JPS5940254A - 生体試料の分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体クロマトグラフィーによる肝疾患の診断方
法に関する。更に詳しくは、高速液体クロマトグラフィ
ーにより病態、特に、肝障害の病態の指標を得る方法で
あって、更に、得られる生体試料中の肝疾患に特有なピ
ーク又はピークツ９ターンを解析することによシ肝疾患
を容易に診断する方法に関する。

生体試料、例えば、血漿、血清等の血液、脳を髄液又は
尿等の成分、性質を分析して、病態に関する情報を得る
ことは、病態の診断、治療上極めて重要である。従来、
該情報は多くの化学的或いは生化学的分析手段を用いる
ことで得られているが、様々な症例に対する病態の解明
、或いは、よシ正確な病態の把握等の目的に対し、さら
に適確な情報を入手し得る分析法の開発が切望されてい
る。

特に、肝臓疾患では、病態が複雑であるだけに該病態と
密接に関連する新しい指標を提供し得る分析法の開発が
望まれている。従来の病態指標としては、肝疾患におい
てはＧＯＴ（グルタミツクーオキザロアセティツク−ト
ランスアミナーゼ）。

ＧＰＴ（グルタミツクービルビック−トランスアミナー
ゼ）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）、ＬＡＰ（ロイシンア
ミノペプチダーゼ）等々の生体酵素活性値や蛋白質ビリ
ルビンなどの血液成分の生化学的分析値（検査値）、ま
た、腎疾患においては、血液生化学分析によるクレアチ
ニン、尿酸、電解質の値や尿中の蛋白質、糖及びＰＨ値
などの検査値がある。

上記検査値はそれなシに診断、治療上の指標として重要
な役割シをはたし、実際に使用されている。しかしなが
ら、現状の化学的或いは生化学的分析法では、該病態と
深いかかわシあいのあることが指摘されている尿毒性毒
累、各種の代謝異常物質、病因物質等の存在まで究明出
来ず、きめ細かな診断、治療に対しては不満を残すもの
である。

液体クロマトグラフィーによらない、肝疾患の病態を診
断する方法として、会務は肝細胞抗原を用いる方法を提
案している（：Ｇａ５ｔｒ、　７６．６６５　（１９７
９））。

その中で、慢性活動性肝炎に対しては５０〜６０係の確
率で、また、慢性非活動性肝炎、或いは肝硬変に対して
は２０〜４０％の確率で判断できることを報告している
。しかしながら、上記方法は操作が複雑であシ且つ判断
精度としても満足すべきものと云い難い。

上述した現状にかんがみ、従来の化学的、生化学的分析
法とは異なる原理に基ずく分析手法の１つである液体ク
ロマトグラフィーの利用が近年注目されつつある。

液体クロマトグラフィーは熱的、化学的に不安定な物質
であっても、その物質を変質することなく分離検出でき
、しかも比較的少量の試料で１度に多数の成分を分析す
ることができる点で、原理的には医学、臨床領域への利
用に期待がもたれ、また、いくつかの試みがなされてい
る。

しかしながら、液体クロマトグラフィーは分離条件の設
定或いは検体試料の前処理等の測定条件によって、同一
試料検体であっても得られるピーク或いはピーク・Ｑタ
ーンが各々異なシ、測定条件と病態に関連する検出ピー
クとの関係がつかみきれず必ずしも臨床分析手法として
実用化されるまでに至っていない。

特に、肝疾患の病態は後述の如く複雑な発生因子を有す
る故え、試料検体の成分分離が困難である。

例えば、Ｍｅｙｅｒらは、架橋アガロース系の多孔性ビ
ーズを充填剤とする液体クロマトグラフィーによシ、肝
細胞特異抗原の検出を試みた（ＣＩｉｎ。

Ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１０．８９（１９７２）
’）。　しかしながら、Ｍｅｙｅｒらの方法は正常の血
清と同一パターンを示し、病態に関連する特有のピーク
を得ることができなかった。

一方、　Ｆ’ｕｒｓｔは高速液体クロマトグラフィーに
よる血清試料の分析法を提案した（ＣＩｉｎｉｃａｌＮ
ｅｐｈｒｏＬｏｇｙ、Ｖｏｌ　１ｆｆ４）、　　１９８
（１９７６）：］。しかしながら、Ｆｉｉｒｓｔの方法
は多くのピークが重なυ合い、各成分の分離同定が困難
であシ、病態と関連付けられる特異なピークのみを検出
するまでに至らなかった。

また、肝障害の極期である肝不全に対しては液体り。ッ
トグラフィーを用いて血液成分を分析し、種々のピーク
を検出する試みがなされているが、急性肝炎、慢性肝炎
、肝硬変、肝癌等の巾広い肝疾患の病態に関連する異常
ピークの検出法は未だ知られていない。肝不全は肝疾患
の中でも特殊な病態であシ、免疫系から細胞系を含めた
肝細胞全体で疾患が生じる為に、細胞脱落成分、免疫蛋
白質或いは腸管内での異常成分の合成物等が多種発生す
る。従って、それらの成分の一部を検出することは比較
的容易である。一方、進行度及び重症度により急性肝炎
、慢性肝炎、肝硬変、肝癌等に分類される肝疾患の病態
は複雑な発生因子を含むことから、病態関連の成分（毒
素）がよシ複雑な性状を呈し、これまで分離検出でき危
かったものと推察される。

本発明者らは上記実情に鑑み、特に肝腎臓等の疾患時の
生体試料の臨床分析法として、極く少量の試料により簡
単且つ短時間で病態の進行と関連あるピークを分離検出
し、該ピークの変化から肝機能変化を検査することを目
的として鋭童研究の結果、上記目的を達成し得る手法を
見い出し、本発明に到達したものである。

本発明は、生体試料を液体クロマトグラフィーによシ分
析する方法において、アセトニトリル／酢酸水溶液を移
動相として分離ピークを測定し。

その特異なピーク又はビークツｑターンを肝疾患の病態
の指標として判断すること全特徴とする肝疾患の診断法
を提供する。

本発明は高速液体クロマトグラフィーによシ、生体試料
、即ち、血清、脳を髄液、リンフ９液、腹水、胆汁もし
くは尿をそのまま又は除蛋白処理した試料検体２０μ！
程度から、３０分程度の短時間で病態と相関のあるピー
クを鋭く分離検出し得るものであシ、検出ピークが単純
故え後述の如く、はぼ９０−１００’％の確率で肝疾患
の重症度を診断できる。

なお、本発明は劇症肝炎のみならず、急性肝炎。

慢性肝炎、肝硬変、肝癌、ルポイド肝炎、胆汁うつ滞、
原発性胆汁性肝硬変、肝線維症等の肝疾患の病態或いは
腎疾患から生ずる肝腎合併症等に適用可能である。

現在の治療法は肝疾患が連続性を有する為、肝硬変、肝
癌の様な極めて死亡率の高い病態へ移行させない様に努
力している事実を考えると、本発明は極めて精度が高く
、治療分野への貢献は大なるものと云える。

以下、本発明を詳述する。

本発明で用いる充填剤は高速液体クロマトグラフィー用
充填剤として市販されているもので良く、中でも、シラ
ン処理したシリカ系の充填剤が好ましい。該充填剤は公
知の方法、例えば、粉砕されたシリカをシラン化合物で
処理することによって得ることができる。

充填剤を充填して成るカラムは市販の液体クロマトグラ
フィー装置又は同等の機能を有する任意の装置にセット
し、本発明の目的とする生体試料の分析に供する。

本発明に係る移動相はアセトニトリル／酢酸水溶液であ
る。アセトニトリル／酢酸水溶液は通常５／９５〜２５
／７５　（容量比）、好ましくは５／９５〜１５／８５
の範囲のものを用いる。酢酸は蒸留水。

イオン交換水、中性の緩衝液、例えば、　　Ｉ）ｆ（＝
７．４のリン酸緩衝液等に溶解して用いる。通常、酢酸
水溶液の濃度は０．旧〜１．０重量％、好ましくは０．
１〜０．５重量−である。酢酸の濃度及びアセトニトリ
ルとの混合比は上記範囲内で任意選択する３、なお、上
記移動相は必要に応じ、塩化す）　ＩＪウムなどの塩成
分或いはアジ化す）　ＩＪウムなどの防腐剤を添加して
用いることができる。アセトニトリルの量は検体試料成
分の溶出速度及びピークの分割に、また、酢酸水溶液の
濃度はピークの分離に関係する。

生体試料はそのまま、又は、メタノール、トリクロル酢
酸、過塩素酸等の公知の除蛋白試薬を用い前処理して用
いる。その他、限外口過膜で高分子量物質を除去しても
良い。充填剤の寿命９分析精度の向上の為には、前処理
操作を施した試料が好ましい。

分析温度は通常５〜４０Ｃである。生体試料は５〜２０
μｌ程度で良い。分離ピークの検出は紫外領域２００〜
２８０　ｎｍ、好ましくは２１０　、２８０ｎｍで同時
に検出する方法が病態との関連性から好ましい。また、
螢光分析においては励起波長２２０〜３５Ｑｎｍ、螢光
波長２８０〜５２０ｎｍで、好ましくは励起波長３２０
〜３５０ｎｍ、螢光波長４５０〜４７０ｎｍである。本
発明の移動相と上記検出波長を組合せることによシ肝腎
機能の病変に特有なピークを得ることができ、そのピー
ク及び／Ｑターンから肝腎機能の診断を可能とする。な
お、紫外領域と螢光領域の検出波長の組合せは更に診断
の精度を高めることができる。検出方法としてその他に
示差屈折率、赤外分光光度計１ポーラログラフイー、又
は伝導率等を用いても良い４゜ 本発明の診断法は極めて簡単である。即ち、上記方法で
得られる測定ピークにおいて、後述する如く、肝疾患に
特有なピークの有無又はその面積比もしくはそれらの数
値処理、及びそのピークツ（ターン吟を認識することに
よって実施し得る。廿たデータの定量化の為、検出器に
データ処理機を連結してピーク面積の数値化或いはデー
タ処理することもできる。

本発明は上記臨床分析への利用に限らず、例えば大型の
カラムに充填して各成分の分取等にも用いることが出来
る。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

実施例１ 市販の充填剤／ｊ−ＢＯｎｄａｐａｋ■ｐｈｅｎｙｌ　
（粒径〜１０Ｍ１ｃｒｏｎ　＋ウォーターズ製→を常法
によシ４ｏａφ×３０１のステンレス製カラムに充填し
、紫外線検出器を備えた高速液体クロマト装置にセット
する。上述のごとく形成したカラムの流路にアセトニト
リ、Ｖ′ｏ、ｉチ酢酸水溶液（容量比：１０／９０）を
１．０ｗ／ｍで流し、紫外線検出器、記録計を安定させ
る。

正常人血清及び胆汁うつ滞の患者血清をそれぞれ５００
μ！取り、５ｃｃのメタノールを加え、混合後、６０Ｃ
の温浴で２０分間処理し、蛋白成分を凝固させ、更に遠
心分離機によシ、５　Ｃ，３０００Ｇ。

２０分間処理し、上澄液を取ｐ出し、乾燥後、５００μ
ｌのメタノールを加え、残渣物を溶解し、試料検体とし
た。

試料検体者２０　ｐｌｌを注入し、前記高速液体クロマ
ト装置で分析した。尚、紫外線分析は２１０゜２８０ｎ
ｍ、感度０．０２で同時測定を行なった。

その結果、分析時間２０分で第１図（正常人）、第２図
（胆汁うつ滞）に示すチャートが得られ、患者には正常
人に存在しない特異なピークが存在した。

この結果から、肝疾患患者の血清を本発明の方法で分析
すれば肝疾患の病態を判断できることが判明した。

実施例２ 実施例１と同様の条件で各種肝疾患で治療中の患者５０
人の血清を分析し、特異なピークについて第１表に存在
の有無を示したが、これから明らかな様にすべての肝疾
患において特異なピークが認められた。

第１表 実施例３ 実施例１において移動相をアセトニトリル１０．０１チ
酢酸水溶液（容量比１０／９０　）、患者血清を肝硬変
で脳症の症状を有する患者血清、紫外線分析は波長２２
０　ｎｍ　（感度０．０４）、２８０ｎｍ（感度０．０
２）で分析した以外、同一条件下で分析した。

その結果、第３図（正常人）、第４図（肝硬変患者）に
示す様なチャートが得られ、正常人に認められない特異
なピークが患者に認められた。

実施例４ 実施例１において検体を肝硬変、肝癌合併症で脳症を併
発している患者血清に変えた以外は実施例１と同様の方
法で、病態の変化と本発明の異常ピーク面積値の関係を
調べ友。その結果を第２表に示した。尚、参考の為、生
化学検査値も示した。

この結果意識障害度１度から■度へ病態が悪化するにも
かかわらず、生化学検査値ではＮＨ，値が顕著な変化を
示すのみであシ、他の検査値にあってはほとんど変化が
認められなかった。これに対し、本発明にかかる特異ピ
ークの面積は病態変化を適確につかまえておシ、臨床検
査へ応用し得ることが明らかとなった。

第２表 実施例５ 急性肝炎、（発症性）慢性肝炎に移行し更にじんましん
（合併症）と診断された４４才の女性に対して、加療（
通院−入院）−眼院一再加療に至る経過を従来の生化学
検査及び本発明の方法で追跡した結果を第３表に示す。

本発明の方法は実施例１と同様な方法で血清を分析し、
その時の特異ピークの面積値を錫標として用いた。

加療を続けることによシ、生化学分析値は徐々に正常値
に近づき、退院時（通院後１１０日）にはほぼ正常の範
囲を維持した。

一方、本発明に係る特異ピークの面積値も加療によシ徐
々に減少する傾向を示した。しかしながら、核ビーク面
積値は正常人には認められないことから、本発明の方法
では退院時以後も加療を続けることの必要性を教唆して
いる。

以上の結果から、本発明の方法は現在の生化学検査法よ
シもきめ細かく病態を監視し得るものと云える。

第３表

【図面の簡単な説明】

第１図及び第３図は正常人の血清の液体クロマトグラフ
ィー分析ノξターンを示す図であシ、第２図及び第４図
は各種肝疾患者の血清の液体クロマトグラフィー分析ノ
にターンを示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）生体試料を液体クロマトグラフィーにより分析す
   る方法において、アセトニトリル／酢酸水溶液を移動相
   として分離ピークを測定し、その特異なピーク又はピー
   クＩＱターンを肝疾患の病態の指標として判断すること
   を特徴とする肝疾患の診断方法。