JPS5942455A - 非ａ、非ｂ肝炎抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は非Ａ１非Ｂ肝炎抗原に関する。プラムペルり（
Ｂｌｕｍｂｅｒｇ、　Ｂｕｌｌ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ
、　Ｍｅｄ、／９乙弘。

１／−０，３７７）による肝炎８表面抗原Ｃｈｅｐａｔ
ｉｔｉｓ　Ｂｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｔｌ（７ｅｎ　（Ｈ
ＢｓＡｇ　）　〕の発見及びフエインストン等（Ｆｅ１
ｎｓｔｏｎｅ　ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　／
９７３ｒ／ｇ２．　／θ２乙〕による肝炎Ａウィルス（
ｈｅｐａｔｌｔｌｓＡ　ｖｉｒｕｓ　（ＨＡＶ　）　）
の発見以来Ａ型及びＢ型肝炎は特異的血清学的試験によ
り区別され得るようになった。他の型の肝炎であってそ
の作用因子が未同定である腰仙の型の肝炎ビ非Ａ１非Ｂ
肝炎″と表記している。アメリカ金銭国ではＨＳｓ　Ａ
ｇ陽性の供血者の血液を現在のところ輸血に使用しない
が非Ａ１非Ｂ肝炎は輸血後の肝炎の症例の約ｇ９チの原
因をなす（Ａｌｔｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｌａｎｃｅｔ
　２　：　ｇ３ｇ−ｇ’ｌ／、　　　／ｑ７３．　　Ａ
ｌｔｅｒ　　　ｅｔ　　　ａｌ、、　　　Ａｍ、　　　
Ｊ、　　Ｍｅｄ、　　　ＳｃＬ＋、２７０　：　３２９
−３３１１．、　／９’Ｒ）。５単位又はそれ以下の単
位の輸血を受けたアメリカ人の５．ｌＩ〜／ｇ、５％は
非Ａ１非Ｂ肝炎を発現する（　Ａｌｔｅｒｅｔ　ａｔ、
、　　前掲文献）。　″肝炎Ｃ′″という名称がこの病
気に対して提案されたけれども大部分の臨床家と研究者
とはこの病気を非Ａ１非Ｂ肝炎と呼んでいるがその理由
は状況証拠からこの病第を移す因子がひとつ以上である
と想像されることにある。

非Ａ１非Ｂ肝炎の診断は血清学的試験による既知の病原
因子即ち：ＨＡＶ及びＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、サ
イトメガロウィルス、エプシュタインーバ／ｌ／　（Ｅ
ｐｓｔｅｌｎ−Ｂａｒｒ　）　　ウィルス、水痘帯状庖
疹（ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ　）　　又は単
純庖疹の除外に依然としてもとづいている。

従って本発明の目的（寸非Ａ１非Ｂ肝炎抗原の単離方法
の提供にある。他の目的は非ＡＸｙｌ＝ｓ侃原の検出方
法の提供にある。更に他の目的は免疫原としての効力を
もつと共に非Ａ１非ＢＪＩ−１−扱に対するワクチン製
造用として使用可能な非Ａ１非Ｂ肝炎抗原の提供にある
。なおその他の目的は診断剤としてｓｒ＋＋用され得る
非Ａ、非Ｂ肝炎抗原含有組成物の提供にある。これら及
びその他の不発明の目的は下部によって明かとなろう。

粒子寸法約λ、θ〜約３．Ｏｎｍ　及びＣ５Ｃｔ　中の
密度約／、２’ｌ〜約／、２９ｆ／ｌｎｌを有する非Ａ
１非Ｂ肝炎抗原は同密度集合帯法及びクロマトグラフィ
Ｇこよる分画法にもとづき単離塔れる。

本発明に従うと 下記の皇項Ｐ［Ｊち： （ａ）　　肝臓病の診断に用いられる特異的検査により
辿ｊ定された肝中の高量の酵素、 （ｂ）　　黄痕を含む臨床的徴症の可能性、及び（Ｃ）
　　診断（）査により決定される現在活性なＨＡＶ又は
ＨＢＶによる感染の不存在 により非Ａ１非Ｂ抗原をもつと臨床的に診断された患者
の血液 から標準的方法によシ血清を採取する。この直情の使用
により供血者から得られた血清をスクリーニングして非
Ａ１非Ｂ抗体を含有する血清の所在を検する。竹異的血
ｉｌ′ｉ！試料中の抗体の存在の測定のために免疫拡散
検査法を用いる。

成る拙清が非Ａ１非Ｂ抗原をもつと決定されるとこの血
清を同Ｗ１′度集合帯法に供して密度勾配をもつフラク
ションについて抗体（免疫拡散検査法によシ予めその存
在が既知されている）使用の下に抗原活性を検する。密
度勾配は例えばＣ５Ｃ１゜ＮａＢｒ　　又はショ糖中で
の密度勾配である。ＣｓＣ１の場合には非Ａ１非Ｂ肝炎
抗原は密度約／、、２１１〜／、２９ｙ−／ｆｕｌｌの
密度範囲内に見出される。この抗原は粒子寸法約λ〜約
５ｎｍ　　ｆｆ肩すると共にｐ■１４〜／／において安
定である。この抗原は約４１　Ｑ　ｎｍ以下の大きなウ
ィルス様粒子群の下部（サブユニット）成分であシ得る
ものであシこのサブユニット成分は約／、３／〜Ｅ／、
３ＦＦ／ｒｎｌの比較的高い密度範囲内に見出され、こ
のサブユニット成分は同じ抗原性を有する。

抗原活性をもつ密度勾配フラクションを集めてこれをク
ロマトグラフ処理にかける。コラムから得られたフラク
ションを前述の抗体の使用下に免疫拡散検査法にかけて
分析し、抗原存在が認められたフラクションを集める。

分子量約２５０　、０００〜約／　、　３００　、００
０ダルトンを有するフラクションの中に抗原性が発見さ
れた。最高抗原性は分子量約ｌＩＯθ、０００〜約ｂｏ
ｏ、ｏｏｏダルトンをもつフラクシコン中に見出された
。ナトリウムドデシルサルフェートで処理された抗原は
分子量約ｓｏ　、　ｏｏ。

ダルトンをｔつ成分であることがウェスタンブロック法
Ｃｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｃｋ　ｍｅｔｈｏｄ、　Ｔｏ
ｂｌｉ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｌ：、
　　Ｖｏｌ　、　７乙、　　ｐ、　　’７３３０（／ｑ
７９））　　によって示された。

コラムからの溶出用の溶剤でない他の溶剤中での抗原で
あることが望まれるならばフラクションを透析し得る。

濃度約／：／、０００〜約／：１０．０００　のホルマ
リンを用い約２’ｌ〜約／２０時間、適宜の温度で処理
することにより抗原をワクチン用に不活性化させ得る。

好適条件はホルマリン濃度約／：４ｔ、０００、処理待
間約７．２時間、漉度約３３〜約グ／Ｃである。

抗原を任意にミョウバン上に吸着させて免疫原性を増加
させ、任意に他の補助剤と共に投与し得る。

本発明の非Ａ１非Ｂ肝炎抗原は感受性をもつ動物種例え
ばチムパンジイ及びヒトに対し約／〜約７００μｍ、好
適には約５〜約ｓＯμｚ１最も好適には約１０〜約３０
μ２の投与量において免疫原性である。下記の鎖側は本
発明を例示するが本発明を該例に限定するものではない
。

例　　／ 非Ａ１非Ｂ肝炎抗原の単離 穐清中グルタミック　オキザロアセティツクトランスア
ミナーゼ酵素の高量及び匍消中ダルタミツク　ピルベー
ト　トランスアミナーゼ酵素の高酸、並びに黄痕の存在
にもとづく肝炎の臨床的便症を持つと共に同位元素標識
免疫診断検査法によりＨＡＶにも又はＨＢＶにも詐った
ことがないと決定された患者から採血し、これから公知
方法で血清を侑た。この血清試料を諸抽清試料のスクリ
ーニングのために使用して免疫拡散検査法（Ａｂｂｏｔ
　ｒｈｅｏｐｈｏｒｅｓｌｓ　ｐｌａｔｅ　）　　にも
とづき抗体含有面精のＤ［在を決定した。

非Ａ１非Ｂ抗原含有崩清（７ｍｌ）をＣｓＣ６密度：／
、／、／、２、／、３、／、り及び／、乙の５個の６．
２ＩｎｌｃＤｆｉｌから成る。３／ｒｎｌのＣｓＣ７溶
液によって検した。ペックマン回転器（Ｂｅｃｋｍａｎ
ＳＷ　２７　ｒｏｔｏｒ　）中に第一番目の拘清試料を
置き２３．００Ｏｒｐｍ　で／６時間遠心処理して密度
勾配を測定した。／ｄのフラクションを取り水に対して
透析した。諸フラクションを凍結乾燥し蒸留水で２００
μｌへ再構成した。諸フラクションについて既述の抗体
使用下の免疫拡散検査法により抗原活性を検した。抗原
活性は密度／、、２４〜／、、２９？／／ｎｌの範囲に
対応し、最高活性は密度／、２７ｊｉ’　／　ｍｌに対
応することが見出された。

長さ約、２５０、直径約７１１１１１の容量１０ｍ１の
クロマトグラフ用コラム（５ｅｐｈａｒｏｓｓ　ＣＬ乙
日ｃｏｌｕｍｎ）に常法により吸着剤を詰めた。上部記
載の透析され再構成された密度勾配フラクション（複数
）の集合物のθ、りｍｌの負荷量をコラムへ供給した。

このコラムをリン酸塩緩衝ｆヒ食塩水（ＰＢＳ）で７５
分間当シ約／　ｍｌの速度で溶出し０．５ｄずつのフラ
クション＜　ｒ、ａ　′Ｉｊｉ）を集めた。次にこれら
のフラクションを凍結乾燥し／フラクション当シ１００
μｔの割合の蒸留水で再構成した。次にこれらのフラク
ションについて、予め単離された抗体使用下の免疫拡散
検査法により分析した。最高抗原活性は分子量約りｏｏ
、ｏｏｏ　ダルトンを有するフラクションに該当し、活
性を４、つ分子量ｌｌｌ０囲は２５θ、θθθ〜／、３
００．θＯθグルトンであった。

例　　コ 例／でセファローズ　ＣＬ乙Ｂ　コラムから溶出された
物質は分子に範囲２３０．０００〜／、３θｏ　、ｏｏ
。

ダルトンを有し、これを集めて濃度／　：　’１．００
０のホルマリンで７．２時間３７Ｃで処理し抗原を不活
性ｆヒすることによりワクチンとして好適に使用される
物質を製造した。

例　　３ 例コの不活性化製品をミョウバン上に吸着させ、ｐｌ＋
６．０〜７１ｇに緩衝ｆヒされた窮理食塩水中にこれを
懸濁させた。

例　　ダ 例／のセファローズ　ＣＬ／、Ｂ　　から溶出された抗
原性憬有フラクションを蒸留水に対して透析することに
より蒸留水含有の非Ａ１非Ｂ抗原組成物を製造した。こ
の組成物は例２呂己載の辿シの不活性比処理の後にワク
チンとして有用であり、又そのまま抗原として或は診断
用抗原として弔用である。

例　　Ｓ 例／のセファローズ　ＣＬろＢから溶出された抗原性保
南フラクノヨンを貧塩水に７Ｊ’　して透析することに
より食′垣水含本の非Ａ１非Ｂ抗原糾成物をＺ’ｂ　’
ｉＭした。この組成物は例２記載の連υの不活性化処理
の後にワクチンとして有用であり、又そのまま抗原とし
て或は診断用抗原として有用である。

例　　乙 セファローズ　ＣＩＪ、Ｂコラムから溶出して得られた
約／　Ｑ　ｍ！／の非Ａ１非Ｂ肝炎抗原に対し１濃塩酸
でｐＨ乙、ｇＶＣ調節されたトリス緩衝液（ｔｒｌｓＭ
ｆｅｒ　）の５ｍノ中の、２％ナトリウム　ドデシル　
サルフェート及び５％　２−メルカゾトエタノールを用
いて核抗原を処理した。この処理溶液を７００ｃに３分
間側温保持（７てがらこの溶液に対しＱ　、　５　ｍｌ
の３０チグリセロール及びｏ、夕係ブｏ　Ｊｈ　７−１
−　／−ル背の追跡用染料を加えた。こ（１）調製物を
、／２．、ｒチポリアクリルアミドダルｑｓ。

ｍ　のコラムであって該ダルの上に更（ｆこ６゛チの爪
ｍ用ダルｆｆ有する該コラムに対して鏑用した。このダ
ルコラムを、ｉｏｏｇルトの１区界内で八、５−　ｔノ
ドリス−グリシン−ナトリウム　ドデシ／Ｌ／　　サル
フェート緩衝液によシ展開させた。展開を７５時間継続
した。クマシー青で着色さ？て追跡実験を平行して行う
ことにより上記のグル中にｓｏ　、ｏｏθダルトンの分
子量を有する帯（バンド）の４任をフめた。この帯の部
分をグルがら切り取り２０　ｍｌ生理食塩水１０．１％
ナトリウム　ドデシル　サルフェート混合溶液を用いて
溶出処理した。このナトリウム　ドデシル　サルフェー
ト溶液を生理食塩水に対する充分な透析処理によって除
去することによシワクチン中へ処方するために使用し得
る製品を得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　約２．０〜約５　、０　ｎｒｎ　の粒子寸法及
   びＣ３Ｃｔ中約／、２弘〜約／、２９ｆ／ｍｌの密度を
   有する粒子群から本質的に成ることを特徴とする実質上
   線ｆヒされた非Ａ１非Ｂ肝炎抗原。 （２）　　約Ωｓｏ、　Ｏｏｏ〜約／、３００，０００
   ダルトンの分子量を有する特許請求の範囲第＋１＋項に
   記載の抗原。 （３）　　約５０．θＱＯグルトンの分子量を有する特
   許ＮＩ”！求の範囲第（１）項記載の非Ａ１非Ｂ肝炎抗
   原の下部成分としての抗原成分。 （４ン・特許請求の範Ｉｉ！１ｌｌＩ第（１）項記載の
   抗原を水性媒質中に含有することを特徴とする組成物。 （５）　　媒質が水、食塩水又はリン、１蔽塩緩衝比食
   塩水である特許請求の範囲第イ４）項に記載の組成物。 （６）ミョウバン上に吸着されている特許請求の範囲第
   （１１項に記載の抗原。 ＋７）　　゛ｐ許請求の範囲第（１）項記載の抗原の免
   疫学的有効量と生理学上許各可能な媒質とから成ること
   を特徴とするワクチン。 （８）　　診断検査において免疫複合体を形成するため
   の有効量で特許請求の範囲第（］）項記載の抗原を水性
   ｆＲ質中に含有することを特徴とする診断剤。 （９）　　非Ａ１非Ｂ肝炎抗原を含有する血清を同密度
   犯合・１１）法にかけてＣ３Ｃｔ　巾約／、、２１Ｉ〜
   約／、Ω７１・／ｄに４トシい密度と約λ、０〜約５　
   、　Ｑ　ｎｍの粒子寸法とを有するフラクション／を選
   択することを特徴とする非Ａ１非Ｂ抗原の単離方法。 ００　分子量約２３０．０００〜約／、３０θ、００θ
   ダルトンを有する粒子群が分離されるように１μ択フラ
   クシヨンを処理する特許請求の範囲第（９）項に記載の
   方法。 （１Ｂ　処理の結果分子量約’、１００，０００〜約ｂ
   ｏｏ、ｏｏ。 グルトンを有する粒子群が分離される特許請求の節回７
   ．１　（９１項に記ｉ或の方法。