JPS5945103B2 - 抗ウルソデオキシコ−ル酸抗体の製造方法およびそれからなる検出用試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗ウルソデオキシコール酸抗体の製造方法およ
びそれからなるウルソデオキシコール酸一の検出用試薬
に関する。

最近、肝機能の診断方法として、グリココール酸、ケノ
デオキシコール酸などを負荷して一定時間後、血中のそ
の胆汁酸濃度を測定する方法が報告されている。

つまり肝機能が正常であると負荷した胆汁酸が肝臓で処
理される結果、血中濃度の上昇は少ないかまたはすみや
かに低下するが、肝機能が低下していると上昇の程度が
強く持続する現象を利用するものである。しかし、グリ
ココール酸、ケノデオキシコール酸の場合、その抗体が
生体内に存在する異種胆汁酸と反応する事と、その胆汁
酸自体が生体内にかなり存在するため、抗体を用いて血
中の対応する胆汁酸濃度を測定した結果は、負荷した胆
汁酸がそのまま血中濃度へ反映したものとはいえない。
したがつて肝機能診断の精度の点で問題がある。そこで
、本発明者らは、生体内にほとんど存在しない胆汁酸の
ウルソデオキシコール酸を選び、特異性の高いその抗体
の製造を試みた。

本発明は、ウルソデオキシコール酸とウシ血清アルブミ
ンの結合物で人以外の哺乳動物を免疫し、抗血清を採取
することにより抗ウルソデオキシコール酸抗体を製造す
る方法である。

ウルソデオキコール酸とウシ血清アルブミンの結合物は
、例えば、トリーｎ−ブチルアミンおよびイソブチルク
ロロホルメートの存在下、両者を混合する事により得ら
れる。

免疫動物としては、ウサギ、モルモツト、山羊など人以
外の哺乳動物が用いられる。

免疫する際には、フロインド完全アジバントを抗原と混
合したもので免疫する事、および免疫は１回だけでなく
、数回追加免疫する事が抗体価の高い抗血清を得る上で
好ましい。本発明で得られた抗ウルソデオキシコール酸
抗体は特異性が高く、ウルソデオキシコール酸、および
これが生体内で変換される可能性のあるグリコウルソデ
オキシコール酸タウロウルソデオキシコール酸とは１０
０％反応するが、生体内に存在する異種胆汁酸とはほと
んど反応しない。

この特異性は、グリココール酸、ケノデオキシコール酸
に対する抗血清の特異性とは比較にならない程高いもの
である。この事は生体が７α−ＯＨと７β−ＯＨを区別
して認識している事を示している。したがつて、ウルソ
デオキシコール酸を負荷し、一・定時間後の血中濃度を
、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法などの免疫学的検出方法を採
用し、本発明の抗ウルソデオキシコール酸抗体を試薬と
して用いて測定すれば、肝機能の診断をより正確に行な
う事ができる。また、本発明の抗ウルソデオキシコール
酸抗体からなる試薬は、上記の肝機能診断以外にも、種
々のサンプル中のウルソデオキシコール酸を免疫学的検
出方法を用いて検出する場合にも用いる事ができる。次
に実施例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。

実施例 １ ウルソデオキシコール酸（３９２Ｔ１１ｆ）のジオキサ
ン溶液２０ｄを４℃に冷やし、この溶液にトリ一ｎ−ブ
チルアミン２０３ｍｇおよびイソブチルクロロホルメー
ト１８０ηを加えて３０分間撹拌した。

この反応液にウシ血清アルブミン１．４９を溶かしたジ
オキサン−水（１：１）の混合液（６０ｄ）を滴下、つ
いで１Ｎ一水酸化ナトリウム溶液２Ｔ！１ｔを加えて撹
拌、さらに１時間後上記水酸化ナ[■■た。減圧下にジ
オキサンを留去後、水１００ｄを加え、得られた懸濁液
をセルロースチユーブを用いて２昼夜流水中で透析を行
なつた。透析後、熱２２０ｍ１，をそのまま真空凍結乾
燥し、ウルソデオ ニキシコール酸とウシ血清アルブミ
ンの結合物を白色粉末として１．１ｆ！得た。得られた
結合物をリン酸緩衝液に溶解して０．８Ｗｉ／ｄとし、
これにフロインド完全アジバントを等量混合した。

この液を０．２ｍ１ずつウサギの背中、４手、足の各２
ケ所、計６ケ所に注射して免疫した。さらに２週間毎に
同様の方法で追加免疫した。免疫開始後４ケ月目に採血
して抗血清を分離し、抗ウルソデオキシコール酸抗体を
得た。得られた抗体の特異性は極めて高く、ウルソデオ
キシコール酸、グリコウルソデオキシコール酸タウロウ
ルソデオキシコール酸とは１００％反応するが、リトコ
ール酸とは０．２％、グリコケノデオキシコール酸、タ
ウロケンデオキシコール酸およびケノデオキシコール酸
とは０．１％以下の極めてわずかな交叉反応しか認めら
れなかつた。

また、その他の生体内に存在する胆汁酸とは、４μ９に
至るまで全く反応しなかつた。本発明の抗ウルソデオキ
シコール酸抗体を試薬として用いてＲＩＡを行なつた。

アツセイ系は、被検血清、標識抗原〔１１，１２−３田
一ウルソデオキシコール酸、抗ウルソデオキシコール酸
抗体（１６０倍希釈）、胆汁酸を含まない血清各０．１
Ｔ１１１と０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７．４）０．
６ｄからなり、４２℃、６０分間インキユベーシヨンし
た後、遊離型と結合型はポリエチレングリコール法で分
離し、上清（遊離型）を液体シンチレーシヨンカウンタ
一にて測定し、遊離型％を求めさらに結合型％を算出し
た。図１に示すように、ウルソデオキシコール酸１０〜
２００ピコモルで極めて良好な標準曲線が得られた。本
方法により、血中のウルソデオキシコール酸の濃度を測
定した。ウルソデオキシコール酸２５Ｗ９を経口投与し
て３０分後の血中ウルソデオキシコール酸濃度の上昇は
、正常人で約２００〜１，４００Ｐモル／Ｍｌｌ慢性肝
炎患者で約８００〜４，６００Ｐモル／Ｍｌｌ肝硬変患
者で約１，７００〜４，６００Ｐモル／ｄであつた。し
たがつて肝機能の診断にこの方法を用いる事ができる。

【図面の簡単な説明】

図１はＲＩＡ法における、ウルソデオキシコール酸と〔
１１，１２−３Ｈ〕−ウルソデオキシコール酸結合型％
との標準曲線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ウルソデオキシコール酸とウシ血清アルブミンの結
   合物で人以外の哺乳動物を免疫し、抗血清を採取する事
   を特徴とする抗ウルソデオキシコール酸抗体の製造方法
   。 ２ 哺乳動物がウサギである特許請求の範囲第１項記載
   の抗ウルソデオキシコール酸抗体の製造方法。 ３ 抗ウルソデオキシコール酸抗体からなるウルソデオ
   キシコール酸の検出用試薬。