JPS5941720B2 - マルトペンタオ−ス及びマルトヘキサオ−スの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ストレプトミセス属のうちから、選択された
微生物を培養し、得られた培養物から、マルトペンタオ
ース又はマルトヘキサオース又はこれら両物質を採取す
ることからなるマルトペンタオース、マルトヘキサオー
スの製造法である。

さらに詳しく言えば、本発明はストレプトミセス属に属
するマルトペンタオース又はマルトヘキサオース又はこ
れら両物質を生産する菌を好気的条件下に培養して、培
養液中に、マルトペンタオース又はマルトヘキサオース
又はこれら両物質を蓄積させ、これを採取することを特
徴とするマルトペンタオース又はマルトヘキサオース又
はこれら両物質の製造法を要旨とする。マルトペンタオ
ース及びマルトヘキサオースは従来、コーン・シロツプ
から単離する方法（例えばＲ、Ｌ、Ｗｉｓｔｌｅｒら、
Ｊ、ＡｍｅｒＣｈｅｍＳｏｃ７７巻、５７６１頁、１９
ｊ１年）、澱粉を酸分解して得る方法（例えば、Ｗ、Ｊ
、Ｗｈｅｌａｎら、Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１２９３頁
、１９５３年）、或いはバクテリア、カビ、動物由来の
アミラーゼ処理によつて得る方法（例えば、貝沼ら、Ｆ
ＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、２６巻２８１頁、１９７２年）
によつて得られた。

これらの方法は、得られる生成物中のマルトペンタオー
ス、マルトヘキサオースの含量が少なかつたり、アミラ
ーゼを単離して使用することから、本発明は醗酵法によ
り工業的規模で多量にマルトペンタオース、マルトヘキ
サオースを生産できる点で有利と考えられる。更に、本
発明者らはマルトペンタオース乃至マルトヘキサオース
が新抗生物質ＳＦ−ｌｌ３０Ｘ、物質及びＸ２物質（本
出願人の同日出願に係る特願昭５１−９９７５７号明細
書参照）の示す抗菌作用或いは免疫賦活作用を増強する
効果のあ・５ことを見い出して、マルトペンタオース、
マルトヘキサオースの有用性を開発した。本発明の方法
で使用されるマルトペンタオース、マルトヘキサオース
生産菌としては、ストレプトミセス属に属するマルトペ
ンタオース、マルトヘキサオース生産菌株があり、この
菌株の一例としては、本発明者らによつて土壌より分離
したＳＦ一１１３０株がある。

なお、この菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に微
生物受託番号微工研菌寄第６７６号として寄託されてい
る。

ＳＦ−１１３０株の菌学的性状は次の通りである０１．
形態 米基生菌糸は多くの培地でよく伸長するが、気菌糸の形
成は一般に不良である。

気菌糸着生のみられるスターチ寒天、澱粉酵母工キズ（
または澱粉・酵母工キズ）寒天等ではよく伸長した基生
菌糸から短く密集した気菌糸が形成される。分岐は単純
分岐で車軸分岐はみられない。気菌糸の先端は大部分コ
ンパクトな閉鎖型のらせん糸からなるが、不完全ならせ
ん糸及び開放型らせん糸も観察される。菌核形成は認め
られない。電子顕微鏡による胞子の表面構造は平滑型で
ある。胞子は楕円ないし円筒型で０．６〜０．７×０．
９〜１．０ミクロンの大きさを有する。以上のような生
理的性状のほかに、ＳＦ−１１３０株は寒天培地及び液
体培地で粘質物を産生する性質を有しておりこれは本菌
株の大きな特徴である。

澱粉・酵母工午ス寒天、スターチ寒天、グルコース・ア
スパラギン寒天等の寒天培地では粘質物が培養１０日目
頃から菌体の上にもり上つて生成されるのが観察される
。

また適当な炭素源（グルコース、澱粉等）と窒素源（酵
母工キズ、大豆粉、小麦胚芽等）を含む液体培地でＳＦ
−１１３０株を振盪培養すると培養液が次第に粘稠とな
り、粘質物の生成が認められる。

４．炭素源の利用性 １．利用する：キシロース、グルコース、ガラクトース
、マルトース、サツカロース、ラクトース、ラフイノー
ス、デキストリン、澱粉、グリセロール、イノシトール
、酢酸ソーダ、クエン酸ソーダ、マンノース２．利用が
疑わしい：アラビノース、フラタトース、サリシン３．
利用しない：ラムノース、イヌリン、ダルシツト、マン
ニツト、ゾルピット、コハク酸ソーダ、セルロース。

以上より、ＳＦ−１１３０株の菌学的特徴を要約すると
、（１）気菌糸の先端は主にらせん状（閉鎖型）で胞子
表面は平滑型である。

（２）気菌糸は灰褐色ないし灰色を呈するが、着生能は
極めて貧弱である。

（３）合成培地での発育は褐色ないし灰褐色である。

（４）有機培地ではクロモゲニツクの性状となる。（５
）寒天培地及び液体培地で粘質物を産生する。上記の菌
学的性状からＳＦ−１１３０株の近縁菌種としてストレ
プトミセス・フエオクロモゲネス、ストレプトミセス・
プルプレオクロモゲネス、及びストレプトミセス・ノポ
リトエンシスがあげられるが、次に示すようにＳＦ−１
１３０株はいずれの菌種とも一致しない。即ち、ストレ
プトミセス・フエオタロモゲネスは気菌糸を豊富に着生
し、シェークロース・ツアペツク寒天及びリンゴ酸カル
シウム寒天で褐色の可溶性色素を生成するのに対し、Ｓ
Ｆ−１１３０株は気菌糸着生能が貧弱で、上記培地で可
溶性色素を生成しない点で両者は明瞭に区別さわる。

ストレブトミセス・プルブレオクロモゲネスは馬鈴薯片
の発育が橙色〜橙赤色で硫化水素を生成せず、脱脂乳を
凝固するのに対してＳＦ−１１３０株は馬鈴薯片での発
育が褐色で、硫化水素を生成し、脱脂乳の凝固がみられ
ない等の明瞭な相違点を有している。またストレプトミ
セス・ノポリトエンシスはらせん糸を形成せず、スター
チ寒天で緑色の可溶性色素を生成する（文献では緑色可
溶性色素の生成は記載されてないが、タイプ株では顕著
に認められる。

）一方、ＳＦ−１１３０株はらせん糸を形成し、澱粉合
成寒天では可溶性色素を生成しない。さらに両者はマン
ニツト、サツカロースの利用性においても相違しており
、ＳＦ−１−１３０株はストレプトミセス・ノポリトエ
ンシスから区別される。さらに、ＳＦ−１１３０株は、
粘質物を産生するという特異的な性質を有するが、上記
三菌種を含めてストレプトミセス属の菌種で粘質物を産
生するという報告はなく、この点でもＳＦ−１１３０株
は即知菌種中に一致するものがない。

従つて、本発明者らは、ＳＦ−１１３０株を分離した当
時、この菌株をストレプトミセス属の新菌種と考え、ス
トレプトミセス・ミキソゲネス（ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃ
ｅｓｍｙｘＯｇｅｎｅｓｓｐ，ｎＯｖ・）と命名した。

ＳＦ−１１３０株は他のストレプトミセス属の菌種の場
合にみられるように、その性状が変化しやすく、例えば
紫外線、エツクス線、高周波、放射線、薬品等の人工的
変異手段で変異しうるものであり、このような変異株を
含めて、ストレプトミセス属に属する菌株であつてマル
トペンタオース又はマルトヘキサオースを生産する生産
能、又はこれら両物質を同時に生産する生産能を有する
ものは、すべて本発明の方法に使用することができる。

本発明の方法では前記菌株を通常の微生物が利用しうる
栄養物を含有する培地で培養する。

栄養源としては、従来ストレプトミセス属の培養に利用
される公知のものが使用できる。例えば炭素源として、
澱粉、水あめ、糖みつ等を使用しうる。また窒素源とし
て、大豆粉、小麦胚芽、乾燥酵母、ペプトン、肉工キズ
、コーンステイープリカ一硫酸アンモニウム、硝酸ソー
ダ等を使用しうる。その他必要に応じて炭酸カルシウム
、塩化ナトリウム、塩化力１八燐酸塩等の無機塩類を添
加するほか、菌の発育を助けマルトペンタオース、マル
トヘキサオースの生産を促進するごとき有機及ひ無機物
を適当に添加することができる。培養法としては、一般
抗生物質生産の方法と同じく、液体培養法、特に深部培
養法が最も適している。

培養は好気的条件下で行なわれ、培養に適当な温度は２
５気Ｃ〜３８℃であるが、多くの場合２８℃付近で培養
する。かくして、マルトペンタオース及びマルトヘキサ
オースの生産は、振盪培養、タンク培養共に２〜５日で
最高に達する。マルトペンタオース及びマルトヘキサオ
ースは、後述するようにそれ自体は抗菌件をもたない中
性のオリゴ糖であつて後記の如き理化学的性状を有し、
これらの理化学的性状を利用して培養液中から、採取、
精製することができる。たとえば、ＳＦ−１１３０株の
培養によつて産生されたマルトペンタオース及びマルト
へ千サオースを培養物から採取するには、培養物の酸性
口過によつて菌体と分別したのち、培養済液中に共存す
る塩基性物質から分離するために、ＰＨ３で強酸性イオ
ン交換樹脂（ダウエツクス５０Ｗ×２）を通過させる。

次いでカーボンカラムに吸着させ、水洗後、１０、１５
、２０１２５％の各エタノール水で順次展開し、夫々の
溶出分画について、ペーパークロマトグラフイ一（ｎ−
ブタノール・ピリジン・水・酢酸二６：４：３：ｌ）で
、Ｒラフイノースニ０．２５（ラフイノースのＲｆを１
．００として）の単一のスポツトを示す部分を濃縮乾固
して、マルトヘキサオースが無色の粉末で得られる。同
時に、Ｒラフイノース＝０．４１の単一スポツトを示す
部分を濃縮乾固して、マルトペンタオースが無色の粉末
で得られる。又、一方セルロースカラム（展開溶媒；ｎ
−ブタノール・ピリジン・水・酢酸：一６：４：３：１
）を用いても、同様にマルトペンタオース及びマルトヘ
キサオースを単離することができる。

さらに、必要があれば水に溶解し、エタノールを加えて
再沈澱法によつて精製することもできる。

ＳＦ−１１３０株の培養の場合には、マルトペンタオー
スとマルトヘキサオースの生成比は、培養条件にも依存
するが、通常マルトペンタオースが主成分で、マルトヘ
キサオースが副成分である。さらに本発明の方法におい
てＳＦ−１１３０株を培養した場合には、培養物中には
、本発明の目的物であるマルトペンタオース、マルトヘ
キサオース以外に、ＳＦ−１１３０ｘ１及びＸ２物質（
両物質をＳＦ−１１３０ｘ物質と総称する）（本出願人
の同日出願に係る特願昭５１一 号参照）も生
産、蓄積されている。ＳＦ−１１３０物質は抗菌性を有
する中件のオリゴ糖を本体として水に易溶、メタノール
、エタノールに難溶、アセトンに不溶な物質であり、Ｓ
Ｆ−１１３０ｘ物質は抗菌性及び弱塩基件を示すオリゴ
糖に属し水に易溶、メタノール、エタノールに難溶、ア
セトンに不溶な物質である。これに対して、本発明のマ
ルトペンタオース、マルトヘキサオースは中性で水に易
溶、エタノール、アセトンに不溶なオリゴ糖であるから
、上記の如き性質の差を利用して相互に分離できる。す
なわち、例えば、ＳＦｌｌ３Ｏ株の培養液を酸性済過し
て得られた沢液を強酸件イオン交換樹脂を通すと、ＳＦ
−１１３０ｘ物質は該樹脂に吸着されるが、マルトペン
タオース、マルトへ午サオースは吸着されずに通過する
。通過液を活性炭に通してマルトペンタオース、マルト
ヘキサオースを吸着させた後に、水洗し、さらに１０〜
２５％の範囲の種々な濃度でエタノールを含む水で順次
展開すると、マルトペンタオース、マルトへ千サオース
は順次溶出される。この際、溶出順位が異なるので、マ
ルトペンタオースとマルトヘキサオースとは異なる溶出
分画に集中し溶出して得られる。本発明で得られたマル
トペンタオース及びマルトヘキサオースは、表−１のよ
うな理化学的性質を有する。

尚、参考の為に、本発明で得られたマルトペンタオース
の核磁気共鳴吸収スペクトル曲線を第１図に示した。

又、両物質は中性であつて、これらの各々１Ｎ一硫酸で
１００℃、５〜６時間加熱すると、ペーパークロマトグ
ラフイ一（ｎ−ブタノール ピリジン・酢酸・水＝６：
４：１：３）で単一スボツトを与えこのものはグルコー
スのスポツトと一致した。又、β−アミラーゼによる酵
素分解において、マルトペンタオースは、前記のペーパ
ークロマトグラフイ一で、マルトースとマルトトリオー
スのスポツトを与え、又、同様にして：マルトヘキサオ
ースは、マルトースのみのスポツトを与えた。以上のこ
とを総合すると、この両物質は、中性のオリゴ糖に属す
るマルトペンタオース及びマルトヘキサオースに相違な
いことは明白である。

マルトペンタオース及びマルトヘキサオースは、Ｓａｒ
ｃＯｍａｌ８Ｏの腹水腫瘍を移植したマウスにおける細
胞免疫試験（遅延型皮膚反応法）においノ て、ＳＦ−
１１３０ｘ物質の示す免疫保護作用を増強することが認
められた。その１試験例を表一２に示す。尚、この試験
方法は、ＩＣＲ系マウス（１群６匹）にＳａｒｃＯｍａ
−１８０の腹水腫瘍移植２４時間後、検体（各薬物）を
１回皮下投与し、移植２日目に剃毛腹部に５％塩化ピク
リルエタノール液を塗布して感作し、その後、各薬物を
１日１回４日間投与した。

移植後９臼目にｌ％塩化ピクリルオリーブ油溶液を両耳
の表裏に塗布して、２次感作し、その２４時間後の耳の
厚さの増加度を測定した。その増加率により遅延型皮膚
反応の程度を判定したものである。更に、マルトペンタ
オース及びマルトヘキサオースは、それ自体には抗菌作
用はないが、ＳＦ−１１３０ｘ物質の示す抗菌力を増強
する作用を有することが判明し、その試験例を表−３に
示した。

本条件では、マルトヘキサオース及びマルトペンタオー
ス自体は抗菌活性を示さない。しかしながら、マルトヘ
キサオース、マルトペンタオース、又はそれらの混合物
は細菌感染症に対して感染防御効果を示し、免疫賦活剤
として有効であることは次の試験例の通りである。

即ち、ＪＣＬ：ＩＣＲ系雄マウスを１群８匹として用い
、実施例１で得たマルトペンタオースとマルトへ午サオ
ースとの混合物からなるの黄褐色粗粉末の水−エタノー
ル再沈澱物をＰＨ７．２の燐酸に緩衝液溶解し、１００
η／Ｉ＜９／日及び２０η／Ｋｇ／日の用量で４８時間
間隔で３回腹腔内投与した。最終投与終了７２時間後に
、スタフイロコツカス・アウレウス・スミスＳ−４２４
株の培養液を生理食塩水で稀釈後、５％ムチンを加えて
腹腔内接種した。

細菌接種容量は０．５ｍ１／マウスとした。接種後５日
間、マウスの生存数も観察して、下記の表−４に示す結
果を得た。マルトペンタオース・マルトヘキサオース混
合物は、無処置対照群（コントロール）に比べて、１０
０７ｒ１ｆｉ！／Ｋｇ投与では、細菌接種菌量のＬＤ５
Ｏ値（感染防御効果の目安となる）について約４２．９
倍、２０η／Ｋｇ投与では約６．２倍増加がみられた。

従つて、本発明で製造されたマルトヘキサオース又はマ
ルトペンタオース又はこれらの混合物は細菌感染に対す
る免疫賦活剤として使用できることが明らかである。次
に本発明の実施例を示す。

実施例 １ ストレプトミセス・ミキソゲネスＳＦ−１１３０株（微
工研菌寄第６７６号）を、水あめ５．０％、大豆粉２．
５％、小麦胚芽１．０％、塩化ナトリウム０．２５％の
液体培地２０１（ＰＨ７．Ｏ）に接種し、ジヤーフアー
メンタ一にて、２８℃で６６時間通気攪拌培養を行なつ
た。

培養終了後、培養液を酸性済過（ＰＨ３）し、淵液１５
１を得た。この炉液１５１を、ダウエツクス５０Ｗ×２
のＨ＋型の強酸性イオン交換樹脂２１をつめたカラムを
通過させ、この通過液を、和光製活性炭２．５１をつめ
たカラム（８×５０ＣＴＩＬ）に吸着させ、充分水洗し
たのち、混合溶媒１０、１５、２０、２５、３０％の各
エタノール水で順次溶出し、２０〜２５％エタノール水
の分画１０１を濃縮乾固して、マルトペンタオースとマ
ルトヘキサオースの黄褐色の粗粉末２０９を得た。

このうち、１５９を水１００ｄに溶解し、和光製活性炭
３５０ｍＺを充填したカラム（４．０×３３ｃｍ）に吸
着させ、充分水洗したのち、１０１１５、２０，２５％
各エタノール水で順次溶出し、溶出液は、１５ｍ１づつ
分取した。

各フラクシヨンについて、ｎ−ブタノール・ピリジン・
酢酸・水（５・４・１・３）の混合溶媒を用いてペーパ
ークロマトグラフイ一を行ない、硝酸銀試薬でＲラフイ
ノースニ０．４１（ラフイノースを１．００として）の
単一スポツトを示す区分フラクシヨン滝２６１〜３４９
を濃縮乾固して、マルトペンタオースの無色の粉末を得
た。この粉末を２０ｍ１の水に溶解し、淵過後、戸液に
、エタノール１８０ｍ１を徐々に加え、再沈澱させ、無
色の粉末４．８ｆ！を得た。

同時に、Ｒラフイノース＝０．２５を示す区分フラクシ
ヨン滝３９６〜５００を同様に処理し、マルトヘキサオ
ースの無色の粉末３．１ｆ！を得た。実施例 ２ 実施例１で得られた黄褐色の粗粉末４．０９をごく少量
の水に溶解した後、少量のセルロース粉末に吸着させ、
乾燥後、セルロース３００９を充填したカラム（４．５
Ｘ１８ｃｍ）上にのせ、ｎ−ブタノール・ピリジン・酢
酸・水（６：４：１：３）の混合溶媒で展開した。

溶出液を１２ｍ１づつ分取し、各フラクシヨンについて
、上記混合溶媒を用いて、ペーパークロマトグラフイ一
を行ない、硝酸銀試薬によつて、Ｒラフイノース＝０．
４１の単一スポツトの分画フラクシヨン滝１４３〜２２
４を実施例１と同様に処理して、マルトペンタオースの
無色の粉末１．０５９を得た。同時に＊Ｒラフイノース
＝０．２５を示す分画フラクシヨ７滉２５０〜３４５を
同様に処理してマルトヘキサオースの無色の粉末７４０
Ｔｎｇを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で得られたマルトペンタオースの核磁気
共鳴吸収スペクトル曲線図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ストレプトミセス属に属するマルトペンタオース又
   はマルトヘキサオース又はこれら両物質を生産する菌を
   好気的条件下に培養して、培養液中に、マルトペンタオ
   ース又はマルトヘキサオース又はこれら両物質を蓄積さ
   せ、これを採取することを特徴とするマルトペンタオー
   ス又はマルトヘキサオース又はこれら両物質の製造法。