JPS5942883A - 培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は好気性微生物をオフガスを出さずに培養する
方法に関するものである。

従来、好気的な醗酵を１栗的に実施する場合通気攪拌槽
が普通に用いられてきた。グルコン酸醗酵の如ぎ酸化醗
酵においては特に酸素要求量が大きく、大量の空気の導
入と、それに伴なう大量のオフガスの排出が避けられな
いものであった。

そして、大量の通気は泡立ちのトラブルをひきおこし、
醗酵槽容積の有効な利用をさまたげ消泡剤の使用を必要
とし、それによる醗酵液の汚染などの不都合をもたらし
ていた。

本発明は、このようなオフガス排出に伴なう不都合を一
挙に解決する、全く新しい培養法であって、好気性微生
物の培養液中に高純度酸素を・導入し、密閉状態で培養
をおこなうことにより、培養終了時まで、オフガスを事
実上排出させずに好気性培養をおこなうことを実現した
ものである。

本発明で培養液中に導入される高純度酸素とは空気に対
比して用いる用語で、純酸素と、それに近い高純度、通
常９５％以上、好ましくは９９係以上の純度の酸素を意
味する。

以下グルコン酸醗酵を例にとって、従来の通気法と対比
させつつ本発明を説明する。以下の例では、すべて１８
１ｃｇの醗酵液中で２０モルのグルコースをグルコン酸
に変えている。従って酸素の理論消費量は１０モルであ
る。

従来の通気法において培養液中に導入−される空気量を
例５に基いて計算してみると、２７　Ｘ　６０Ｘ１２＝
１９４４０Ａ、その中に含まれる酸素は４０８２２（約
１７０モル）で、理論消費量の士数倍にのぼる。即ち、
反応を進めるためには大社の過剰空気が文字通り「通気
」されているのが実情であった。もし、空気の代りに酸
素を用いれば窒素分だけはオフガス量が減ることは当然
に期待できるが、大過剰分の酸素がある限りオフガスは
本質的になくならない３．また、微生物の生活、増殖、
その他の副反応によって生ずる炭酸ガスもオフガスの一
部を構成する。

空気に代えて酸素を用いるというアイディアは上記のよ
うな単純な置換では発泡トラブルの原因であるオフガス
を本質的になくすことができないだけでなく、２つの難
点が予想される。

その第一は、酸素濃度２１チの空気に適応した地球上の
生物にとり、一般に高濃度の酸素が有害なことであり、
その第二は上記のように酸素の利用率が低いと高濃度酸
素の使用が経済的にひきあわないことである。酸素利用
効率を高めるために排出された未刊用１ν素のりザイク
ルをはかることは装置及び操作を複雑にする。

第一の点については、微生物の場合にも次のような例が
知られている。即ち、一般に好気性下の微生物反応では
液中の反応物質及び酸素が消費されて菌体増殖および代
謝生産物が生産されるか、例えば、エタノールｆ化性菌
やグルタミン酸生成菌の場合にみられるように、菌株に
とって最適な溶存酸素濃度が１ｆＰＩＩｌ付近に存在し
、その近辺の６謎度以外では酸素は微生物の活動に対し
Ｉｌｌ害作用を示す場合がある。また、生成した炭醇ガ
ス濃度も高すぎる酸素濃度と同様の阻簀作用をこれらの
菌に示す場合がある。

このように、好気性微生物の培査における１（２４Ｊｉ
ちトラブルの原因となっているオフガスは不＋Ｊ’　ｊ
；Ｚのものと考えられてきた。そもそもオフガスを全く
排出させずに酸化醗！１孝をおこなわせるなどというこ
とは、これ迄可能性すら考えられたことはなかったつ ところが、全く意外なことに、高純度酸素を導入して密
閉状態で培養をおこなうとオフガスを排出させない培養
が実現でき、］１０常の通気法のような大過剰の酸素量
を導入しないにもかかわらず、むしろ短い時間内で醗・
背を遂行できる方・去が見出された。

密閉状態での’６ｆ’％とは、ガス出口のない状態で培
養することをＱ味している。通常の通気攪拌槽のオフガ
スラインを閉じた形で実施するのが最も普通の形である
１、 ガス出口がフ：Ｉ：いので液に吸収されないガスは培養
器内の圧力を高めてゆく。好気培養に関する従来の常識
からいうと酸素を導入しつつ培養を進めてゆくうちに圧
力はどんどん上り、たちまち培養器の耐圧限界に達して
、それ以上培養を進めることが不能になると予想される
。

しかし、尋人する酸素含有ガスとして高純度酸素を用い
、溶イｒ、酸素濃度を指標としてこれを導入してゆくと
、培養器内の圧力上昇は意外にも小さく、通常の常圧−
潴１ぞ槽の許容１１ｕ・１川…ＩＬ囲内で実用的に十分
な速さで好気性培養を進めることが可能であることが見
出された。

培養液中のＭ存「賞素濃度は従来の′ｒ気気通気法おい
ては１〜２　ｋｇ　／　ｃｔＡの加圧下で、かつ大過剰
の空気を用いても２〜３　Ｐ迄であった。しかし高純度
酸素を導入する本発明では容易に高い溶存酸素濃度に到
達でき、少なくともｉ　（ｌ　ＩＩＩＩ＋　、好ましく
は１５〜３０ｐｉＩＩｎ前後の溶存酸素濃度を保つよう
に高純度酸素を導入するのがよい。このようにすると内
圧はむやみに上昇せずに密閉状態で醗：”ＩＹを進める
ことができる。

グルコン酸ｌｌＩ！酵の例を挙げてこれを、；）す明す
ると新しい菌体を用いた場合　（例１）は、培」σ液中
の溶存酸素濃度１５〜２０ＰＦｍにしてからグルコン酸
生産活性が本格的に発揮されろ迄数時間の誘導期間があ
り、この間はガス導入量も内圧も低くおさえられる。誘
導期をすぎると酸素消費が活発になり、溶存酸素濃度を
上記の値に保つように酸素を導入してゆくと約５０１／
時の速さで入り、内圧もこの問わずかに上昇してゆく、
誘導期も含め１２時間に約３００−（３の酸素が導入さ
れるが、内圧は１　ｋｇ／　ｃ＋Ｎ　Ｇ以上には上らな
いまま嫌１’ｌ羊を完結させることができる。杓利用菌
体を用いた場合（例２）は誘導期間がな（、はじめから
酸素をよく吸収し約６時間でｉｆｉ　Ｊ４ｔを終え、９
６％収率でグルコン順が得られる。菌体再利用を更にく
りかえして密閉状態のグルコン酸＋’ｌ酵をおこなうこ
ともできる。

コノ場合、グルコン酸収率の低下を防ぐために１０〜４
０泊の鉄イオンを菌体再利用グルコン１１１２醗酵培地
に添加するのがよい。新菌体再利用菌体いずれの場合も
ｌｌ＠酵液血液面上の層はわずか（厚さ１ｃｍ程度）で
、対応する空気通気法（例４、例５）の場合にジャーフ
ァーメンタ−の３分の１を占める上部空間が泡で６１４
たされている状態であったのと比べて著るしいちがいが
ある。また醗酵所要時間は対応する空気通気法に比べて
半減した。

なお、上記の例は槽内の液充填率を６０チに統一して発
泡状態の比較観察をおこなったが、発泡の著るしくない
本発明では、例えば８０〜９０％という、より商い液充
填率でも実施できる。

このような培養方法が実現１月１ヒてあったのは、第一
に、一般的には有害と思われる酸素に対し、使用条訃下
では事実上書を受けない微生物が現実に存在したこと、
第二に高純度酸素を用いることにより順素利用率かけた
はずれによ（なり、大過剰量の酸素を用いないでも実用
的な醗ｊ稈時間内に培養を終えることが可能であったこ
と。第三に炭酸ガスなど他の排ガス成分の発生が密閉状
態での培養を許さないほど大量でなかったこと。第四に
密閉状態での培養により醗酵槽の内圧は上昇するが、そ
れは酸素の消費と炭酸ガスの溶解を促進するので無制限
に上ることはないこと。などの事情がすべて有利にはた
らいた結果であると考えられる。

純酸素を導入し、密閉系で培養すれば、これら）各項目
カスへてかくも好都合にはたらき、オフガスを全く排出
せずに培養遂行できる酸化醋・詳の実例が現実に存在す
ること全く予想されてぃなかった。

本発明は実施例に示すように、グルコン酸醗酵につき、
まず実現されているが高濃度の酸素に耐える微生物の使
える好気性微生物の培養につき同様に適用できる。

耐酸素性の微生物は既存のものを利用しても必要により
育種してもよい。本発明においては密閉した培養器の内
圧が高くなりすぎないような不活性副生ガスの少ないよ
うな培養方法に好ましく適用できろ。

このような対象について、（１）所要の酸素源は純酸素
として７Ｊ入すること、（２）培養を密閉状態、即ちオ
フガス４Ｊ１出のない状態で実行すること、０２つの手
段を用いることを特徴とするのが本発明である。

微生物の耐酸素性は当業者なら例えば実験により容易に
確認することができ、それを通じて実施例で示したグル
コン酸醗酵以外のものへの適用が可能になる。

本発明により好気性培養において従来不可避とされてい
たオフガスによるトラブルが全く解消する。オフガスに
よる泡立ちがなくなるので、醗酵槽内の液充填率を市く
とることができ、高純度酸素使用による醗酵時間旬縮と
あいまって、設備の有効利用に役ｑつ１．もちろん消泡
剤の使用とそれによる汚染、泡弘ちによる操作性阻害な
どのトラブルも解消する１、 酸素は　リサイクルを必要とぜず、事実上全部反応に費
されるので峻素利用効率ばｌ　００　％に近い。従来の
通気法が理論量の何１０倍もの酸素を含む空気を導入し
ていたのと著るしいちがいであり、設備、動力の両面で
簡略化できる。

本発明では培養中にオフガス捜出をせずに高、純度酸素
を導入するので醗酵槽内圧が少し上昇するが、高圧に耐
える特別の醗酵槽を用いなければ培養の継続が不可能に
なるほど着るしく内圧が上ることはない。このことは前
記のように訂存酸素濃度を指標として、これをｘｏｌ１
ｍ以上（普通１０〜５０１ｉ１＋１１１　）に保つよう
に導入する酸素酸の割前１と高純度酸素に耐え、かつこ
れを高度に利用する微生物の使用により実現できた。

培養液中の溶存酸素濃度は培養器内の酸素分圧、従って
全圧により影響されるので、酸素４人柚の制御は圧力を
指標としておこなうことも可能である。要するに、高純
度酸素の導入は一定速度で、むりやり押しこむのでなく
、除重槽内の状態に応じて制御された割合で導入すべき
である。、酸素分圧が上れば溶存酸素が上り、その状態
での酸素消費活性とのかねあいで導入量かぎよる。また
、多少の副反応があっても炭酸ガスの分圧が上れば醗酵
液中へのその溶解が促進されるというような平衡作用が
５まくはたらき、全体としてむやみな圧力上昇は回尚さ
れる。

本発明の実Ｉへ例として挙げたグルコン酸醗酵で用いた
微生物は高い濃度の酸素に耐え、菌体増殖が少いので炭
酸ガスの発生が少く、ｊした炭酸ガスの蓄積による阻害
作用も受けない。また高純度酸素の使用により過！１！
Ｉ］酸素を仕込まないでも速やかに高い酸素利用効率を
もってグルコースをグルコン酸に酸化する。このような
例ではオフガスを排出せずに純酸素を導入しても醗酵槽
内圧は醗酵終了までに’　”ｇ／　ｃｒＭ　Ｇ　ｇ度に
とどまる。これは通常の醗酵漕の＋Ａｌｌ　ＩＥ限度内
であるから、本発明は特別の高圧’ｌ＠　’ｌｉ装置を
用いなくても実施できることになり、きわめて好都合で
ある。

高純度酸素使用下での酸素反応性や炭酸ガスなど副生ガ
ス発生献の点で多少劣る対象に適用する場合、液充填率
を高めた場合などは短時間に醗酵な終了させるためには
上の例より商い反応圧力を必要とする場合もあり得る。

本発明では耐酸素性の微生′吻を用いるが、グルコン酸
醗酵の場合は公知の菌株で十分使用できる、。

グルコン酸シＶ１．＃、の培地その他の条件も公知のも
のでよいが、菌体再利用をくξがえず場合は、回数を重
ねるとグルコン酸収率が低下する場合があるので、鉄イ
オンを１０〜４０１’ｐＨｌ添加した培地を用いるのが
よい。これにより菌体再利用と高溶存酸素の醗；酵との
両方による醗酵所要時間の短縮が１０回以上もの菌体再
利用くりがえし回数にわたり変更できる。

このように通常の空気に代えて理論風に近い叶（例えば
１〜１．５倍）の高純度酸素を用いればオフガス出口を
閉じた通常の通気攪１１ミ式幡１１季憎で本発明を実施
できる。

高純度酸素の具体例として工業的規模で供給されている
９９チ以上の酸素が挙げられる。酸素以外の不活性ガス
濃度が高くなると液に吸収されずに培養器の内圧を高め
るので好ましくない。使用できる酸素両度は培養におけ
る酸素要求量、装置の耐圧限界などによっても呉なるが
、通常９５チ以上のものを用いる。

培養の終了は基質の消失、未反応酸素量の増大など適当
な方法で知ることがでとる。１例えばグルコン酸醗酵の
場合は培養液を一゛定のｐＨに保つように加えられてい
る　カセイソーダ水溶液の供給量の低下により知ること
ができ、グルコース残存濃度（例えば０．１％以下）を
分析して確認できる。

培養終了後、目的物を取得するための分離手段には公知
の技術を使うことができる。

以下グルコン酸醗酵を例として本発明を説明する。液関
係の濃度に用いた係は重量係を意味する。

例１゜ （前培養）　培養フラスコにグルコース３チ、コーンス
テイープリカー１．５％、硫酸アンモニウム０１チ、リ
ン酸−カリウム０１％、硫酸マグネシウム０．０５　％
を含む培地を入れ、殺菌後アスペルギルス・ニガーＩＡ
Ｍ２５３３の胞子１１　Ｍ液（１−／培地１ｏｏｍｅ）
を接ｆ４１シ、：３６℃、２４時間往復振とり培養を行
い、前培養液を調製した。

（グルコン酸醗酵）　上記の方法で調製した前培養液を
グルコンＭ醗酵用培地に５係添加１゜グルコース２０　
％、硫酸アンモニウム０．　＋　５　％、リン酸−カリ
ウム０１チ、硫酸マグネシウム００５％とした液１ｓ／
ｃｇを：３　ｏ　ｅジャーファーメンタ−に仕込み、気
相部を酸素置換後ガス出口を閉じ、３６℃、４００　ｒ
ｐｍで１貴拌しながら市販の純酸素を導入しつつ培ダ←
をおこなった。

培養液のｐＨば４０チカセイソーダ添加によりｐ）（６
，５に自動調節した。純酸素は培養液中の溶存酸素濃度
を１５〜２　ｏ　Ｉｐｎに１′（コ侍するように導入し
た。１２時間後にカセイソーダ添加量かおちたので分析
したところ、残存グルコース濃度は０．１％以下になっ
ており、グルコン酸収率は９５．７％であった。培養中
の内圧は第１図Ａに示す通り、最高’　”　４に９　／
　ｃｒｆｔ　Ｇであった。

例２ 例１の培養液から１過により菌体を集め、これを前培養
液の代りに新しく調製したグルコン酸醗酵用培地に添加
して（計１８１ｃ９　）他の条件は例１と同様に溶存酸
素濃度１５〜２０ｐｐＨｌになるよう純酸素を導入し、
再利用菌体による密閉状態のグルコン酸／ｉｎ　Ｆｉｌ
をおこなった。グルコース残存濃度が０１％以下になる
迄の醗酵所要時間は６時間、グルコン酸収率９６，０％
で、内圧（第１図Ｂ）の最篩は０８０に９／ｃｌｒＧで
あった。

培−１ｊ液中の溶存酸素濃度を２０〜２５ｐＨｌＩｌと
して同様の実験をくりかえした３、醗酵時間５５時間、
グルコン酸収率９５．８　％で内圧（第１図Ｃ）ノ最高
は１１５１Ｃｇ／　ｃ＋ＮＧであ−）だ。

例３ ガス出［１をｉ’ｆ１しない他は例１と同様に溶存酸素
濃度１５〜２０　：ｌ１ｌＩｎを保持するように酸素を
３時間導入したのち、ガス出口を閉じ、酸素導入を続け
た。はじめから１２時間で醗酵が終結しグルコン酸を９
５．０％収率で得た。内圧（第１図Ｄ）の最高は０１６
１’Ｃｇ／ｃａＧであった。

グルコン酸濃度（第１図Ｅ）、ＰＨ６，５に調節するた
めに加えられた４０係力セイソーダ吋（第１図Ｆ）、酸
素導入量は、いずれも３時間付近からたち上り、１２時
間で皓和値に達する。

例４　（比較例） グルコン酸醗酵用培地と前項−７，［（計１ｓｋｇ）を
例１と同様に３０．１３ジャーファーメンタ−に仕込み
、空気を２７１／分（１，ｓＶＶＭ）で囲気した。ガス
出口は調圧弁により外部と通ずるようにし、内圧は１．
０ｋｇ／ｃａＧに保ち、発泡対策として消泡剤（信越化
学シリコー：ｙＫＭｒ５０．０２％）を添加した。他の
培養条件は例１と同様である。

培養中の溶存酸素濃度は２〜３ｒＰＩＩＩで、醗酵終結
迄に２４時間を要した。グルコン順収率は、９４．０％
であった。

例５　（比較例） 例４の培養液からｒ過により一体を集め、これを前培養
液の代りに新しく　ｉｉｌ’ｌ　仙したグルコン漬醗酵
用培地に添加し、他の条件は例４と同様にして再利用菌
体による空気通気（ｔ　ｓ　Ｖ’ＶＭ　）法によるグル
コン酸醗酵をおこなった。

培養中の溶存酸素濃度は２〜４Ｐで・醗酵所要時間１２
時間、グルコン酸収率は９４．６％であった・・ 例６ 例１と同様にグルコン酸ｉＮ袈酵培地と前培養液を仕込
み、気相部を酸素置換後、ジャーファーメンタ−のガス
出口を閉じ、溶存酸素濃度を１５〜２０ｉ１１１１に保
つように純酸素イビυを人しつつオフガスを４ノＩ出さ
せずに培養を」・ｊこ１．Ｉ“つた。Ｔ温度、攪拌、ｐ
Ｈなど他の条件は例１と同様である。

醗＋９所要時間１２時間、最高内圧０．８７　ｋｇ　／
　Ｃ，４Ｇｏ発酵終了後空気で内圧を１〜１．　ｓ　ｋ
ｇ　／　ｃｌｒ　Ｇに上げ、浮上した菌体な槽内に残し
て液を抜取る加圧浮上法で菌体を分離、醗・稈に再利用
した、菌体再利用には鉄イオンとして２０Ｐの硫酸第一
鉄を添加した培地を用い、ガス出口を閉じた密閉法によ
る培養をおこなて〕だ。溶存酸素濃度１５〜２０評など
、他の条件は、はじめσ）もσ）と同様である。所要６
時間、最高内圧０．９０　ｋｇ／Ｃ法Ｇ。

この再利用培養液から更に菌体を分１ｉｉＩｌｌ再使用
し、鉄イオン２０済の培地を加えて恍ζ閉法σ）培養を
くりかえした。結果を第１表に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図Ａ、　Ｂ、　Ｃ，Ｄは培養中の内圧を示す図て゛
あり、第１図Ｅはグルコン酸０度、第１図Ｆは中１　　
釦用に加えられたカセイソ　ダ）１１の変化を／Ｊ＜す
図である。 特許出願人 ダイセル化学工業殊弐会７１ 第１図 蹟＋吋■（吋） 手続補正書（方式） 昭和５７年１２几１ろ日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示　　昭和５７年特許願第１５］７２７号
２　発明の名称　　培　養　方　法 ３　補正を丁イ）渚 事件との１月・１？ｌ′Ｎ　　　特許出願人任　　１９
［大阪府堺市鉄砲町１番地 昭和５７年１１月：３０日（発送日） ５、補正の対象 四層（１１の図面の簡単な説明の欄 ６、補正の内容 図面のに１１竿な説明を下記の、１５に引止する。 ［紀１図は本発明の実施例において、グルコン酸発酵の
状態が培養時間にＬ１ζ１、じて変化する様子を表わし
た図である。線Ａ−Ｆとタテ軸との関係は次の通りであ
る。 Ａ、　Ｂ、　Ｃ及びＤ　培養中の内圧 Ｅ　　グルコン酸濃度

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 好気性微生物の培養液中に高純度酸素を導入し、密閉状
   態でオフガスを排出させずに培養をおこなうことを特徴
   とする培養方法。