JPS5954966A - 免疫学的測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫学的測定試薬に関する。

近年、免疫学の進歩により、従来、未知の分野であった
抗体の研究が進み、その産生の制御機構や抗体本体の生
化学的組成、性質等が詳細に調べられてき工、いる。

１９７５年、Ｃ．Ｍｌｌｓｔｅｉｎ　らはマウスのミエ
ローマ細癲と牌臓中の抗体産生細胞とを細胞融合するこ
とによって、単クローン性抗体の産生に成功した。この
単クローン性抗体は免疫学の基礎的研究の発展に大きく
寄与することが期待され、その方面の研究が盛んに行わ
れている。

高感度で、かつ、定量的な免疫学的測定法としては、従
来、放射免疫測定法（ＲＩＡ）及び酵素免疫測定法（Ｅ
ＩＡ）が用いられておシ、特にこイｔらの方法をペース
とするサンドイッチ法は操作が簡便なこと、測定感度が
高いことから多用さ２ているが、測定に１日〜４日が必
要であるので、この時間をできるだけ短くすることが望
まれている。更に、近年の臨床医学の進歩から、検査結
果を迅速に知り、直ちに必要な措置をとることが要求さ
れるようになったため、この面がらも検査時間の短縮が
熱望されている。

しかし、従来のサンドイッチ法では後記のような理由に
より、反応時間を短縮すると測定感度及び精度が低下す
るという問題があり、大巾な時間短縮は不可能であった
。

本発明者らは、この問題を解決するために研究を重ねた
結果、従来、不溶化抗体と標識抗体として同一の抗原を
投与して得た、ほぼ同一の抗体、いわゆる多クローン性
抗体を使用していたものを、本発明においては同一の抗
原の異なる抗原決定部位を認識して結合する抗体、いわ
ゆる単クローン性抗体を複数種使用することによって測
定精度を低下させることなく、測定感度の大巾な向上お
よび測定時間の大巾な短縮に成功したものである。

以下、本発明を従来法と対比して詳細に説明する。なお
、説明の便宜上、ＥＩＡに基づくサンドイッチ法を例と
して説明するが、ＦＩＡ（螢光免疫測定法）でも同様で
ある。

従来の測定法は第１図の模式図に示すように次の順序に
よって行わｎる。　　。

ｉ）被測定抗原３に対する抗体を不溶性担体（同相）４
に結合させた不溶化杭体２ａと被測定抗原３とを反応さ
せて、同相上の抗体２ａに被測定抗原３を結合させる。

ｉｉ）固相４を洗浄して未反応物質を除去する。

ｉｉｉ）洗浄した固相４に、被測定抗原３に対する抗体
に酵素５を結合させた酵素標識抗体１ａ（以下、単に標
識抗体という〕を反応させて、固相４に結合している被
測定抗原３の未反応部位に標識抗体１ａを結合させる。

ｉＶ）固相４を洗浄して過剰の標識抗体１ａを除去した
後、酵素基質を添加して酵素反応を行わしめる。　　　
　　　　　　　　、。

固相４には、被測定抗原３と標識Ｒｇ体１ａとが結合し
ているので、この酵素の存在量に比例した酵素反応が起
き、その結果生ずる反応生成物の量から被測定抗原３の
量を測定する。

一般にサンドインチ法は非競合反応法に分類されている
ため、競合反応はまったく生じないかのように考えがち
であるが、分類上、そう言われているだけであって、実
際は平衡関係が成立していると考えら孔、これを模式的
に示すと次のようになる。

（ここに、｛Ａｂ｝は不溶化抗体、Ａｇは被測定抗原、
Ａｂ＊は標識抗体、ａ、ａ’，ｂ，ｂ’、ｃ，ｃ′、ｄ
，ｄ’、ｅ、ｅ’はそれぞれ平衡定数を表わし、−は抗
原と抗体が結合していることを表わす。）即ち、第二反
応において不溶化抗体と被測定抗原との結合物に標識抗
体を反応させると、不溶化抗体と標識抗体とが、被測定
抗原に対するそれそれの親和力に応じて、被測定抗原を
奪い合うこととな２１ため（不溶化抗体と標識抗体とは
ほぼ同一の抗体であるから、被測定抗原に対する親和力
は件は同等と季えられる）、第一反応によって生じた不
溶化抗体−被測定抗原結合物が解離して、前記のよ？な
種々の結合状態の結合物を生ずることとなる。

このことは、次の実験によって示される。即ち、抗ＨＣ
Ｇ−βサブユニット坑体を結合させたイラスチック製試
験管にパ−オキシデースで標識したＨＣＧ−βを反応さ
せた後、洗浄する。これに、坑ＨｃＧ−β坑体を反応さ
せると、一旦、固相に結合した酵素標識ＨＣＧ−βは、
時間の経過と共に固相から解離して、液相に移行する。

第２図はこの状態を示したものである。

ただし、第一反応の時間を十分に長くすると一部の坑原
抗体結合は非可逆的となるため、この結合物に標識抗体
を加えても結合物の解離は生じ難くなる。又、第二反応
の時間を十分に長時間とするど、反応は不溶化抗体−被
測定抗原−標識抗体結合物の生成する方向に進むといわ
れている。そのため、従来療ではこれらのネ応時間を十
分に長時間とすることが必須の要件であった。したがっ
て、第一反応を行なわないか又は極端に短＜Ｌた場合、
例えば、不溶化抗体と標識抗体とを同時に被測定抗原に
反応させた場合には第二反応の反応時間の遷延化、測定
感度及び精度の低下が生じ、又、第二反応の反応時間を
短くすると測定感度及び精度の大巾な低下が生じる。こ
のような理由により、従来法では測定感度及び精度の低
下を生ずることなく１反応時間を短縮することは不可能
であった。なお、このような競合反応が存在すること及
び反応時間を十分に長くすると、反応が一部非可逆化す
ることは市原ら〔臨床病理、２６、１０２７（１９７８
））によっても報告されている。

このように、従来の測定法における反応様式が複雑、非
効率的で、かつ、長時間を要するのは、使用する抗体が
多クローン性抗体であっで、不溶化抗体と標識抗体とが
ほぼ同一の抗体からなるため、両者が同一抗原の同−抗
原決定部位に対して競合的に反応するためであると考え
られる。

本発明は不溶化抗体の抗体と標識抗体の抗体とが、同じ
被測定抗原の異なる抗原決定蔀位を認識して結合するこ
とか可能な抗体、あ名いは、一方の抗体が抗原に結合す
Δどと―よっそ他方の抗体の結合を妨害するような近接
部位を避りで、互に干渉のない部位に結谷するよらな坑
体からなることを特徴とするものである。

このような抗体として、単クローン性抗体が適している
が、抗原抗体反応をさらに効果的に行なわせるためには
不溶化抗体として１種以上の、標識抗体として２種以上
の、各々抗原認識部位の異なった単クローン性抗体を使
用するのが好ましい。

単クローン性の抗体はミエローマ細胞と抗体産生細胞を
Ｍｉｌｓｔｅｉｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、２５６，４
９５（１９７５））によって融合させた細胞由来の抗体
であり、同一クローンの抗体産生細胞から産生された抗
体であるので、その抗体は完全に同一であり、抗原に対
する特異性も岑全に同−であると考えられる。被測定抗
原は通常、いく２かの抗原決定部位を持っているので、
不溶化抗体及び標識抗体として、それぞれ異なった杭原
決定部位に対する単クローン性抗体を組合せて用いれば
、抗体間の競合は起きず、特異性９高い測定を行なうこ
とがで竺る。さらに、このような競合を起こさない単り
ローン性抗体を、不溶化抗体及び標識抗体として、２種
以上混合して用いることにより反応時間の短楠と一層高
い感度と信頼性が得られる。

単クローン性抗体は特異性が非常に高いため、これらの
抗体を混合して用いると、逆に全体どしての特異性が低
下するのではないがという懸念が存在するが、混合する
各々の抗体の特異性が十分に高ければ、全体としての特
異性が低下することは全くない。

所望する測定感度、反応速度を得るために混合する単ク
ローン性抗体の種類は２〜５種類が適当であり、これ以
上の種類を混合しても、測定感度、反応速度のよリ以上
の向上は認められない。

本発明における測定は従来と同様に行なうことができる
。しかし、その反応機構は次に示すように、不溶化抗体
と標識抗体とが競合せず、従来法に比べて単純になって
いると考えら杆る。

ｐ＞＞ｐ’、ｑ＞＞ｑ′、ｒ＞＞ｒ’、ｓ＞＞ｓ′（と
こに、｛Ａｂ｝、Ａｇ、Ａｂ＊、−は前記と同じ意味を
表わし、ｐ、ｐ’、ｑ，ｑ’、ｒ，ｒ’、ｓ，ｓ’はそ
れぞれ平衡定数を表わす。〕 即ち、不溶化抗体と標識抗体との抗原に対する結合部位
が互に異なる場合には、両者の競合は生じないので、反
応は、反応液中の成分が不溶化抗体−抗原−標識抗体結
合物を生成する方向に進行する。

このことは、次の実験から裏づけられる。即ち、従来法
において述べたものと同じ実験系において、不溶化抗体
及び標識抗体として、ＨＣＧの異なる抗原決定部位を認
識する２種類の単クローン性抗ＨＣＧ抗体を用いて、同
様に実験を行なった。結果は第３図に示したように、一
旦不溶化抗体と結合した抗原は、これに、異なった抗原
認識部位をもつ抗ＨＣＧ抗体を加えても不溶化抗体（固
相）からの解離は認められず、抗原に対する抗体間の競
合は生じていないと考えられる。この反応様式は不溶化
抗体および標識抗体としてそれぞれ抗原認識部位の異な
る複数種の単クローン性抗体金同時に用いた場合でも同
様であり、反応効率はさらに向上するものと考えられる
。したがって、本発明においては、不溶化抗体、被測定
抗原及び標識抗体の三者を同時に反応させても、不溶化
抗体と被測定抗原とを混合した後標識抗抹を反応させて
も、更には、不溶化抗体と被測定抗原とを反応さぜた後
、しばらく間隔をおいて標識抗体を反応させても同様な
結果が得られるので、反応順序は全く制限されない。こ
のようなうとは多クローン性抗体を用いる従来の試薬で
は不可能であった。

本発明の反応様式を第４図に模式図で示した。

不溶化抗体２ｂ及び２ｃと標識抗体１ｂ及び１ｃとは競
合しないので、より短時間た、より多くの標識抗体１ｂ
及び１Ｃが被測定抗原３の各々の抗原決定部位６ｂ、６
ｃと結合することが可能であり、測定時間の短縮化とと
もに、測定精度及び感度を高めることができる。

第１表はα−フェトプロティン（ＡＦＰ）を測定した場
合の本発明の方法を多クローン性抗体を用いた従来法お
よび不溶化粒体と標識抗体とに抗原認識部位の異なる、
単クローン性抗体各一種類傘用いた方法（比較法１）と
比較したものである。表から叩らかなように、測定時間
の大巾な短縮、測定操作の簡易化、測定精度及び感度の
向上等多くの利点が得られる。

なお、検体は妊婦血清、固相はポリスチロール製試験管
、標識酵素は西洋ワサビバ−オキシデース、基質はフロ
レチン酸を用いて、螢光光度計にて測定した。

又、不溶化抗体と標識抗体のいずれか一方を単クローン
性抗体とし、他方を従来から用いられている多クローン
性抗体とすることも可能である。しかし、この場合は単
クローン性抗体と多クローン性抗体とが共有する抗原決
定部位で競合が生じ、かつ、多クローン性抗体との親和
力が強く働くと考えられるため、両抗体とも単クローン
性抗体である場合は勿論、従来法に比べでも、その測定
精度及び感度は低下することとガる。

第５図は不溶化抗体と標識抗体とを第２表のように組合
せたＣＥＡ（癌胎児性蛋白）測定系における標準曲線を
示したものである。本発明め組合せによる測定系が最も
優れていることは明らかである。

なお、単クローン性抗体は後記の実施例２に準じてマウ
スミエローマ細胞を用いた細胞融合法によって得た抗原
認識部位の互に異なるクローン由来のものを使用し、多
クローン性抗体はＤＡＫＯ社製（デンマーク）を用い、
不溶性担体はポリスチロール試験管、酵素は西洋ワサビ
パー−オキシ７’−ス、基質はｏ−フェニレンジアミン
を用いた。

単クローン性抗体を得るためのミエローマ細胞と抗体産
生細胞との組合せは、各細胞が融合して、増殖しつつ抗
体を産生ずることが可能であれば、それぞれの細胞の由
来する動物の種類は限定されず、任意の組合せでよい。

本発明における不溶性担体としてはポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリアクリル、テフロン、紙、ガラス、アガ
ロース等、従来の免疫学的測定において使用されている
ものはすべて使用しうる。又、その形状はロレット状、
球状、棒状、盤状あるいは容器状、例えば光学セル、試
験管等のものが使用しうるが、他の形状であってもよい
。、　　　　　　　　　　　　　・標識剤としては、Ｅ
ＩＡではバ−オキシデース、β−Ｄ−ガラグトジデース
、アルカリホスファテース等が、ＦＩＡではフルオレッ
センインチオサイアエート等が通常使用されるが、その
標識剤の活性が測定可能であれば、その他のものであっ
てもよい。

標識剤が酵素である場合は、その活性を測定するために
基質を必要とする。この基質としては、対応する抗索と
反応して生成された生成物の量又は基質の減少量若しく
は残存量が容易に測定し得るものであればよい。例えば
、パ−オキシデースの基質どしては５−アミノサリチル
酸−Ｈ２Ｏ２、ｏ−フェニレンジアミン−Ｈ２Ｏ２，４
−アミノアンチビリンーＨ２Ｏ２、フロレチン酸−Ｈ２
Ｏ２等、β−Ｄ−ガラクトシデースの基質としてはフル
オレゼイン−ジー（β−Ｄ−ガラクトピラノシド），ｏ
−ニトロフェノール−β−Ｄ一ガラクトビラノシド、４
−メチルウンペリフェリルーβ−Ｄーガラクトシド等を
挙げることができる。

本発明の試薬によって測定し得る物質は、一分子中に抗
原決定部位を３個以上持つことが必要であるが、従来、
サンドイッチ法で測定していた物質は大部分、３個以上
の抗原決定部位を持っているので、実質上、従来法で測
定し得た物質はすべて測定可能である。例を挙げれば、
γ−グルタミルトランスベプチデース（γ−ＧＴＰ）、
アルカリフォスファテース、糖転位酵素等の酵素類，甲
状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），黄体刺激ホルモン（ＬＨ
）、胎盤性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）、インスリン、
セクレチン，成長ホルモン（ＧＨ）等の蛋白性ホルモン
類，フィブリン分解物（ＦＤＰ）、Ｃ−反応性蛋白（Ｃ
ＲＰ）、α１−酸性グリコプロデイン（α１−ＡＧ）、
α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ），α２−プラス
ミンインヒビター（α２−ＰＩ）、β２−ミクログロブ
リン（β２−ＭＧ）、免疫グロブリン等の血漿蛋白類、
α−フェドプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性蛋白（ＣＥ
Ａ）、胎児性フェリチン等の癌胎児性蛋白類、リンパ球
、微生物等の細胞、細胞表面坑原、細胞分画等である。

本発明の試薬は、前記のように、不溶化抗体、被測定抗
原及び標識抗体の反応順序は何ら制限されないので、不
溶化抗体と標識抗体を予め混合しておくことが可能であ
る。即ち、不溶性担体として適当な容器を用い、この内
壁に抗体を結合させて不溶化させると共に、標識抗体を
収納することができる。収納標識抗体は溶液状であって
も、その溶液を凍結乾燥したものであっ゛てもよく、さ
らに、錠剤、顆粒又は粉末状であってもよい。

本発明の試薬は不溶化抗体と標識抗体とから構成される
が、この試薬の使用を便ならしめるために、種々の補助
剤を包含させることができる。例えば、標識抗体が固体
状である場合にそれを溶解させるための溶解剤、不溶化
抗体と被測定抗原とを反応させた後及びこれに標識抗体
を反応させた後に固相を洗浄するための洗浄液、標識剤
が酵素である場合にその酵素活性を測定するための基質
、及び酵素反応を停止するための反応停止剤を任意の組
合せで包含させることができる。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１　ＡＦＰ測定試薬　、　　　　　′ａ）精製Ａ
ＦＰの製造 肝癌患者腹水５ｌから硫酸アンモニウムによる塩析法（
４５％上清、７０％沈殿）により、ＡＦＰ粗抽出物１６
．２ｇを得た。これを、兎抗ＡＦＰ抗体結合セファロー
ネ４Ｂ（１ｍｇ／ｍｌセファロース）５０ｍｌを用いた
アフィニティークロマトグラフィーにより精製して、精
製ＡＦＰ９２４ｍｇを得た。

ｂ）単クローン性抗ＡＦＰ抗体の製造 前記ａ）で製造した精製ＡＦＰ５０μｇを完全フロイン
トアジュバント（ＣＦＡ）と共に雌性ＢＡＬＢ／ｃマウ
ス皮下に投与した。１週毎に４回投与した後、４日目に
脾臓を摘出して脾細胞を採取した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’
ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＭＥＭ培地（以下Ｄ−ＭＥＭと
略す）にて洗浄した後１×１０８個を計測して、１Ｘ１
０７個のマウスミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａ
ｇ　４．１）と混ぜ、３７℃の４２．５％ポリエチレン
グリコ−ル＋１５４０および７．５％ジメチルスルフォ
キシドを含むＤ−ＭＥＭ１ｍｌ中で１分間融合させた。

この細胞にＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６
４０培地）を２０ｍｌになるように加えて、９６ウェル
　マイクロプレートに０．２ｍｌずつ分注して２週間培
養した後、増殖したウェル中の培養上清の抗体活性を測
定した。

次に、活性の認められたウェルの細胞をＢＡＬＢ／Ｃマ
ウス胸腺細胞を含む１０％牛胎児血清加ＲＰＭＩ−１６
４０培地４０ｍｌ中に添加した。この細胞浮遊液を９６
ウェル　マイクロプレート２枚に分注し．１週間培養し
て９株の抗ＡＦＰ抗体産生性ハイブリドーマを得た。

これらを大量に培養し、それぞれ得られた培養上清１０
ｌを精製ＡＦＰを結合したセ７ァロース４Ｂ（０．５ｍ
ｇＡＦＰ／ｍｌセファロース）５０ｍｌを用いたアフィ
ニティークロマトクラフィーにより精製を行い、それぞ
れ４．２〜１１．６ｍｌの単クロ−ン炸抗体を得た。各
抗体のＬｏｔＮｏ．を１〜９とした。

ｃ）抗原認識部位の同定 ｉ）抗ＡＦＰ抗体感作試験管の製造 ０．０５Ｍリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ６，４（以後ＰＢ
Ｓと喘ず）にて洗浄したポリスチレン製試験管にＬｏｔ
Ｎｏ．１〜９の単クローン性抗ＡＦＰ抗体０．２ｍｇを
それぞれ含むＰＢＳ２ｍｌを別々の試験管に加え、５６
°Ｃ２０分間反応を行った後ＰＢＳで洗浄して感作試験
管を製造した。

ｉｉ）酵素標識抗ＡＦＰ抗体の製造 西洋ワサビパ−オキシデース（ベーリンガー・マンハイ
ム社　グレード１；以後ＨＲＰＯと略す）５ｍｌをＯ．
３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液１．０ｍｌに溶解し、これ
に０．１ｍｌの１％　１−フルオロー２．４−ジニトロ
ベンゼンエタノール溶液を功え、１時間反応させこ。

さらに、１．０ｍｌの０．０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム
溶液を加えて３０分間反応させ、次に、１．０ｍｌの０
．１６Ｍエチレングリコール浴液を加えて１時間反応さ
せた後、０．０１Ｍ　炭酸ナトリウム溶液ｐＨ９．５に
対して透析した。この溶液に、前記ｂ〕において製造し
た９種の抗ＡＦＰ抗体５ｍｇをそれそれ加え、室温で３
時間反応させた後に５ｍｇの水素化硼素ナトリウムを加
えて１晩反応させた。ざらに、０．０１Ｍ　ＰＢＳ　ｐ
Ｈ７．２に対して透析してＨＲＰＯ標識抗ＡＦＰ抗体を
得た。

ｉｉｉ）抗原認識部位の同定 前記１）で製造した各抗ＡＦＰ抗体感作試験管にＰＢＳ
１．５ｍｌ、前記ａ）で製造したＡＦＰを１００ｎｇ／
ｍｌとなるようＰＢＳで希釈した標準液０．１ｍｌおよ
び前記ｉｉ）で製造したＨＲＰＯ標識抗ＡＦＰ抗体１０
０倍希釈溶液０．４ｍｌ加え、３０分間反応を行った。

反応終了後、洗浄液で洗浄し．１００ｍｇ／ｍｌの０−
フェニレンジアミンおよび０．０１％過酸化水素を含む
酵素基質溶液３ｍｌを加え３０分間反応を行った。、４
Ｍ硫酸０．０５ｍｌを加えて酵素反応を停止した後、４
５０ｎｍにおける吸光度を測定し、反応の得られた組合
せを＋．得られなかった組合せを−とじて第３表に示し
た。

抗原認識部位の差より前記ｂ）で得られた９株の単クロ
−ン性抗ＡＦＰ抗体はＬｏｔ　Ｎｏ．１、２．３，５．
７の５株とＬｏｔ Ｎｏ．６の１株と、Ｌｏｔ　Ｎｏ．
４．８、９の３株との３種類に分別することができ、そ
れぞれ抗ＡＦＰ抗体〔Ａ〕，（Ｂ）及び〔Ｃ〕とじた。

ｄ）ＡＦＰ測定試薬の製造 前記ｂ〕により製造した単クローン性抗体のうちの〔Ａ
）を用いて、前記ｃ−ｉ〕の方法によって抗ＡＦＰ抗体
感作試験管を製造した。

又、Ｃ−ｉｉ）の方法により、単クロ−ン性抗体（Ｂ〕
および〔Ｃ〕にＨＲＰＯを標識した後、これを、ＰＢＳ
にて１０倍に希釈して、２ｍｌづつに充填した。次いで
、この両者を凍結乾燥した後密栓して、ＡＦＰ測定試薬
を製造した。

ｅ）ＡＦＰの測定 前記ｄ）で製造した抗ＡＦＰ抗体感作試験管にＰＢＳ１
．８ｍｌを加えた後、前記ａ）で製造したＡＦＰを１０
００、１００、１０、１、０ｎｇ／ｕｌとなるよう健常
人血清で希釈した各＠度の標準液０．１ｍｌおよび前記
ｄ）で製造したＨＲＰＯ標識抗ＡＦＰ抗体を２ｍｌの精
製水にて溶解した液０、１ｍｌを加え、１０分間反応を
行った。反応終了後、０．００５％　ツィーン２０を含
む生理食塩水（以下洗浄剤と略す）で洗浄し、３００ｍ
ｇ／Ｕｌのフロレチン酸および０．０１％過酸化水素を
含む酵素基質溶液３ｍｌを加え１０分間反応を行った。

５％亜硫酸ナトリウム０．１ｍｌを加え酵素反応を停止
した後、螢光々度計を用いて励起波長３２５ｎｍ、螢光
波長４２０ｎｍにて螢光強度を測定した。得られた標準
曲線を第６図に示した。

実施例２　ＣＥＡ測定試薬 ａ）精製ＣＥＡの製造 大腸癌組織４０ｇを細切し、これに１００ｍｌの蒸留水
金加えホモジナイザーを用いて破砕した。この液に、同
量の１．２Ｍ過塩素酸を加えて、攪拌下に３０分間抽出
を行った。遠心分離により上清を得、これを蒸留水に対
して透析してＣＥＡ粗抽出物を得た。

この粗抽出物を１０ｍｌに濃縮して、あらかじめ生理食
塩水にて平衡化しておいた Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂを用いてゲル濾過を行い、第
１分画を得た。これを同様に平衡化したＳｅｐｈａｄｅ
ｘ　Ｇ−２００にて再びゲル濾過を行い、第２分画を採
取して２ｍｌに濃縮して精製ＣＥＡ１３５μｇを得た。

ｂ）単クローン性抗ＣＥＡ抗体の製造 前記ａ）で製造した精製ＣＥＡを用いて実施例１−ｂ）
と同じ操作で抗ＣＥＡ産生性ハイブリドーマ２３株を得
た。

なお、マウスの免疫は各投与共に精製ＣＥＡ゛３０μｇ
を用いた。あらかじめ、腹腔に０．５ｍｌのプリスタン
（２，６、１０，１４−テトラメチルペンタデカン；和
光純薬）を投与した雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に、
１Ｘ１Ｏ６個の各ハイブリドーマを接種して、２週間後
に腹水を採取した。各腹水を０．０１Ｍりン酸緩衝液ｐ
Ｈ７．０で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースによりクロ
マトグラフィーを行ない、未吸着分画を単クローン性抗
ＣＥＡ抗体として得た。実施例１−Ｃ）に準じた抗原認
識部位の同定試験の結果、各抗体は９種類にわけられ、
各々９Ｌｏｔ、５Ｌｏｔ、３Ｌｏｔ、あとは１Ｌｏｔず
つであり、それぞれ抗ＣＥＡ抗体〔Ａ〕、〔Ｂ〕、〔Ｃ
〕、〔Ｄ〕、〔Ｅ〕、〔Ｆ〕、〔Ｇ〕、〔Ｈ〕・および
（Ｊ〕とした。

ｃ）抗ＣＥＡ抗体感作試験管の製造 ポリスチレン製試験管をＰＢＳにて洗浄した後、前記ｂ
）で製造した抗ＣＥＡ抗体〔Ａ〕、〔Ｅ〕（１ｍｇ／ｍ
ｌ）各々１ｍｌ入れて、５６℃２０分間反応させた。反
応後ＰＢＳで洗浄して抗ＣＥＡ抗体（Ａ）、（Ｅ）感作
試験管を製造した。　　　　・ ｄ）ＣＥＡ測定試薬の製造 前記ｂ）で製造した抗ＣＥＡ抗体〔Ｂ〕、〔Ｃ）。

〔Ｄ〕および〔Ｇ〕を用いて実施例１−ｃ−ｉｉ）に準
じてＨＲＰＯ標識抗ＣＥＡ抗体〔Ｂ），（Ｃ〕、〔Ｄ〕
、〔Ｇ〕を得た。これを生理食塩水にて５０倍に希釈し
て、前記ｃ）で製造した抗ＣＥＡ抗体〔Ａ）、〔Ｅ〕感
作試験管に０．２ｍｌずつ分注して凍結乾燥を行い、Ｃ
ＥＡ測定試薬を製造した。

ｅ）ＣＥＡの測定 前記ａ）で製造した精製ＣＥＡを健常人血清で希釈して
１００、３０，１０，３．１，０．３，０．１ｎｇ／ｍ
ｌの濃度とし、各々０．２ｍｌと蒸留水各々０．８ｍｌ
とを前記ｄ）で製造したＣＥＡ測定試薬に同時に加え、
１５分間攪拌下で反応させた。反応終了後、試験管を洗
浄剤にて洗浄した後に、５００ｍｇ／ｕｌのｏ−フェニ
レンジアミンおよび０．０２％過酸化水素を含む基質溶
液０．５ｍｌを加え１０分間反応させた。２Ｎ亜硫酸０
．１ｍｌを加えて反応を停止した後、分光々度計を使用
して波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。

得られた標準曲線を第７図に示した。

実施例３　　ＨＣＧ−β測定試薬 ａ）ＨＣＧ−βサブユニットの製造 ＨＣＧ（２０００ｉｕ／ｍｇ）１ｇを２ｍｌ０．０２５
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５．６に溶解し、あらかじめ同じ緩
衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｄｅｘＡ−５
０　３ｇを用いでクロマトグラフィーを行った。０．０
５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５，６溶出分画を採取し蒸留水に
対して透析して精製ＨＣＧ３０８ｍｇを得、これを凍結
乾燥した。このうち３００ｍｇを１０Ｍ尿素（ｐＨ４，
５）１０ｍｌに溶解し、４０℃　１時間反させた。あら
がじめ０．０３Ｍ　グリシンおよび１０Ｍ尿素を含む溶
液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−５０
２ｇを用いてクロマドグラフィーを行い、０．２Ｍグリ
シン、１Ｍ　ＮａＣｌおよび８Ｍ尿素を含む溶液で溶出
して得た分画を生理食塩水に対して透析してＨＣＧ−β
サブユニット１４７ｍｇを得た。

ｂ）抗ＨＣＧ−β抗体の製造 抗原を膜力する動物をＢＡＬＢ／ｃマウスの代りにウィ
スター系ラットを用いて実施例２−ｂ〕の方法に準じ、
１７　Ｌｏｔの抗ＨＣＧ−β抗体を製造した。これらの
抗体について、実施例１−ｃ）の方法に準じて抗原認識
部位の同定を行ない、それぞれ７、５、４、及び１　Ｌ
ｏｔ　を包含する４種類に分別し、それぞれ抗ＨＣＧ−
β抗体〔Ａ〕、〔Ｂ〕、〔Ｃ）および〔Ｄ〕とした。

ｃ）抗ＨＣＧ−β抗体感作ビーズ（不溶化担体）の製造 ポリエチレンピーズ１００個を前記ｂ）で製造した抗Ｈ
ＣＧ−β抗体〔Ａ〕、〔Ｂ〕各々２５ｍｇを含む１００
ｍｌのＰＢＳ中に加え、５６℃２０分間反応を行なった
後ＰＢＳで洗浄して、抗ＨＣＧ−β抗体（Ａ〕、〔Ｂ〕
感作ビーズを製造した。

ｄ）酵素標識抗ＨＣＧ−β抗体の製造 前記ｂ）により製造した抗ＨＣＧ−β抗体（Ｃ）、〔Ｄ
〕を用いて、実施例１−ｃ−ｉｉ）と同様に操作した後
、ＰＢＳで２００倍に希釈して、ＨＲＰＯ標識抗ＨＣＧ
−β抗体〔Ｃ〕、〔Ｄ〕を製造した。

ｅ）洗浄剤の製造 ９ｇのＮａＣｌおよび５０ｕｌのツィ−ン２０を精秤し
て精製水にて１００ｍｌとした。この溶液をバイアルに
充填して、洗浄剤１０倍濃縮液を製造した。

ｆ）酵素基質の製造 ５−アミノサリチル酸２６．４０ｇ、およびリン酸−カ
リウム５４．３４ｇおよびリン酸二ナトリウム５．７２
ｇを乳鉢にて混合微粒化した後、５００ｍｇを精秤して
バイアルに充填した。過酸化水素（３０％溶液）１．５
ｍｌを精製水にて１００ｍ１となるよう希釈した後、１
ｍｌを測りアンブルに充填して熔閉した。以上により酵
素基質を製造した。

ｇ）酵素反応停止剤の製造 アジ化ナトリウム２ｇを精秤して１００ｍｌの精製水に
溶解した後２ｍｌずつアンプルに充填し、熔閉して僚索
反応停止剤を製造した。

ｈ）ＨＣＧ測定試薬の作成 前記ｃ）〜ｇ）にて製造した材料を下記の如く組合わせ
て、ＨＣＧ測定試薬を作成した。

１．抗ＨＣＧ−β抗体（Ａ）、〔Ｂ）感作ビーズ ２、ＨＲＰＯ標識抗ＨＣＧ−β抗体（Ｃ）、〔Ｄ〕３．
洗浄剤（１０倍暉縮液） ４、酵素基質（５−アミノサリチル酸、過酸化水素） ５．酵素反応停止剤 ｉ）ＨＣＧの測定 前記ｈ）で作成したＨＣＧ測定試薬を用いて以下の測定
を行った。ＨＲＰＯ標識抗ＨＣＧ−β抗体〔Ｃ〕、〔Ｄ
〕０．４ｍｌを試験管にとり、これに抗ＨＣＧ−β抗体
〔Ａ〕、〔Ｂ〕感作ビーズ１個を加え、次に日本薬局方
収載のＨＣＧを健常人血清で５０００，５００，５０，
５，０．５ｍｉｕ／ｍｌに希釈した標準液各０．１ｍｌ
を加え１０分間反応を行った。反応終了後洗浄剤を精製
水にて１０倍に希釈して、これを用いてビーズを洗浄し
、次に酵素基質の全量を精製水１５０ｍｌに溶解した基
質溶液３ｍｌを加え、３０分間反応を行った。その後酵
素反応停止剤０．０２５ｍｌを加えて反応を停止させ、
反応液の５００ｎｍにおける吸光度を測定した。得られ
た椰準曲線を第８図に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は従来のサンドイッチ法における反応様式を示す
模式図、第２図及び第３図は抗体間の競合が存在するか
否かの実験結果を示すグラフ、第４図は本発明の反応様
式を示す模式図、第５図は本発明と従来法との比較を示
すグラフ、第６図は実施例１の結果を示すグラフ、第７
図は実施例２の結果を示すグラフ、第８図は実施例４の
結果を示すグラフである。 １ａ、１ｂ、１ｃ、・・・標識抗体、２ａ、２ｂ、２ｃ
・・・不溶化抗体、３・・・被測定抗原、４・・・不溶
性担体（固相）、５・・・標識剤（酵素等）、６ｂ、６
ｃ・・・抗原決定部位

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）サンドイッチ法による免疫学的測定試薬において
   、不溶化抗体が同一被測定抗原のそれぞれ異なる抗原決
   定部位を認識して結合することが可能な１種以上の単ク
   ローン性抗体からなり、標識抗体が前記被測定抗原の前
   記とは異なる抗原決定部位を認識して結合することか可
   能な２種以上の互いに異なった単クローン性抗体からな
   ることを特徴とする免疫学的測定試薬。
2. （２）不溶性担体がガラスもしくはプラスチック製容器
   又はプラスチック製ビーズである特許請求の範囲第１項
   記載の試薬。
3. （３）標識剤が酵素又は螢光物質である特許請求の範囲
   第１項記載の試薬。
4. （４）標識抗体を、抗体を不溶化するための不溶性担体
   であるガラスもしくはプラスチック製容器に収納してな
   る特許請求の範囲第１項記載の試薬。
5. （５）不溶化抗体および標識抗体が凍結乾燥物である特
   許請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか一項に記載
   の試薬。
6. （６）次の構成成分からなる特許請求め範囲第１項記載
   の試薬： ａ）不溶化抗体、 ｂ）標識抗体、 ｃ）溶解剤、洗浄剤、基質及び反応停止剤から選ばれた
   １種乃至４種の補助剤。
7. （７）サンドイッチ法による免疫学釣用測定方法におい
   て、同一被測定抗原のそれぞれ異なる抗原決定部位を認
   識じて結合することが可能な１種以上の単クローン性抗
   体を含む不溶化抗体と、前記被測定抗原の前記とは異カ
   る抗原決定部位を認識して結合することが可能な２種以
   上の互いに異なる単クローン性抗体を含む標識抗体とを
   被測定抗原に同時に反応させることを特徴とする免疫学
   的測定方法。