JPS5948096A - 細胞集合体培養培地、特に顆粒球−マクロフア−ジ系列から抗−ｍｄｐ抗体を用いる抗原−抗体反応によつてリンパ球活性化因子を分離する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 の中のリンパ球活性化因子を、顆粒球−マクロファージ
系列の細胞集合体から，抗−Ｍ　ｌ）　ｐ抗体を利用す
る抗原−抗体反応によって分離する方法に関するもので
ある。

内毒素およびその他の多数の卸１菌生成物の投与が，白
血球によるリンパ球活性化ないし刺激因子、特に、７“
リンパ球活性化因子（　Ｌ　、４　Ｆ因子）の生産を誘
起し得ることは知ら第１，ている。

白血球から得らノしたパイロジエン−エンドジエン（ｐ
ｂ“）は、（のような活性をもつ因子の中に含剪れる。

これらの因子は、生体内において内毒素およびその他の
細菌性生産物の膜力によってひきおこされる体温上列に
大きく関与していると考えられている。

Ｎ−アセチルームラミルーム−アラニル−Ｄ−イソグル
タミン，又はＭ　ｌ）　／’　（ムラｉルジベプチド）
Ｖｉ．フロインドの完全アジュバント（ＦＣＡ）におい
て、全マイコバクテリヤニ代）得る，細菌性ペプチドグ
ルカンの最小構造テあることが確認されている。合成に
よって得られるこのアジュバントも，循環−白血球パイ
ロジエンを遊離することにより、又は体温調節中枢に直
接作用することによって，家兎に過温症をおこすことが
わかった。ＭＤｐの最小発熱量（　ｍｉｎｉｍｕｍ　ｐ
ｙｒｏｌｅｎｉｃ　ｄｏｒｅ）は、静脈注射の場合は３
０μｉ／に９で、脳血管内に注射した場合は０、　Ｉナ
ノグ２ムＣ　ｎｇ）即ち約２０ピコモルであるというこ
とは注目すべきである。この量は。

パイロジエン−エンドジエンが理論的に活性である場合
のそれに近い。

ＬｉＦタイプの活性をもつ因子，および特に発熱性−内
因性性質をもつような因子は，ｉｎ　ｖｉｔｒ。

でも生成されるかも知れない。特に、上述の細胞集合体
，特に、単球およびリンパ球系列に属している細胞集合
体は、免疫刺激剤を含む培養培地で培養された時，これ
らの因子又はサイトカイン（　ｃｙｔｏｋｉｎｅ）　（
例えばリンホカイン又ｔまモノ力イン）を遊離すること
ができる。培養培地に遊離されたこれら因子を，その培
養培地．から分離することができる。

パイロジエン−エンドジエン＊　’Ｋ　Ｋ　インターロ
イキンｌ（／Ｌ−１）の名でも知られているところのパ
イロジエン−エンドジエンも，これら因子の中に含オれ
る。

多数の免疫−刺激剤が上記インターロイキン１のｉｎ　
ｖｉｔｒｏ　　生産を誘起するために用いられる。例え
ば、ウィールスー細菌一閑類（ｆｕｎｇｉ）−又は寄生
虫−由来の天然生産物であるレクチン。

特に、細胞壁に由来する例えば細菌性リボポリサンカラ
イド型（　／，　ｌ）　Ｓ　）生産物のような化合物が
挙けられる。

完全微生物も用いられる。ＩＬ−１は、７Ｊｌｌ熱死滅
させたブドウ状球菌を用いて１時間刺激した末梢血液の
ヒト単核細胞培養基に生起Ｌ，うる。

粘着性細胞を、あらかじめ洗ってから．２４１Ｎｊ間イ
ンキユペートする。ぞ′ｉ１．によって白血球パイロジ
エンー以後は略語”ＰＬ’によってあられす−を含む培
養上澄液が得られる（２５，０００Ｇで遠心分離後）。

この液はその後４℃で貯えられる。

Ｍ　ｌ）　Ｐおよび多数のＡｆ　Ｄ　Ｐ同族体を用いて
。

上記のＩＬ−ｌのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　　生産を誘起する
ことができることもわかった。こうして刺激された培養
培地から分離することのできるり、４Ｆフラクシヨンも
発熱活性（ｐｙｒｏｇｔｎｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を
もっている。しかしながら好ましいＭＤＰ同族体群、特
にＮ−アセチル−ムラばルーム−アラニル−１）　−ク
ルクミンのα−エステル誘導体を用いる時、上記培養細
胞に、ＬイＦの特異的免疫刺激活性をもち、内因性発熱
性（ｅｎｔｉｏｇｇ’ｎｏｕ♂−ｐｙｒｏｇｅｎｉｃｉ
ｔｙ＞をひきおこすことが可能である。

そのようなＭＤＰＮ族体は、ヨーロッパ特許出原自／１
６７９４００３５７にＨ己載のＮ−アセナル−ムラミル
−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミンのα−エステルでめる
。Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−−ｒう＝　ルー１）　
−ｆ　／’タミンのα−ブチルエステルの使用が最も好
捷しい。そのような生産が行われ得る都合の良い条件は
フランス％πｒ出願、ｖｇ、８２００２４　ｌに記載さ
れている。

抗原−抗体反ＬＬ４、を用いる分離方法、そしでｆＩｌ
ｉ製法でづえ、既に報告を１１でいる。例えば、あらか
じめ刺激さＪ＋、パイロジエン活性を与えらね、たヒト
白血球の培養基からイ（４ら才また上層液で家兎を免疫
することにより、抗−パイロジエン−免疫グロブリンフ
ラク／ヨンをイ４する方法が既に幸に告をれている。（
１）ＩＮＡＲＥＬＬＯ，Ｃ’、　　、４．　。

ＲＦＪＦＥＲ、Ｌ、　ａｎｄｌ１７０ＬＦＦ　、　Ｓ　
、Ａ１．　、　Ｊ　、Ｃ１ｉ　ｎ　、　Ｉｎｖｅｓｔ、
。

ｖｏｌ、　、６０１９７７、／’、４６５−４７２）。

同様に、あらかじめ臭化シアンで活性化した、５ＥＰ１
１，４ＲＯ５Ｅ４１３の名で知られる免疫吸収剤にこれ
ら抗体を固定し、それでアフィニティークロマトグラフ
ィーカラムを作るというこれら抗体の利用の仕方も、　
　、４１ＶＦＩＮＳＥＮ　　等により”Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、ｌ’　ｖ
ｏｔ、　−７１／’、３１３９−３１４２＋に記載され
ている。これらの抗体は・以後”ヒト抗−ＰＬ″と８ピ
す。。

５ＥＰＩＩイＲＯ５Ｅ　４Ｂ　Ｋ固定されたこれら抗体
は。

これまで、Ｐ−又は、よシ一般的に、あらゆる起源に由
来するパイロジエン−エンドジエンＣＰＥ＞を精製する
既知の方法にも用いられてきた。この方法は、あらかじ
め濃縮した（例えば既に指示された条件下で）上澄液と
、臭化シアンで活性化゛きれ且っ抗−ＰＬ−ヒト家兎抗
体を担持している５ＥＰＨＩＲＯ５Ｅ　４Ｅの免疫吸収
カラムと接触させ、ＰＬを浴出し、該溶出物を５ＥＰＡ
Ｉ）ＥＸ　Ｇ５０の名称で市販されている分子篩のカラ
ムによるクロマトグラフィーに何し。

そし゛Ｃ７，５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を
含むポリアクリルアミドゲル上に単一の帯を作υ、パイ
ロジエン活性およびり、４Ｆ活性をもっている＋５００
０のオーダーの分子量をもつフラクションを１１又集す
ることからなる。

こうして得られたｌ）　Ｌフラクションは、白血球−パ
イロジエンも濃縮されているが、その他の、従来の方法
ではほとんど分離できないような因子、特にリンホカイ
ン、モノ力インお裏ひインターフェロンもかなりの晴を
含む。

本発明の目的は、これらの困難性を少くとも著しい程度
に克服すること、特に以後は°”ＬＡＰ’因子”として
ＨｅすところのＬ　、４１ｉ’−型活性ケもった因子、
又はＰＬ又はより一般的には、ＬｉＦ性ηを与えられて
いるパイロジエン−エンドジエンフラクション（以後は
略語”ＰＥ”であられす）の上記培地からの選択的分離
法、および棚台によっては精製法を提供することにある
。

パイロジエン−エンドジエンを実％ｆ　的Ｖ？ｌ　含マ
ない媒質を作るために、　’　（−ｉｔを含むあらゆる
媒質から／Ｊ　Ｅを除去する方法を提供することも本発
明の目的でめる。ＰＥをｅｊとんど含捷ない他の活性成
分をこうして上記媒質からイｓすることができる。

本発明ｔ１．Ｌａｐ−型性週をもつ因子、その中でもパ
イロジエン−エンドジエン因子が特殊な抗−ＭＤＰ抗体
によって選択的に識別できる。

という知見に基づいてなさｉＬだものである。

ＬＩＦ型活性をもつ因子、肋Ｋ　Ｐ　Ｅの分離又は精製
のための１本発明によるそれらを溶解状態で含む生物学
的液体媒質から出発する方法は。

この媒質を抗−ＭＤｐ抗体と接触させＰＥ因子および抗
−Ｍ　ｌ）　Ｐ抗体の複合体を作る過程と、そのＰＥ因
子を上記複合体から回収する過程とを含む。

本発明によって精製過程に用い得る抗−ＭＤＰ抗体は、
既知の方法で得られ、なかでも例えば家兎のような動物
を、めらがしめキャリヤー分子１例えばうし血清アルプ
ｉン、ポリリシン又は得られ′ｆｃ複合体に必要な免疫
性を付与できる程十分大きい分子量をもつその他の分子
に同定したＭＤｐ又１ｄ　Ｍ　ｌ）　ｐ　誘導体で免疫
することによって得られる◇抗−ＭＤＰ抗体生産のため
の一般的条件ＦｉＭｏｔｅｃ、　Ｉｍｍｕｎ、　１７．
３５７−３６３（１９８０）に発表濱れたＲＥＩＣＩＩ
ＥＲＴ　Ｃ，Ｍ、等の論文を参照されたい。Ｍｏ１ｅｃ
、　Ｉｍｍｕｎ、　１９４５．７３７−７４５（１９８
２）に発表されたＢＩＩＩＲＧ、　Ｍ、等の論文も参照
でき。

る。

得られた抗血清に含まれる抗体は１例え−ＤＰ又はＡ４
　Ｉ）　ｐ誘導体を固定した樹脂性相体分子のカラムで
アフィニティークロマ１グラフイーを行うことによって
１′１／製さｔする。有ｆ１１なのりよ、矛）らかしめ
臭化シアンで支持物ＴＪｆＡ蓑・活ｔ／１：化し、その
不溶性支持物質（５ＥＰＩＪイＩ？０５ＩＩ’　４Ｂの
名で市販される）にＭ　ｌ）　Ｐリシン（Ｎ−アセチル
−人うミルーＬ−アラニル−１）　−イソグルタミニル
ーム−リシン）を同定させ升もので作ったカラムを用い
るととである。

そのような物質に１古１定された抗−Ａｆ　Ｉ）　／ｌ
抗体（ポリクローナル抗−ＭＤＰ抗体）Ｉｄｌ、峰の後
、例えば媒質を酸性に（ｌ持にｐＨ４以下に）すること
によシ、又は高度に水溶性のイオン性塩１例えばチオシ
アン酸すＦリウノ、で培地のイオン酔慧度を＾めること
によって溶出できる。

しかしながら１本発明の小観な好ましい特徴によれば、
特に単離されｆｒ　Ｎ−アセチル−ムラビン酸も、単離
格れたＬ−アラニル−Ｊ）　−イソｆルタｉンも除外し
て、Ｎ−アセチルーム−ｙｉ／？　−Ｌ　−７５ニル−
ＪＪ−イソグルタビン構ス吉を全体として特異的に識別
するところの１選択的抗−ＭＤｐ抗体が用いられる。

後者の選択的抗−ＭＤＰ抗体、又は一層好ましいところ
のモノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体よりずっ
と完全な精製を可能にするだろう。なぜならば、後者は
、当該生物学的媒質の他の構成成分１例えばこれらの媒
質中に存在する多数の他のグリコペプチド構造を同定す
ることができるからでめる。それにもかかわらず、ポリ
クローナル抗−ＭＤｐ抗体は、ＰＥ因子の最初の濃縮の
ために好都合に用いられる。

そしてもし必斐なら、その後にモノクローナル゛選択的
”抗体によシ、より徹底的な精製が行われる。そのよう
なモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作シ
出す方法およびそのハイブリドーマ（ｈｙｈｒｉｄｔｒ
ｍａｚ）をハイプリドーマ培養培地から回収する方法、
並ひにそれらを用いる場合の条件を、以下に専ら爽施例
をもって。

示す積シでるる。

そこで１本発明による方法は、ｉｉｐ因子特にｐＥ因子
と、抗−Ｍ　Ｄ　Ｐ抗体、よシ好ましくは”選択的”抗
体との間の複合体の生成、およびこれら複合体をＭ、離
させた後、それらからのＬＩＦ因子および場合によって
はＰＥ、自身の回収から成る。

水相に不溶の支持体に担持さＪｌ−た選択的抗−ＭＤｐ
抗体を用いるのがｔＴ都合である。抗−Ａｌ　１．）Ｐ
抗体が、単離されたり、４Ｆ抗体と複合体を形成する能
力を失うことなく同定きれるところの支持物質（粉末状
が好捷しい）が用いら第１る。

５ＥｐＨ＃？Ｏ５Ｅ　４Ｂの名称で市販されている支持
物ａをあらかじめ臭化シアンで活性化した後。

この支持物特に固定させた選択的抗−Ａｆ　Ｄ　Ｊ’抗
体を用いるのが一層好ましい。勿論、ガラスピーズ、ア
ガロースおよびＳＥｌ〕１１／ＩＩ）ＥＸ　　のような
他の支持物質も考えられ、ｊ４択的抗−７７１）　／’
　Ｊ’ｊ＋、’体の同定の試験を行ない、置市さｉした
抗−Ａｌｔ）ｌ）抗体のＰＥ又はり、４Ｆとの横合体形
成活性が維持されるかどうかを評価分析することに専問
家にとって当然理解されるところであろう。

ＰＥ因子および抗ＭＤＰ選択的抗体との間に形成された
複合体からｐＥ内因子回収する操作は、既知の方法で例
えば媒質を酸性に、特にｐＨ４以下に、することにより
又は溶解性の商いイオン性塩１例えばチオシアン酸ナト
リウム、塩化ナトリウム又はチオシアン酸アンモニウム
によって媒質のイオン濃度を高めることによシ行われる
。これらの方法は、抗−ＭＤＰ抗体があらかじめ適当な
不治性支持物質に固定されている場合は、特に好都合で
ある。好ましいのは。

ポリクローナル抗−ＭＤＰ抗体溶液から慴られ。

ろらかじめ５ＥＰＩＩ４ＲＯ５Ｅ　ＡＢ−Ｍｌ）Ｐ−リ
シン−カラム上のアフィニティークロマトグラフィーに
よシ、そしてその後に特に上述の条件下でカラムから溶
出することにより精製し１ζ抗−ＭＤｐ抗体を用いるこ
とである。抗−ＭＤＰ抗体は。

一般的抗体固定法１例えば雑誌ｐｈａｒｍａｃｉαに掲
載きれた“アフィニティークロマトグラフィー；原理お
よび方法”に記されている方法によって。

不活性支持物質に固定される。

本発明の方法によってＬＩＦ因子を抽出しようとしてい
る上記Ｌ　、４　Ｆ因子を含む媒５ｑは、上に明確にし
たように免疫刺激が行わ才１−た用台にＬＩＦ、ＩＬ−
１又はＰＥを生産することのできる細胞、系列の細胞培
養基の上澄液によってｔＭ成される。ぞれは、特に末梢
血液、肺、腹膜および骨髄から得ることのできる即球、
マクロファージに主として関係している。

いづれの由来の細胞でも使われる；特に−次培養又は連
続系列の、と）−、マウス−、ラント−、モルモット−
、ザル−１家兎−又は大細胞。

活性化する細胞も、これらの卸１胞から選けＪ）。

１ナンクロン　ＮＵＩＶ（、’ＬＯＮ　”父は°゛フア
ルコンＦ、４ＬＯＮの商標で市販されている培養ＩＭに
粘着しない要素をあらかじめ分離したぞ）１らｒＹ’ｉ
１１取を・用いた。活性化する卸１胞の由来についてＶ
↓、ここ−て÷も６７°ｈｅ　Ｊｏｕｒｎ、ａｌ　ｏｆ
　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ａｆｅｄｉｃｉｎｅ”、
す６１９７２．７）、＋４３−１５５に発表きＪｌ−た
／、　Ｃ；ＥＲＹオヨヒＢ、　Ｉｉ、ｔｒｙｕＳｕＡＮ
ノー　ミ）　ケン（有糸分９）促進物質）に対する７　
＋　＋）ンパ球反応の強化”と題する論文、およびＥ、
　ＰＩＣＫおよびＭ、１．ＡＮＤＹの６リンホカインレ
ポート１　″と題する本（／Ｉｃａｃｔｅ−ｍｉｅ　ｐ
ｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、　）を参照することができる。

本発明による方法が適用できる上％５’、　Ｌ　Ｉ　Ｆ
および場合によってはｐＥを含む媒′ＪＩ４は、上ｈ［
″、上澄液の濃縮フラクション、例えば、無機塩および
例えば約１２　、０００以下の分子量をもつよりな“小
分子”の成分をとυ除くために上記上澄液を透析にかけ
て得られたものによっても構成されるかも知れない。

本発明は、抗−Ｍ　Ｉ）　Ｐ選択的抗体によるＬＩＦ。

ＰＥ因子又は同様な因子の認識能力を測定する方法を記
すことによって、更により良く説明されるだろう。

１、　モノクローナル抗体の生産 α）マウス免疫 ２群の生後２ケ月の雌Ｂ　、（Ｌ　Ｂ／Ｃマウスを。

めらかじめうし血清アルブミンに固躍したＭＤＰＣＭＤ
Ｐ−ＢＳＡ）で免疫した。第１群にはフロイント完全ア
ジュバント（ＦＣΔ）で乳化させたＭＩＪＰ−ＢＳＬ　
ｌ００ｔｔｌ／を２回皮Ｆ注射した。２回の注射は３週
間の間隔をあけて行わｔｌ＊ｏ第２群第２同ｉｊ同を腹
腔内に行い、Ｐｈ３緩則液中のＭＤｐ−ＢＳ、４１００
μｇを膜力した。

最後の免疫から９週間後に、マウスに２回１日おきに、
生理食塩水媒η中ＭＤＰ　−Ｂ　Ｓ　、４１００μＩの
溶液を補充した。今回は腹腔内投与であった。最後の増
強から３日後、マウスを殺り、、１Ｍ’−臓細胞全細胞
し、これらの胛ＪＩ＃細胞と・脊髄肺細胞系列１例えば
骨髄腫ＮＳＯ／Ｉとの細胞融合を行った。動物に腹水症
を誘起する細胞ハイブリッドを牌騰細胞との融合によっ
て形成できる骨髄腫細胞ならは、その他の入手し得るい
つｉｌの骨髄ｌ腫細胞でも使用できることけ消熱である
。

その際、上ハ１２腹水症は”融合に関係する肝臓ｆｆ１
１胞によって最初に生産きれた抗体”の特ρをもつ抗体
のもととして用いられイＮる６ ４１％ポリエチレングリコール溶液１５００の存在下で
、各マウス群の１億ケの牌臓細胞を１０７Ｎ　Ｓ　Ｏ／
　＋細胞と融合させるやセ方は／、　ｉｍｍｕｎｏｔ＋
１２４、７７５．１９８０にＺ、　ＥＳＨＨイＩ７等が
記載した方法によって行われる。融合後、細胞を９６ｗ
ｅｌｌをもつ３〜４ケのミクロプレートに分配し、タル
ベンコ（ＤＵＬＢＥＣＣＯ）が改良したイーグル（ＥＩ
ＧＬＥＳ　）　培地（ヒボキサンチン、アεノプテリン
およびチミジンを含むＩｆ　Ａ　Ｔ培地の特徴的構成成
分（ＨＡＴ−ＤＭＥＩｄ）および多量のグルコースを含
み、上Ｋｅ培地は１５％までの馬血清、５０単位／　ｍ
ｅのペニシリンおよびストレプトマイシン、１ｍｕ蕉性
ブドウ酸ナトリウムおよび２ｎＭグルタミンを更に加え
て完成される）において選択される。

２週間の培養後、細胞ハイブリッドをＩＩ　Ｔ−ＤＭＥ
Ｍ培地に移しまた。増殖した卸１胞１をそれからＤＭＥ
Ｍおよび馬血清のみを基にした培地で実験室的に培養す
ることができた。

選別 融合操作後１０日から１５日に、抗−Ｍ　ｌ）　Ｐ抗体
を生産できるハイブリッドの選別を、ポリ−（塩化ビニ
ール）のミクロプレート上でｒＭ　ＩＡ−相の”ラジオ
イｉユノ了ツセー”とＩＩｙハれる方法にかけることに
よって行っに０このミクロプレートのｗｓｌ、ｌ−け、
あらかじめＭ　Ｄ　Ｐ−イー−−／。

浴液でコーティングしである。即ち、　ｍｕｌｔｉ−（
ポリ−Ｄ　−７，−アシエル）−（ポリーＬ−リジン）
であるＡ−Ｌに固定もしくけそ第１と結合しｆｃ　Ｍ　
Ｉ）　Ｐでコーティングしである（１ケのＨ）ｅｌｌに
　２　５ｐ９／　ｍｅＭ　　ｌ）　　Ｐ　　−，４−−
Ｌ　ｆｆ’４Ｗ　　ｌｏｏ　　μｌ　）　　ｏ　　８温
で１ｌ１４１インキュベーション後、ミクロプレートを
Ｐ　Ｉ）　Ｓ緩衝液中１％馬血清溶液ＣＰＢ、Ｓ−７ｌ
Ｓ）で３回洗った。そ！１−からハイプリドーマ培」ｉ
基の上ｆｆｆ液５０　ｔｄ　ｆ　％　ｗ　ｃ／　ｌにυ
ｎ　Ａ、、　、　　２１Ｒ間室温でインキュベートシタ
。／）　Ｂ　、５−　ｉｌ　Ｓテ３回洗った後、ヨード
＋２５（”５／　）て住職化（、ｆ４山羊Ｉｆ抗−マウ
ス抗体５０μｔｃ　Ｉ分間に１０５カウント、ｌＯＣｐ
ｍ）全加え〃。ｌ　ｌ兎４℃でインキュベートした。４
回洗い、乾燥し、ｗｅｌｌを切り抜イｆ？：後、ガ＞−
ｑ線計数管（Ｇａｍｍａ、　ｒａｄｉａｔｉｏｎｃｏｕ
ｎｔｔｒｒ　）で、放射能レベルを測定した。

次表は上ｄ（シの２融合試験の”融合効率″をまとめた
ものである。

抗−ＭＤｐ抗体を含まない上澄液で行ったテストにおけ
るバンクグラウンド−ノイズ５ｏｏｃｐｍを考慮して、
５０００〜１５０００　ｃｐｍが検出されたところのハ
イプリドーマをポジティブ反応を示したと考えた。

第二の選別は、ＩＷＪ様の条件下でそれぞれＭＤｐ　−
イー　Ｌ、　　Ｍ−４−−ＬおよびＤＰ−，４−−Ｌ、
即ち、４−−ＬとＭＤｐの基礎的構成成分でるるムラミ
ン酸（Ｍ）およびＬ−アラニル−Ｄ−イングルタミン（
ＤＰ）そｉｌそれとの鉋合イ木でコーティングしたＩ！
ＩＩ　ｅ　ｉｌヲもつεクログレートにおりる第二の試
験系列によって７Ｊわｉｌ斤。Ａｆ　ｌ）　１）−４−
−Ｌに関して目Ｉヨんの少［７の活性をもつか又（」−
全熱活性をもたないところのモノクローナル抗体を選別
し７ｆ。

より多量の抗体を生産するｆｖ、　？ｚ）に１選別し斤
ハイブリドーマを１３／４”／　Ｃ”　　　／　２）　
Ｊ”　ｌ　−＝ｒ　ウｘＤ１ノ、４ で、１０　　ハイブリッド細胞の割合で腹腔内に注射−
念０分泌された抗体け、こ第１らマウスにおいてこノ′
［らハイブリドーマによって誘起４　ｔｌ、　７（液性
腹水腫瘍（ｆ］ｕｉｄ　ａｓｃｉｔｉｃ　ｔｕ、ｍｏｒ
ｓ）から、　［：Ｖ：知σ］方法で回１［ｖをれた。

キャリヤー分子、即ち／３　Ｓ、４を特異的に開織する
ことのできるモノクロ−プル抗体も、土ｄ［１，の粂件
の下で選んだ。これらのモノクローナル抗体全対照とし
て用いた。

よ、り多くの抗体を生産する改めに、Ｓ別しｆｌハイブ
リドーマをＩ　ＯＸ　Ｉ　０６ハイブリソド細胞の割合
で、　Ｂ　、４　Ｌ　Ｂ／Ｃ”ｘ　Ｉ）Ｂ　Ａｌ１　）
Ｉ’　＋マウスに腹腔内注射した。分泌きれた抗体を既
知の方法で。

特に、ゲル特に５ＥＰＩｌｌＣＲＹＬ　２００　　ゲル
上の腹水を分別し、（分子量約１６０　、０００に相当
する領域において）　Ａ（Ｄ　Ｐ抗原と交叉反応するイ
ミュノグロプリンを含有するバンドを回収することによ
υ、これらマウスにおいてこれらハイブリドーマによっ
て誘起された液性腹水腫瘍から回収した。

２　抗−ＭＤＰ抗体のｐＥ因子との結合能力の認識試験 抗−ＭＤＰモノクローナル抗体の選択的にＰＥと結合す
る能力を明らかにするためｙｔｃＪ＜０５ＥＮＶ／、４
ＳＳＥＲ。

Ｌ　、　、　ＤＷＡＲＥＬＬＯ、Ｃ、、（、が”　Ｃｔ
ｌｔ、　Ｉｍｍｗｎｏｔ、　”６３巻Ｐ　１３４−１４
２に記載した条件下で、これら抗−ＭＤＰ抗体が、　　
＋ｐｇ１ｍｌ量のｐｌｉＡ（植物性血球凝集素）の存在
において、ＰＥによって刺激された生後６週間のＣ３Ｖ
Ｂ＋７６マウス（Ｄａ腺細胞がとシ込むチミジン３１１
（比放射能Ｉ　Ｃ１７ｆｎＡＩｏｔ）の増加を阻止する
能力を研究した。トリチウム化した（　ｔｒｉｔｉａｔ
ｅｄ　）チεジン導入の測定値増加に基づくり、４Ｆ活
性の検出を目的とするテストは、非常に敏感で、家兎ｉ
、ｎｖｉｖｏにおける抗−Ｍ　Ｄ　Ｉ）抗体によるパイ
ロジエン活性５［１害ヲ確実にするために必要である樺
よりもずっと少い尾のＰＥで足りる。

Ｌ、４Ｆ活性１（Ｈ害試験で、上ｆｔｉシの和製ＰＬフ
ラクションのＩ　／　１００　Ｋ稀釈したものを３７℃
で１時間予め培参し、その後１２時間４℃で異る抗体と
共に培養した。すなわち、 α）マウスで得られた種々の抗−Ｍ　Ｉ）　／）モノク
ローナル抗体の１／２０稀釈；又は ６）家兎抗−ＰＬ免疫グロブリンフラクション又は正常
家兎免疫グロブリンフラクンヨンの１／２００稀釈のい
ずれかである。

混合物を１次いでｐ　１１イの存在下で胸腺卸ｊ胞培養
基に加えた。

１表の結果かられかるように、チミジン３ツノの導入に
ょシ、ＰＥＡ添加のみの当金にわず力・に増加する。Ｐ
ＪＪＡの他に抗ｋｌ　Ｄ　Ｐ−モノクローナル抗体を添
加してもこの効果は俊らなかつた。ＰＬおよびｐＨＡの
存在下では、増殖反応の増加（Ｐ＜０．０１）が認めら
れた。これら２物負の混合物にモノクローナル抗体を加
えると、この観察さｔした増加が８０チまで阻止きれた
。

以下のシリーズの試験においては、精製したＰＬ調剤の
Ｌ　、４　Ｆ活性に与える抗−ＭＤｐモノクローナル抗
体の効果を、次の他の抗体の効果と比較した：抗−ＢＳ
Ｉモノクローナル抗体、Ｆｔ−Ｐ　Ｌ家兎免疫グロブリ
ンおよび正常家兎免疫グロブリン。

以下に示す結果かられかるように、対照抗血清のいづれ
もｐＨイ＋ＰＬが関係してひきおこすところのチミジン
　Ｂの導入を顕著に変えることはできなかった。一方、
Ｉ／２００の稀釈で用いた特異的抗−ＰＬ家兎抗血清は
、４８％〜３８チの阻止をおこした。すべての試験で、
特異的抗−ＭＤＰマウスモノクローナル抗体Ｖま、精製
ＰＥ幽剤のＬ／ＩＦ活性な非常に有意に阻害した（５３
，３４，５９．２８％）０ 抗−ＭＤｐモノクローナル抗体によシひきおこされるｌ
５１１害が、抗−Ｍ　ｌ）　／）活性と特異的に結合し
ていることをチェックするために、胸腺細胞をｐ　１１
　Ａによって刺激する前に、ＰＬを異る抗血清と共にイ
ンキュベー／ヨンする際にＩ　Ｏ０４／ｍ／のＭｌ）ｐ
を加えた。この試験では、３回繰返し斤が　＃　、／Ｊ
　／’の添加は、特異的抗−ＰＬ家兎面渭により誘起さ
れるＬＡＦ＠性ｌＫ＋−＝１止を変化させなかった。同
様にし′て、他の二つの対照抗血清。

すなわち、正常家兎免疫グロブリンおよび抗−Ｂ　Ｓイ
モツクローナル免疫グロブリンにおいて観察をれた反応
も変化を受けなかった。これに対して抗−Ａｔ　Ｊ）　
Ｐモノクローナル抗体によってひきおこをれる阻害は、
有意に沖少しｋ（４１〜１００％）（／’＜０．０１）
。

平均結果る以下の表に壕とめる： 対　　照　　　　　　　　　　　　　　　３１７１３８
Ｐｌｉ　Ｉ　（Ｉｔｔｌ！／ｒｎｅ　）　　　　　　６
　ｌ　５±　４９１３１１．４＋抗−ＭｉＪＰ＜　１７
２０）　　５６９±　５７／Ｊ／／イ＋ＰＬ　　　　　
　　　、）０７’？±２３゛７ｐｌｆｌ＋ＰＬ＋抗−Ｍ
Ｄｐ　　　　　９２１±　３３この選択的複合体形成反
応は、ＰＬ因子を。

それと共に他のペプチド、グリコペプチドおよび特にペ
プチドグリカン−フラグメントを含む媒質から分離する
ために利用することができる。

この点から後者が抗−ＭＤｐ抗体と免役反応をおこキナ
いことは注目すべきことである。

ＰＬ因子−抗ＭＤｐ抗体−複合体に倉まれるＰＬ因子は
、この複合体のＭｍによって回収さｉる。しかし上述の
ように、この相離は、抗−ＭＤｐ抗体が不溶性キャリヤ
ーと結合しでいる場合によシ一層簡単に行われる。

ＬＡＦ因子および／又ＦｉＰＥのどちらかのよ）多縦を
、適自な顆粒状−マクロファージ系列の却（胞培養基の
上澄液から、臭化シアンで活性化した５ＥＰＪＩ、４Ｒ
Ｏ５Ｅ　４Ｂおよびそれに結合した抗−ＭＤＰモノクロ
ーナル抗体のカラムを用いて分離する方法を以下に記す
。

α）ＬＩＦ因子の免疫−吸収 できれば、あらかじめ濃縮した上澄液を、免疫−吸収−
物質に結合させた抗−ＭＤＰと接触させる。ＬＩＦ因子
の選択的固定ができるように十分接触させた後、免役−
吸１１Ｖ、物′Ｈを洗って。

そこにくっついている非特的的生産物１舌・除去する。

その操作ンまカラ２・で行い、洗浄は洗浄０．をカラム
に通過させることによって行うのが好寸し７い０カラム
の抗体に保持された分子、即ちり、４Ｆ因子および多分
その他のモノ力イン類又は独自の分子量をもち、抗体に
接近ｉＶ］能の形でＡ４１）　ｌ）構造をもっている中
間物’ｆＪｆよ、低ｐＨの緩衝液。

例えばｐＨ３，２のグリシン／　／ＩｃＩを基にした溶
液。

又は高地ａｔＬの溶液１例えばｌ　Ａｆチオシアン酸ナ
トリウムによって溶出さノする。

ｈ）Ｌ　Ｉ　Ｆ因子と同時に他の分子も浴出し、なけれ
ばならない場合は１例えｔ−１“、−Ｆ′１１らの分子
量によって分離することのできる分子篩のクロマトグラ
フィーによってこれら分子全分離゛することが好ましい
。

存在するｕＪ能件のある分子の中に一般的により小さい
分子量をもつ因子がある。そこで＋２０００以下の分子
量をもつ分子を！Ｆ、Ｉ＋別に分離・１−ることが好ま
しい。

従って本発明による方法は、Ｌ４Ｆ活性をもチ、パイロ
ジエン−エンドジエンはないところの１例えば顆粒状−
マクロファージ系列の細胞集団の上澄液から、Ｎ−アセ
チル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミンのエス
テルの存在下で得られる（フランス將許出願腐８２００
２５　＋Ｋｐ、（２載）。モノ力イン類の分離および迅
速和製にも用いることができる。

二つの試験は、抗体が内因性パイロジエンと結合し、従
ってその活性ヲ［ｊｉ止することに糺明するために行っ
た。マクロファージ上澄液（内因性パイロジエンに菖む
）を、あらかじめＮ−アセチルームラミルーＬ−アシエ
ル−Ｄ−グルタミンα−メグールエステル活性をもっＭ
　ｉ）　ｌＩ同族体で刺激した後、抗−Ｍ　Ｄ　Ｐカラ
ムをｊＬ＠遇させた。脳血管系に注射しｆＣ場合、上記
の同族体は発熱をおこさない。しかしながらそれはマク
ロファージを５刺激し、て内因性パイロジエンを生産す
る。

次の試験方法を用いた： 臭化シアンで？性化した５ＥＰＪ１．４ＲＯ５Ｅヒーズ
を、上述のようＦｃ　４１４　’ｂ！＝’　ｔ、　Ｒ二
つの別個のモノクローナル抗−Ａｌ　ｌ）　Ｉ抗体に結
合ｐ−１：ｌ六。モノクローナル抗−ジニ［ロフユノー
ル抗体σ）苅！；ヘカラムもイ乍つｆｒ　ｏ最後に、モ
ノクローナルわ１、−Ａｌｌ）ｌ）抗体のカラムをｆＦ
Ｊ）、ムシブタイド（Ｎ−アセプール−ムラミル−Ｌフ
ァラニル−１）　−り／１．　ｐεンーα−ブチルエス
テル）（２０＋＋ｖ）でブロックしり。カラムをｐＨ２
にＮＢ’４　＠　ｌ−、’ｆｒ　ｏ　ｌ　Ｏｒｐｑｌｌ
、ｓＡを各カラム土に注き刑過悼−１，そｉｌかｃ、　
１”　１７　Ｓで次１１７１０．　＋　Ｍクリシン／ノ
ｉｃｔ　Ｔ　２４：つｆｒｏ−＋第１から上田液の通過
の前に、カラ２・をｐＨ７，２に杓ｒｐ！節　し７　ｌ
ヒ　。

試験■ モノクローナル抗−Ｍ　ｌ）　ｌＩのカラ２．２オを用
いｆｃ６各々のｈ　組１’、Ｊ：　５　ｍｆで、２３．
５ｍＷの１ｇ免疫グロブリン抗Ｍ　ｌ）　ｌ）を含んで
いた。カラ２、の１木はムラブタイド（Ａ１　／Ｊ　）
でフロックした。マクロファージ上澄層２．５　ｍｉ　
ｆ名カラムを」ｒ・ｒ〃ｊさせ、これを３回繰返した。

上澄液を集めて５　ｍｌとし、カラムは先づＩ　Ｏｍｅ
　Ｐ　Ｂ　Ｓで１次に別の２０ｍ１ＰＢＥで、それから
２Ｃ）ｔ／！０．＋＃グ１７　シン／　ＭＣ’ｔで洗っ
た。カラムを通過させた後集めた最初の５−および洗浄
液１ｏ−両方共脳血管径路による発熱について試験した
（３匹づつの家兎に対して）。

結果　カラム ５メ　Ｉ　Ｏｍｅ 抗−Ｍ　Ｄ　Ｐ　　　　　　０．６７ｆ：０．１５０．
００ＭＢでブロックした抗−ＭＤＰ　　１．０７±０．
１５０．００このように、１　抗−ＭＤｐがう五を１通
過させた後の上澄液ではパイロシュン含有量Ｆｉ着干減
少した。

試験■ 次のものを担持する４カラムを調製し′ｆｃ：１、　Ｍ
　Ｂでブロックした抗−ＭＤｐＺ抗−ＤＮｐ １抗−ＭＤｐ ４、抗−ＭＤｐ 各カラムの大きさはｉｏ蛇で、ビーズに結合口ファージ
上澄液５　ｍｌを各カラムを通過させ。

２回循環させ、最終容給２ｏｒｎ／になるように−集め
た。集めた上澄液について元熱能カを試験し゛た（上澄
液１ｍ／！を家兎に静脈注射）。

結果　　　　　　　　　　力　　ラ　　ム　　　　　　
　　　　　Δ　　℃０．６５　　０．０５ ＭＢでプＯツクし斥抗−ＡｆＤＰ　　Ｏ，６５０，０５
抗−ＤＮＰ　　　　　　Ｏ，７０，０５抗−ＭＤＰ　　
　　　　Ｏ，０＋　　０．０１抗−Ａｆ　Ｉ）　ｌ）　
　　　　　０．０＋　　０．０１このように、上澄液の
パイロジエン活性は抗−Ａｆ　Ｄ　Ｐカラムを通過させ
ることによって吸収烙れとシ除かれたが、抗−１）　Ｎ
　Ｐ　Ｘ　ｉ、ｉムラブタイド（ＭＩＪ）でブロックさ
れた抗−Ｍ　Ｄ　Ｉ）でＶＪ吸収されなかった。

こうして１本発明ビよる方法は、ＬＡＦ因子。

特にＰＥ因子の極めて９Ｎ択的分離を可能に［２゜従ツ
ーｒ＋当初は上記＃：η中にパイロジエン−エンドジエ
ンと共に含まれている他の因子の４Ｉｌ）究を促進する
という大きな利点を有する。

特に１本発明は、パイロジエン−エンドジエンを本質的
に伴わない明確なモノ力イン又はリンホカインの生産を
も可能にし、それによって上記モノ力イン又はリンホカ
インのその後の研究がかなシ容易になる。

本発明による方法は、ＰＥ又は同様な生物学的性質をも
ち、目的とする最終抽出産物に混入し得る因子をも含ん
でいる媒質から、活性数分を抽出する過程に応用する時
に特に有利でるる。

例えば、インターフェロンαは、柚々の作用物質−その
中にはムンプスウイールス（ＴＳＵＮＥＯ。

Ｋ、およびＭＩＮＡＧＡＷ、４．Ｔ、、Ｊ、Ｇｇｎ、　
Ｖｉｒｏｌ、。

５４　（１９８１）、Ｐ、２９３〜２９９）又はセンダ
イウイールス（ＭＯＧＥＮＳＥＮ、に、Ｅ、″輸血およ
び免疫血液学＃２３巻、　、％３　（１９８０）　、　
Ｐ　、　３７３〜３９７）がある−によって刺激きれた
ヒト白血球によって生産され得る。インターフェロンの
生産系は、その他のモノ力インおよびリンホカインも生
産される糸に似ている。それは、遠心ヒト血液の紙層を
とり、それを４℃で２４時間保存するか、その代シにｐ
’ＩＣＵＬＬ−ｐｉｉＣ人勾配で末梢ＪｒＩＩ液の単核
球を分離するという段階を含む。

赤血球をとシ除いた白血球を培養培地に懸濁づせ、パラ
きクソウイールス（普通はセンタイウイールス）と共に
２４時間培養する。細１ｉ＋ｌおよび残層を遠心分離し
、それに・よりインターフェロンαを含む上澄液が慴ら
ｔする。後者はその捗・精製し、−縮することができる
。しかしながらこれらインターフェロン製剤の大部分は
、精製後でさえもまた。これら操作中に白血球から遊離
し１ζ多数の中Ｉ）ｉｌ　物ｒ　％ｑおよび蛋白質を含
んでいる。更に、臨床に用いらノ１．るインターフェロ
ン製剤は、ひどい過温症をひきｈ−こずかも知ズ１ない
　（ＳＴＲイＮ１）ｌジＩ？、／／　、、７ｅｘａｓ　
　Ｒｓｐ、Ｂｉｏｌ、Ａｉｐｄ、３５（＋　９７７　）
　、　　／）、４２９　）。これらの後者１、仁ｉｌら
の過温症がｉｎ　ｖｉｉｒｏ　　での同和・な刺酵によ
って生産された白血球パイロジエンがインターフェロン
製剤に混入しているためであるこトラ示１関した。従っ
て、本発明の方法ｅま、ｆ３僚テストのために大きな価
値をもっているインターフェロンを作るために、これら
パイロジエンの除去に用いることができる。パイロジエ
ン−エンドジエンの選択的分離法も、白血球培養液から
分離した上澄液から出発し１．それを抗−ＭＤＰ抗体を
含むカラムを通すことによってパイロジエン活性の失く
なったインターフェロンを生産するために、応用するこ
とができる。

自明のことであり、前述のことから既に明らかなように
５本発明は１以上で考慮した例に限られることは決して
なく１反対ＶＣあらゆる変形（改良）を含む。特に１例
えばＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−１）−グ
ルタミン酸のα−エステルα−アεド誘導体のようなＭ
　Ｊ）　Ｐ同族体で免疫したマウス又は他の動物から得
た肺臓細胞な骨髄腫細胞と融合させて作ったノ１イプリ
ドーマから得たモノクローナル抗体を、これらの抗体が
、上記の抗体のように、ＰＥ、ＰＬ又はＬＩＦ又は同様
な生物学的性質をもつ因子の分離を行うことができる範
囲において使用するという変形を含む。もう一つ自明の
こと目、こうして得られ斤ポリクローナル又Ｙｊモノク
ローナル抗体、そしてそのような分店１１の実行にこｔ
ｌらを使用−Ｊることンまこｔｌまでより訂卸１にＦｊ
Ｌ　Ｌ２てきたことと等価であり、七ノＩによって、上
記１ｆ１１体の使用は１本発明の範囲から逸脱しない筈
である。

一般に、木拍明による方法に用いることのできるモノク
ローナル抗体類は、Ｎ−アセチル−ムラミン酸基に結合
したペプチド鎚の存在、そのペプチド鎚の第一のアミノ
アシル基、即ちＬ−アラニル、Ｌ−セリル、又ｕＬ−バ
リルの中から選は才り、　Ｎ−アセチルムラミン基との
結合を確実にするアミノアノルのイ（在によって！１′
！ＩαＶづけられるＡＩ　Ｄ　Ｐ同族体を選択的に６ｇ
識するモノクローナル抗体によって構成される。ベプナ
ド佃の第二のアεノアシル藝り、：尋鳥゛される中鰯な
抗原決定基の％Ｓ性に１はとんど邪魔にならないで、本
発明の方法において使用するのに適し。

たモノクローナル抗体とみなされる。特に、１〜３した
モノクローナル抗体は、ＭＤｐ誘導体（又はＭＤＪ））
および相応のモノクローナル抗体間の襟合体生成のため
に必要な最小濃度より１００倍も大きい濃度においてさ
え、上記のペプチドクルーズに結合していないＮ−アセ
チルムラミン酸構造を認識しないモノクローナル抗体で
ろる。

逆に言えば、適当なモノクローナル抗体は先づ、モノク
ローナル抗体を生産するハイブリドーマを作るための＃
Ｉ胞融合に、「α−およびγ−カルボキシル官能基が異
なる館換基を担うことのできるＭＤｐ同族体」に対して
あらかじめ免疫した動物から得た肺細胞を用いることに
よっても得られる。％に、先づ、Ｎ−アセチル−ムラｉ
　Ｌ　−ＪＪ、−アシエル−Ｄ−グルタミン酸ジエステ
ル又１ｒｉＮ−アセチル−ムラεルー　Ｌ　−７ラニル
ーＪ）　−クルタｉンα−ニスデルＩｃ　７ｊ　Ｌ、　
”’Ｃ免役した動物から出発して得られたモノクローナ
ル抗体に頼ることもてきる。これｌ−ｔミーロッパ％、
許出涼［’（Ａ　７９４００３５７に記載されている。

ハイプリドーマ生産に通しているいづれのタイプの骨髄
腫でも使用できる。特に、技術的文献、又は公表された
特Ｗ［出願又は特約に記載烙れたものならいづれの骨髄
腫でも１史うことができる。例として田−ロンパ特ｉｆ
［出願別００１／１５２９゜Ａ　００１８７９４．　　
、％　００１８７９５および公開フランス１時訂出ｌｌ
！Ｉ腐７８１７５４５／２３９４６０７　Ｋ記された骨
髄腫がある。

以上に記したすべての出版物および的訂出耽け、ここに
参照文献としで加入する。

非発熱性り、４Ｆを生産しつる細胞系＜ｃ’ｅｔｔ　−
１ｉｎｅｓ　）から、ゲｒＫ発癌性の捷たけ適当な滋養
剤を含有する媒質中ＶＣないかのい１Ｊ１．かの憤１粒
球−大食細胞系細胞、から非発簡性しイト°ン・イｉ＋
るためには、非発熱性リンパ球活性化因子の介在下で上
記細胞系を培養し、ついで上記媒乃中に７’！ｆ放する
ことからなるフランス特に′１出願ｉ６　ｇ２００２５
１に８己車にの方ｔｋも考えられる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　当初は生物学的液体媒質に含まれているリンパ球
   活性化性質又は発熱性−内因性のどちらか又は両方の性
   質を有する因子の分離又は精製方法において、上記媒質
   を抗−ＭＤｐ抗体と接触させて上記因子と上記抗−ＭＤ
   ｐ抗体との複合体を形成せしめ、上記因子又はこの因子
   の殆ど失くなった媒質のどちらが又は両方を回収するこ
   とを特徴とする方法。 ２、　上記複合体を回収し、上記因子をこの複合体から
   分離することからなる特＃′ｒ請求の範囲第１項に記載
   の方法。 ３、　上記因子が７．．４　Ｆ因子であることを特徴と
   する特許請求の範囲第２項に記載の方法〇４、　抗−Ｍ
   ＤＰ抗体が、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アシエル−
   Ｄ−イングルタミン構造を全体としてｌ袖異的に認識し
   、即離（−たＮ−アセチル−ムラミン酸構造又は単離１
   ．たＬ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン構造は除外する
   抗−ＭＤＰ抗体の中から選はれたものであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ５、　抗−Ｍ　Ｉ）　Ｐ抗体が水不溶性の支持物質に−
   ・１定されることを特徴とする特許６〜求の範囲第１項
   に記載の方法。 ６、　抗−ＭＤＰ抗体が水不浴性の支持ｅ１ガに同定さ
   れることｌ／時特徴する特ｒｔ　１ｉ−ｆＩ求の申１＞
   間第３項に記載の方法。 ７　上ｎ＋２複合体をＰＨ４以−トのｒ・嘔性である緩
   衝媒質と接触せしめることを特徴とするＱｂＩＭ’ｌＮ
   ｈ求の範囲第３項に記載の方法。 ８、　上ｇｅ複合体をイオン化塩の濃縮溶液と接触せし
   めることを特徴とする％ｆｒ趙求の範囲第３項に記載の
   方法。 ９　上記生物学的媒質が、免疫ψ１１激さノ１斤顆粒球
   −マクロファージ系列の細胞培養基からの上澄液から成
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法
   。 １０　　上記生物学的媒質が免疫刺激された顆粒球−マ
   クロファージ系列の細胞培養基からの上澄液から成るこ
   とを特徴とする特ｇ／ＦＭＷ求の範囲第３項に記載の方
   法。 １１、上記生物学的媒質が約１２０００未満の分子餡を
   もつ蛋白質を含′−１，ないことを特徴とする特許請求
   の範囲第９項に記載の方法。 １２、上記生物学的液体媒質が抽出するべき生物学的成
   分およびり、４Ｆ性質をも有するパイロジエン−エンド
   ジエン因子を含むことを特徴とし。 上Ｍｔ２パイロジエンーエンドジエン因子と上記抗−Ｍ
   ＤＰ抗体とから形成された複合体を分離し１、上記生物
   学的成分を含み、パイロジエン−エンドジエン混入物は
   実質的に含まない上記生物学的媒質を回収することを特
   徴とする％ＦＦ請求の範囲第１項に記載の方法。 １３、上記生物学的成分がインターフニーロンでろるこ
   とを特徴とする特許開求の範囲第１２項に記載の方法。