JPS596845B2 - 抗血友病因子の収率改良法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗血友病因子（ＡＨＦ、第■因子）の濃縮法に
関する。

特に、本発明は血漿および血漿分屑から得られるＡＨＦ
の収率の改良法に関する。

凝血機序は複雑な生化学的作用であって正常な全面内に
存在するいくつかの物質の相互反応を伴なう。

凝血機序に関連する或る因子が或る個体のうちに欠如し
ているか或は非常に欠乏していることは公知である。

従って、古典的血友病（Ａ型血友病）がＡＨＦ （第
■因子）の欠如に起因する欠損病であることは公知であ
る。

Ｂ型血友病として公知である先天性血友病にかかつてい
る個体に於では、血液に血漿トロンポプラステン形成因
子（ＰＴＣ，第■因子）が欠乏している。

凝血機序に於て重要なその他のいくつかの因子は、第■
、第■、第Ｘ因子である。

近年まで、血友病の治療法は患者に全血或は血漿全体を
輸血することであった。

しかし、実際には、できることならば欠損している血液
成分だけを患者に投与することがすぐれた治療法である
と言われている。

治療用血液の全体量が不足しているので、血液を種々の
成分に分別することは、また、それらの成分を必要に応
じて患者の治療用に使用し得る点に於でも有利である。

血液および血漿をその個別成分に分別したり或はそれを
濃縮する種々の方法は公知である。

アルコール分別法の発達に於ける・・−バード大学のＥ
ｄｗ ｉｎ Ｃ ｏｈｎ と彼の共同研究者の仕事は特
に注目すべきである。

特にＡＨＦ生成に関しては、最近の米国特許３６３１０
１８と３６５２５３０とに該因子の高純度濃縮物を得る
ための改良法が開示されている。

ｗａｇｎｅｒ， Ｔｈｅｌｉｎ， Ｂｒｉｎｋｈｏｕｓ
およびその他のＡＨＦ生成に関心を持つ人々の研究活動
に於て、プロトロンビン（第■因子）およびそれの会合
した因子群複合体の存在が、長期間に於ても短期間に於
ても第■因子の安定性をそこなうことが見出された。

この問題を解決するための通常の処理は、水酸化アルミ
ニウム、水酸化マグネシウム、炭酸バリ゛ウム、硫酸バ
リウム、リバノール（６・９一ジアミノ−２−エトキシ
アクリジン乳酸塩）、ＩＲＣ −５０イオン交換樹脂（
ＸＥ−６ ４−リバノール）、グリシンエチルエステ
ルのような種々の試薬でプロトロンビン・コンプレック
スヲ除去することであった。

前記の試薬は一般的には有効であるが、臨床上に適用さ
れた場合それ等の試薬の使用には種々の重大な欠点が存
在することが明白になった。

プロトロンビンの除去によりトロンビンが生成されない
ので、これらの試薬の使用によって第■因子は、実際に
安定化される。

Ｋｉｓｋｅｒ著、「Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔｈ． Ｈａ
ｅｍｏｒｒｈａｇｉｃａＪ第１７巻、第３８１頁（１９
６７年）およびＰｅｎｉｃｋ ａｎｄ Ｂ ｒｉｎｋｈ
ｏｕｓ著、「Ａｍｅｒ ． Ｊ ． Ｍｅｄ ， Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ ， Ｊ第２３２巻、第４３４頁（１９
５６年）に於て報告されているように、トロンビンが主
に第■因子の分解要因である。

従って、第■因子の脂肪族アミノ酸による調製に於てｗ
ａｇｎｅｒ等による独創的な仕事では（１）濃縮処置が
行われる間第■因子の分解を減少させるために、そして
（２）凍結乾燥と還元後にも長期間の安定性を増すため
に、水酸化アルミニウムを使用した。

「血友病」、Ｋ， Ｍ． Ｂ ｒｉｎｋｈｏｕｓ編、イ
ンターナショナルシンホシウム、ワシントンＤ．Ｃ．、
ノースカロライナ大学出版、第８１頁（１９６４年）参
照。

しかしながら、極微量のアルミニウムの介在は臨床上で
は危険であると考えられた。

凍結沈澱法（ ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
）の出現と比較的高力師の濃縮物の一段調製法とが、明
らかに、プロトロンビン・コンプレックスを除去スるた
めのいかなる手段の使用をも不要にした。

Ｐｏｏｌ等著「ネイチャーＮａｔｕｒｅ Ｊ第２０３巻
、第３１２頁（１９６４年）参照。

しかしながら、実際には、ＡＨＦの収率には、報告され
ている平均値の５０％に至る、時には５０％を超える高
い変動性が存在することが見出された。

従って、本発明の１つの目的は抗血友病因子（ＡＨＦ、
第■因子）を濃縮する改良法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は血漿および血漿分屑から得ら
れるＡＨＦの収率の改良法を提供することである。

本発明の他の目的と利益は、本発明に関する以下の説明
を読んだ当業者には明白であろう。

要約すれば、本発明では、血漿又は血漿分屑を含有して
いる水性溶媒にヘパリンを添加し、次に分別してＡＨＦ
濃縮物を得る。

本発明は次の図の参照によって、よりよく理解されると
思われる。

該図は凝血機序をあらわす模式図である。

ローマ数字はいくつかの凝血因子をあらわしている。

しかしながら該模式図が現在の知識に基づく作用仮説だ
けをあらわしていること、そして発明者がこの仮説の制
限を受けない即ち、この仮説に拘束されていないことは
理解されよう。

上記のように、ＡＨＦの実際の調製ではＡＨＦ収率に高
い変動性が見られた。

濃縮工程が長時間になるにつれて、ＡＨＦ収率が低下す
る。

収率の損失は綿密に注意して血球を除去することによっ
てある程度は軽減される。

これらの結果は前記凝血模式図の参照によって説明され
得る。

特に注目すべきものは破線であらわされたフィードバッ
ク機序であって、この破線は第Ｖ因子（グロアクセレリ
ンと第■因子（ＡＨＦ）に対する第■ａ因子（トロンビ
ン）の作用を示している。

作用は二つの部分から成る。

即ち、第■因子と第Ｖ因子の作用は（１）まず互変三次
構造によって増大し、続いて（２）循環困難をひきおこ
す過度の凝血を抑制するために減少する。

凝血模式図によれば、因子■、■、Ｘ，ＩＸ（７”ロト
ロンビン・コンプレックス）ヲ除去すれば、ＩＩａを生
成するべき第■因子が存在しな《なるので、フィードバ
ック機序が排除されることが明白である。

無細胞血漿を使用すれば濃縮によって調製されるＡＨＦ
の収率を増加し得るという本発明者らによる観察も、凝
血模式図によって説明し得るが、その場合にはトロンボ
プラスチンが生成されないので、従って凝血がはじまら
ない。

本発明によると製造規模量ではＡＨＦの収率は分別中に
ヘパリンを添加することによって増大され得ることが見
出された。

ヘパリンを使用しない先行技術と対照的に、ヘパリンを
使用した場合には、（１）分別法から起るような細胞混
入が収率低下をひきおこすこともな《、（２）静脈内投
与時に起るような組織混入が収率低下をひきおこすこと
もな《、（３）工程時間の延長が収率を減少させること
もなく、そして（４）還元された時の安定性がヘハリン
を添加しない濃縮血漿の少くとも３０倍程度に増加する
、ということが発明者らによって観察された。

従って、本発明の実施に於では、濃縮第■因子の安定性
を得るためにプロトロンビン・コンプレックスを除去す
る必要はなく、また細胞混入および組織混入或は工程時
間の延長などを原因とした通常の収率減少が起こりやす
いという問題も解決する。

本発明の実施に於で、ＡＨＦ分別中に使用されるヘパリ
ンの量は適当な範囲内で変動し得る。

血漿溶液或は血漿分屑ＩＩ７２ｌ当りヘパリン約１単位
の濃度が最適であることがわかった。

約１０単位／ｍｌ以上の濃度は不必要であり、危険でも
あるので避けるべきである。

約０．０１単位／ＴＬｌの濃度も有効である。

好ましい範囲は約０．０１単位から約１０単位／１ｒＬ
ｌである。

ヘハリン１単位は比処ではＩＵ，ｓ．ｐ．単位（米国薬
局方単位）の意味である。

ヘパリンのＩＵ．Ｓ．Ｐ．単位は、ＣａＣｌ２溶液（１
：１ ０ ０ ） ０．２１ｎｌ添加後１時間の間、ク
エン酸塩添加羊血漿１，Ｏｍｌを凝血させない量である
。

比処で使用されている「ヘパリン」という用語はヘパリ
ンのナトリウム塩をも含んでいる、ヘパリンのナトリウ
ム塩は水溶性であるので好ましい。

比処で定義される発明は、濃縮ＡＨＦを調製する種々の
方法に於て有効であり、プロトロンビン・コンプレック
ス因子のいずれかと混合しているＡＨＦを含むいかなる
血漿或は血漿分屑にも適用し得る。

従って、本発明は次のようなＡＨＦ分別法に適用された
。

即ち、（１）グリシン沈澱による血漿からのＡＨＦ分別
法、（２）グリシン沈澱による凍結沈澱物からのＡＨＦ
分別法、（３）ポリエチレングリコール沈澱による凍結
沈澱物からのＡＨＦ分別法、（４）ポリエチレングリコ
ール及びグリシン沈澱による凍結沈澱物からのＡＨＦ分
別法、（５）凍結沈澱物からのＡＨＦ分別法、（６）血
漿からのＡＨＦ分別法、および（７）ポリエチレングリ
コール及びグリシン沈澱後［エクテオラセルロース］ク
ロマトグラフにかけた凍結沈澱物からのＡＨＦ分別法。

本発明の適用に好ましいＡＨＦ調整法は米国特許第３６
３１０１８に記載されている方法であって、この方法に
よれば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とグリシン
とが濃縮ＡＨＦの凍結沈澱物を分別する目的で使用され
る。

すなわち、前記特許の実施例４に於ては、凍結沈澱物を
グリシンクエン酸塩食塩水に溶解する工程に於て該溶液
１ｍｌ当り約１単位のヘパリンを添加する。

１０％ポリエチレングリコールによる沈澱に続いて、１
０％ポリエチレングリコールを使用した分別の工程で失
なわれるヘパリンを補う為にこの沈澱溶液に、この溶液
ＩＴｒＬｌ当りにヘパリン約１単位が含有するように処
理を加える。

ヘパリンは、便宜上、それぞれの沈澱物を溶解するため
に使用するクエン酸塩食塩水或はグリシンクエン酸塩食
塩水と混合して添加してもよい。

次の実施例が本発明をより明確にすると思われるが、勿
論本発明はこれらの特定の実施例に限定？れるものでは
ない。

実施例 １ 高力画の安定した人血ＡＨＦ濃縮物を次の方法で高収率
で調製する。

試薬 クエン酸塩食塩水−０． １ Ｍクエン酸ナトリウム溶
液１重量部を０．９％食塩水４重量部に添加グリシンク
エン酸塩食塩水一上記のように調製したクエン酸食塩水
に十分のグリシンを添加してグリシン０，ＩＭ溶液とす
る。

洗浄用緩衝液−０．５Ｍクエン酸ナトリウム溶液を０．
５ Ｍクエン酸でｐＨ６．８８に調整したクエン１ 酸緩衝液を蒸留水に対し、容量添加する。

１ ００ ヘハリンー米国薬局方グレードの物質を使用する（「リ
ポーヘピンＬｉｐｏ −Ｈｅｐｉｎ Ｊ−ヘパリンナト
リウム注射液、水性）。

酢酸−１．ＯＮ水溶液と０、ＩＮ水溶液とを調製する。

グリシン−１．３Ｍ水溶液と１．８Ｍ水溶液とを調製す
る。

方法 人血漿を供血センターから凍結した状態で（４℃以下で
）受入れる。

該血漿をファンダー薬缶にプールし、−２０°〜−４０
℃に維持しながら連続式或はパケット式によって遠心分
離する。

凍結沈澱物に、ヘパリン１単位／ＴＩＬｌグリシンクエ
ン酸塩食塩水を添加して、その量を出発血漿容量の１ 一量にする。

温環境（通常の室温、３０℃以下１０ であること）に於て凍結沈澱物とグリシンクエン酸塩食
塩水とを攪拌して溶解させる。

凍結沈澱物溶液を０． Ｉ Ｎ酢酸でｐＨ６．５に調整
する。

ポリエチレングリコール４０００ （平均分子量約４０
００）をこの溶液に添加してＰＥＧ濃度を約３．５％に
する。

この混合物を室温で１０分間静かに攪拌して、次に５０
００ｒｐｍ．で１５分間遠心分離する。

上清を傾潟して０． Ｉ Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ
６．８８に調整する。

更に、ＰＥＧ４０００をこの溶液に添加して最終ＰＥＧ
濃度を約１０％にする。

この混合物を室温で３０分間静かに攪拌して５ ０ ０
０ ｒｐｍ．で１時間半遠心分離する。

上清を傾潟して棄てる。

沈澱物を冷水（２℃）で洗浄して、次に−４℃に於て５
０ ０ ０ ｒｐｍ．で５分間スピン洗浄を行う。

上清を傾潟して、沈澱物を１単位／ＴＬｌヘパリン含有
グリシンクエン酸塩食塩水中に再び溶解する。

また、この溶液の量は出発１ 血漿容量の約−である。

１０ この沈澱物溶液を０．ＩＮ酢酸でｌ）Ｈ６，８８に調整
して、１．８Ｍのグリシン水溶液で再沈澱させる。

この沈澱工程に於て十分なグリシンを添加してグリシン
の重量モル濃度が１．８の混合物を作る。

この混合物を２℃〜１０℃に於で４５〜６０分間静かに
攪拌して、次に連続式或はパケット式によって遠心分離
する。

前記の生成した沈澱物を採取して洗浄用緩衝液で静かに
洗浄してクエン酸塩食塩水中に再溶解する。

２９３朋ミリポアフィルターを使用してこの溶液をろ過
する（使用フィルター膜＝１．２ミクロン、０．４５ミ
クロン、０．３ミクロン）。

この生成した液体を、次にシエルフリージング（−６０
℃）によって凍結させて、少くとも３時間フラッシュフ
リーザー（−２０℃〜−３０℃）内に貯蔵する。

最初の凍結沈澱物を溶解する目的で、或は１０％ＰＥＧ
による分別によって得られた沈澱物を溶解する目的で、
或は分別工程中に於て、使用するグリシンクエン酸食塩
水に、ヘパリンを添加することなく、前記の方法を繰返
す。

ヘパリンを添加した場合とヘパリンを添加しなかった場
合との、両方について上記の方法を繰返す。

次の表はこれらの４つの分別実験に於ける結果を示して
いる。

表には、ヘパリン添加の場合の最終ＡＨＦ収率が１７％
であって一方、ヘハリンを添加しない場合の前記収率が
平均１２．５〜１３．６％であることが示されている。

従ってヘハリンの添加かへペリンを添加しない方法の２
５〜３５％だけ収率を増加させている。

最終ＡＨＦ収率を凍結沈澱ＡＨＦ収率で割ると、この工
程の効率はヘパリンを添加しない場合の３８％と３９％
からヘパリン添加の場合の４９％と５２％にまで改良さ
れていることがわかる。

上記の実施例に於て、ＰＥＧ６０００を等量のＰＥＧ４
０００に置換した場合にも、実質的に同様の結果が得ら
れる。

実施例 ２ 実施例１の方法を、最初の凍結沈澱物をヘパリン添加お
よびヘパリン無添加のグリシンクエン酸塩食塩水中に再
び懸濁させる工程まで繰返す。

これらの二種の凍結沈澱ＡＨＦ濃縮物の最終ＡＨＦ収率
はヘパリン無添加の場合は３４％であり、ヘハリン添加
の場合は４１％である。

これは２１％の増収率に相当する。

実施例 ３ 実施例２の工程の繰返しであるが、相違点はヘパリン添
加の凍結沈澱濃縮物と、ヘパリン無添加の凍結沈澱濃縮
物との各々を、凍結乾燥してから水によつで還元させて
次に室温（約２５℃）に２４時間放置することにある。

ヘパリン添加の試料が放置前の最初のＡＨＦＯ力両の９
８％が残留しているのに対してヘパリン無添加試料は最
初のＡＨＦ の力師の７２％しか残留していない。

実施例 ４ ３種の市販の濃縮物を用いて分別後の最終ＡＨＦ に於
ける総ＡＨＦに対する活性ＡＨＦＯ比を測定した。

ここで、活性ＡＨＦ とは凝血活性を有するＡＨＦ を
指し、総ＡＨＦ とは活性ＡＨＦ”と凝血活性のない不
活性ＡＨＦ とを合わせたＡＨＦを指す。

試 料 比 ＣｕｔｔｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉ ｎｃ （
ヘパリン無添加） ０゜１６〜０゜１８Ｔｒａｖｅｎ
Ｏｌ（ヘパリン添加） ０．２９ 〜０．４２Ｉｍｍ
ｕｎｏ （ヘパリン添加） ０．２８〜０．４２以上
の結果から、ヘパリンの添加により最終ＡＨＦに於ける
総ＡＨＦに対する活性ＡＨＦＯ比が１６０〜２６０％増
加することが知見された。

前記の明細書と特許請求の範囲を読んだ当業者には、本
発明の精神と範囲を越えることなしに、他の種々の実施
例および前記実施例の変形が明白である。

そのような追加の実施例と変形はすべて特許請求の範囲
の範囲内に含まれる。

本発明の実施の態様を次に要約する。

（１）血漿分屑が凍結沈澱濃縮抗血友病因子である特許
請求の範囲に記載の方法。

（２）血漿分屑がポリエチレングリコールとグリシンに
よって更に分別される凍結沈澱濃縮抗血友病因子である
、特許請求の範囲に記載の方法。

（３）前記ポリエチレングリコールの平均分子量が約４
０００である、前項（２）に記載の方法。

（４）凍結沈澱濃縮物を３〜４％ポリエチレングリコー
ルで沈澱させて、次に、その上清を１０％ポリエチレン
グリコールで沈澱させて、更にその上清をグリシンで分
別する、前＊２）に記載の方法。

（５）前記ポリエチレングリコールの平均分子量が約４
０００である、前項（４）に記載の方法。

（６）前記グリシンが約１．８Ｍである、前項（４）に
言［載の方法。

（７）前記ポリエチレングリコールの平均分子量が約４
０００であり、前記グリシンが約１．８Ｍてある、前項
（４）に記載の方法。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 血漿凍結沈澱物或は血漿凍結沈澱物分屑にその溶液
   １ ｍｌにつき０．０１〜１０単位のヘパリンを添加す
   ることから成る、血漿凍結沈澱物および血漿凍結沈澱物
   分屑から得られる抗血友病因子の収率改良法。