラフ
ルオロホウ酸トリエチルオキソニウム塩のジクロロメタ
ン溶液を、３０°Ｃにて３時間、流速０．１ ｍｌ／分
で循環させた。

次いで、該ナイロンチューブにジクロロメタンを１０分
間、流速０．２ｍ１１分で流すことにより洗浄した。

更に、２５％へキサメチレンジアミン水溶液を、３０°
Ｃにて１時間、０．１７ｒｌｌＺ分なる流速で循環させ
た後、２５ｍＭホウ酸バッファー（ｐｌ（８，０）で洗
浄した。

次に、２５ｍＭホウ酸バッファーに５％（Ｗ／ｖ）のス
ベリミジン酸ジメチルを溶解した溶液を３０°Ｃにて２
０分間、０．１ ｍｌｌｌ分なる流速で循環し、メタノ
ールを５分間流して洗浄した。

酢酸キナーゼ１０００単位を含むホウ酸バッファー（ｐ
Ｈ８，０）を３０°Ｃにて５時間、０．１ ｍｌ、／分
なる流速で循環した。

ホウ酸バッファー（ｐＨ８，０）で洗浄し固定化酢酸キ
ナーゼを得た。

このものの活性は７３０単位であった。

実施例 ３ 実施例１で得たＢｒ０Ｎ活性化セフアローヌ４Ｂ上に固
定した固定化酢酸キナーゼを、内径０．４ｃＩｒＬ、長
さ５（ｌｌ’７７１のガラス製カラムに充填した。

次に、ＡＤ Ｐ ５ ｍＭ、塩化マグネシウム１５ｍＭ
、アセチルリン酸１０ｍＭ、グリコース］、ＯｍＭ、グ
ルコース６リン酸脱水素酵素０．２５単位／ｍｌおよび
ヘキソキナーゼ１２．５単位／ｍｌを含む５０ｍＭイミ
ダゾールバッファー溶液（ｐＨ７，３）を調製し、これ
を前記カラムに流速１ｍ１Ｚ時で流した。

流出液をフローセルに導き、３４０ｎｍの吸光変化を測
定し、ＡＤＰ−）ＡＴＰ変換を確認した。

その結果、この固定化酢酸キナーゼはＡＤＰ→ＡＴＰ変
換用サブリアクターとして十分に機能し、また３ケ月間
に亘る連続的使用の後も、その活性は５％低下したにす
ぎず、この固定化酢酸キナーゼは少なくとも３ケ月間は
ＡＤＰ−）ＡＴＰ変換酵素として安定に機能することが
わかった。

実施例 ４ エーテル化度０．５、平均重合度１００のすＩ−ＩＪウ
ムカルボキシメチルセルロース２ｇと、常法（Ｅｕｒ、
Ｊ 、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、５３．４８’（１９７５）参
照）により合成した、Ｎ−Ｃ（６−アミンへキシル）カ
ルバモイルメチル）ＡＤＰ５００〜を水５０ｍ１に溶か
した。

次いで、これに５００〜のエナルジエチルアミンプロピ
ル力ルポジイミドを含む水溶液５ｍｌを、ｐＨを６に保
ちつつ室温で１時間かけて滴下した。

得られた反応生成物を、透析外液として水を使用して十
分に透析し、カルボキシメチルセルロース−ＡＤＰを得
た。

この高分子化ＡＤＰ５ｍＭ、塩化マグネシウム１５ｍＭ
、アセチルリン酸１０ｍＭ、グルコース１０ｍＭ、グル
コース６リン酸脱水素酵素０．２５単位／ｍｌ、および
ヘキソキナーゼ１２．５単位／ｍｌｌを含む５０ｍＭイ
ミダゾールバッファー溶液（ｐＨ７，３）を調製し、こ
れを室温にてｏ、ｏ５ｒｕｌ／分なる流速で、実施例２
で得た固定化酢酸キナーゼのチューブに通した。

実施例３と同様にして、前記高分子化ＡＤＰのＡＴＰへ
の変換を確認した。

実施例 ５ ｏ、１２Ｅｌ／ｍ１．のアクリルアミド、６ｍｌ／ｍ１
（ＤＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを含む２０
ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７，５）５ｍｌに耐熱性酢
酸キナーゼ１０単位を０℃にて加えた。

攪拌混合後５０”９／ｍｌの過硫酸カリウム溶液５０μ
ｌを加え２０Ｗの螢光灯下で２時間反応させた。

生成したゲル状物を破砕後２０ｍＭ’Ｊン酸バッファー
１０ｍ１で３回洗浄した。

生成物の活性は８．３単位であり、洗液中に１．５単位
の耐熱性酢酸キナ−ゼが回収された。

このものも同様に極めて安定であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、バイオリアクターのフローチャートを示す概
略図であり、第２図は本発明の固定化耐熱性酢酸キナー
ゼの安定性を示す図であり、第３図は同酢酸キナーゼの
耐熱性を示す図であり、第４図は同酢酸キナーゼの至適
ｐＨを示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 好熱菌、バチルス・ステアロサーモフィルスの一菌
   株により生産された耐熱性酢酸キナーゼと、固定化用担
   体とからなる、固定化耐熱性酢酸キナーゼ。 ゛２ 該固定用担体が多孔性ガラス、多糖類の誘導体お
   よびポリアクリルアミドから選ばれる、特許請求の範囲
   第１項記載の固定化耐熱性酢酸キナーゼ。 ３ 予め活性化した固定化用担体と、好熱菌ノくチルヌ
   ・ステアロサーモフィルスの一菌株により生産された耐
   熱性酢酸キナーゼとを６．０〜９．５なる範囲のｐＨを
   有するバッファー溶液に分散させ、０〜７０°Ｃなる範
   囲の温度下で攪拌し、場合によりＵ、Ｖ、光を照射する
   ことを特徴とする、耐熱性酢酸キナーゼの固定化方法。 ４ 該固定化用担体が多孔性ガラス、多糖類の誘導体お
   よびポリアクリルアミドから選ばれる特許請求の範囲第
   ３項記載の耐熱性酢酸キナーゼの固定化方法。