JPS5968673A - 親和反応の定量測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生特異的親和反応　（ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ
ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　）の定量測定法
、特に指標となるグループ（ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｇ
ｒｏｕｐ　）によって標識を付された免疫化合物（ｉｍ
ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　）を使
用する溶液中ｔこおける免疫反応（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
−ｉｃａｌ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　）の定量測定法＋ｒ−
関する。

この種の反応においては、標識を付された化合物がこの
化合物ｔこ対して特異な親和性を示す免疫化学的対応物
質と反応して複合体ないし錯体　（ｃｏｍｐｌｅｘ　）
を形成するときｅこ、標識の指示パラメータが影響され
るので、これ１こよって生特異的親和反応または免疫化
学的錯体における標識をイ」された化合物の量を測定す
ることができる。この場合遊離した化合物と生特異的ｅ
こ結合された標識付きの化合物とを分離する必要はない
。

なお、免疫化合物とは特に、抗原（ａｎｔｉｇｅｎ　）
、ハプテン（ｈａｐｔｅｎ　）および例えばＦａｂ　（
抗原結合片）またはＦｃ　　（結晶化断片）を含む免疫
グロブリンである。

非放射性標識ないしマーカー（ｍａｒｋｅｒ）を用いた
免疫定量測定法が最近ｌＯ生年間こ開発されてきた。こ
の研究における最も重要な進歩の一つは均一免疫分析シ
ステム（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｉｍｍｕｎｏａｎａ
−１ｙｔｉｃａｌ　ｓｙｓｔｅｍｓ　）であるが、これ
はルピンシュタイン（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ　）とその
共同研究者によって分離工程を全く要しない測定方法と
して定−されている（参照＝　　（１９７２）　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｏｏｍ、　４７．８４６−８５１　）　。分離工程をな
くすことができるので、誤差の原因の一つを除くことが
できるとともに、分析操作が容易となりその自動化に役
立つ。

従って１均一免疫分析とは、抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ　
）と配位子（ｌｉｇａｎｄ　）　　（ハプテンおよび抗
原）の間の反応およびこれらの反応の程度の測定が均一
な溶液中で行なわれるシステムを意味する。標識の特性
が抗体と配位子の間の反応によって影響されるならば、
［遊離した（ｆｒｅｅ）Ｊ化合物と「抗体と結合した」
化合物を分離しなくてすむ。

原則として、二種の均一免疫分析システムが開発されて
いる。反応はＮ識の物理的特性ｔこ影響を与えるか、あ
るいは標識を介して後で起る生物学的活動ｔこ影響を与
える。はとんどの均一免疫分析システムをこおいては、
標識付きの配位子（Ｌ、ｇ　−Ｍ）が用いられる。この
配位子は特定の抗体（Ａｂ　）および定量されるべき未
知の配位子（Ｌｇ）と反応するＯ Ｌｇ十Ａｂ十Ｌｇ−Ｍ　；：＝Ａｂ　−Ｌｇ−Ｍ＋Ａｂ
　−Ｌｇ通常信号　　　　　　修飾された信号 抗体が標識の付された配位子と結合すると、分析に用い
られる信号が修飾される。

この種の系においては、測定された信号の強度を試料中
の配位子の未知の濃度ｔこ直接関係させることができる
。配位子に標識を付するのＱご用いられ、かつ、抗体と
の反応後変化した物理的環境のために修飾された信号を
発生する免疫化学的標識としては、遊離基（参照：　Ｌ
ｅｕｔｅほか、（１９’ｉ’２　）ＪＡＭＡ　２２１．
１２３１−１２３４　）　、螢光分子（参照：　Ｕｌｌ
ｍａｎほか、（１９７６）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｏｈｅ
ｍ、　２７．４１７２−４１７８　）、および化学発光
分子（参照：　ＫＯｈｅｎほか、（１９７９）ＦＥＢＳ
　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１０４．２０１−２０５　）などが
ある。

比較的多くの均一螢光分光免疫分析法が開発されている
。これらすべての分析法は生特異的親和反応が何らかの
方法で標識の物理特性に作用し、これによって信号の変
化を記録できるという事実１こ基づいている。螢光分光
により記録されるこの信号の変化としては、例えば消光
（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ　）、分極の変化、励起酒移ある
いは保護などがある。

均−系において突施することかできる螢光免疫分析法で
現在知られている方法ｔこついて優れた概観を与える包
括的な調査が最近公表された（参照：Ｓｍ１ｔｈほか（
１９８１）　Ａｎｎ、　Ｃ１１ｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｒｎ
、　１８．２５３−２７４、　Ｕｌｌｍａｎ（１９８１
）　Ｉ螢光免疫分析技術における最近の進歩」）。

上述の文献は、不均一および均一螢光免疫分析法のいず
れにも胛せられている制限、すなわち、従来のすべての
螢光標識および螢光分光分析にみられる高いパックグフ
ウンド螢光についても記述している。これが螢光分析法
の発展に対する最大の制限となっている。

本発明は、時間分割螢光法（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅ
ｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）の利点と生特異的親和反
応、特に免疫反応ｔこみられる均一分析法の原理とを結
びつけた方法を提供したものである。

以下本発明の二つの実施例を詳細ｔこ説明する。

時間分割螢光法においては、螢光標誠は継続時間の短い
パルス状の光のインパルスによって励起され、螢光は励
起パルスから一定時間が経過するまでは検出されない。

励起から検出までの間に、干渉源からの螢光は減衰する
ので、分析のために使用できる標識からの信号のみが検
出される。

この標識はできるだけ強い螢光と、比較的長い発光波長
と、大きいストークスシフトと、標識の抗原、ハプテン
、抗体ｅこ対する共有結合を可能Ｅこする化学構造とを
備えている必要がある。このような要件を満足させる螢
光標品は、スウェーデン国特「１願第’７９０２０７９
−８号に開示されており。

ランタニド（１ａｎｔｈａｎｉｄｅ　）と芳香族β−ジ
ケトン（ａｒｏｍａｔｉｃβ−ｄｌｋｅｔｏｎｅ　）　
　とからなるランタニドキレート　（１ａ、ｎｔｈａｎ
ｉｄｅ　ｃｂｅｌａｔｅ　）であり、このランタニドは
ＥＤＴＡ類似体を介して抗原、ハブテンまたは抗体と結
合し、これによって螢光を発生するランタニドキレート
複合体が形成される。

標識の螢光持続時間は５０〜１０００μｓｅ’ｃで時間
分割検出原理ｔこ４徹めて適したものである。標識から
の螢光は、この標識が抗原、ハプテンまたは抗体と結合
したとぎに測定することができる。あるいはランタニド
を任意の適当な条件下でこれらの物質から分離すること
ができ、螢光は芳香族β−ジケトンおよび協同作用する
トリオクチ〜ホスフィンオキザイド（ｔｒｉｏｃｔ、ｙ
ｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ　ｏｘｉｄｅ　）のような化合物
の存在下で溶液中をこ発生される。この後者の方法は特
願昭筒５７−０”７２４８０号（スウェーデン国特８’
ｒ願第８１０２７５３−４号）に開示されている。

ヲンタニ予キレートが発螢光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ
ｅｓ　）として使用される事実に基づく時間分割螢光法
１こおいて、螢光の強度とその寿命ないし持続時間はキ
レ−１，すなわち、標識を付された配位子の性質に完全
ンこ依存する。溶液中のランタニドイオンは非常ｔこ弱
い螢光強度を有し、その強度はこのイオンの電子配置　
（ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｏｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）　
ｌこ依存する。ランタニド中でユーロピウムおよびテル
ビウム（ｔｅｒｂｉｕｍ　）が最も好ま１７い配置を有
する。

螢光が金属イオンから発せられるという事実（こもかか
わらず、この過程に関与する有機配位子が非常に重要な
機能を有していることが明らかにされている（参照：　
０ｒｏｓｂｙほか、（１９６１）　Ｊ、Ｃ！ｈｅｍ。

Ｐｈｙｓ、　３４．７４３；　０ｒｏｓｂｙほか、（１
９６２）　Ｊ、Ｐｈｙｓ。

Ｃｈｅｍ、　６６、４９３　）　ｏ　例えば、ランタニ
ド−β−ジケトンキレート　（Ｍ（β−ジケトン）５）
は非常に強力な螢光を発生する。その強さと持続時間は
キレート中ｔこ存在するβ−ジケトンとその周囲の溶液
の成分に依存する（参照：　Ｆｌｌｌｐｅｓｏｕほか、
（］−９６４）Ｊ、　ＰｈｙＳ、　Ｃｈｅｍ、　６Ｂ、
　３２４　ｉ　５ｉｎｈａ　（１９６６）　ｒ希土類の
複合体Ｊ　Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　、ニューヨ
ーク）。

キレート化されたときランタニドイオンが螢光を発生す
るためには、少なくとも次の条件が満たされる必要があ
る。

１、有機配位子が励起されること。適当な電子軌道（π
）を有する配位子がエネルギー（光子）を吸収し、−重
項基底状態（ｓｉｎｇｌｅｔ　ｇｒｏｕｎｄ　５ｔａｔ
ｅ）から第一の励起−重項状態における振動レベルの一
つにまで励起されること。

２、配位子中でエネルギー遷移が行なわれること。

このエネルギーは配位子中で一つの励起された一重項状
態から励起された三重項状態　（ｊ；ｒｉｐｌｅｔｓｔ
ａｔｅ）ｔこ遷移される。

３、ランタニドキレート内ｔこ分子内エネルギー遷移の
ための条件が存在すること。エネルギーは配位子の励起
された三重項状態からランタニドイオンの共鳴準位にま
で遷移される。この遷移を行なわせ、ランタニドｅこ強
力な螢光特性をもたせるために、ランタニドイオンの共
鳴準位の少なくとも一つが、励起された配位子のエネル
ギー準位よりもいくぶん低いエネルギー準位ｅこある必
要がある。

さらに、配位子の励起された三重項状態は比較的長い持
続時間を有しなければならない。

４、発光はランタニドイオンから発生すること。

金属イオンが低いエネルギー準位に復帰し、そのときエ
ネルギーが光子の形で放射される。ランクニドキレート
の発光スペクトルはランタニドイオンの特性を呈してい
るが、配位子およびこれをとりまく環境は螢光の他の物
理的性質に影響を与える０ 既述の均一免疫分析ｔこおいては、生特異的親和反応が
「遊離した」成分と「抗体ｔこ結合した」成分とを分離
せずｔこ溶液中で行なわれ、例えば標識の物理的性質が
抗体と配位子の間の反応によって影−を受ける。

本発明をこおいては、この均一分析原理がランタニドキ
レートを標識とする時間分割螢光法の利点と組み合わさ
れている。均一分析法においては、標識を付された化合
物（抗原、ハプテン、抗体または生特異的親和反応にお
ける反応性成分）が例えば抗体中の生特異的中心（ｂｉ
ｏｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｅｎｔｅｒ　）と結合する。こ
れによって標識を付された成分をとりまく化学的環境が
変化する。

もし、標識がランタニドキレ−１・からなるものであれ
ば、抗体または生特異的分子との結合は、励起されたエ
ネルギーの吸収、遷移および放出に関与する要因のうち
の一つまたはいくつかｅこ影響を与えることｅこよって
ランタニドイオンのまわりの配位平場（１’ｉｇａｎｄ
　ｆｉｅｌｄ）　ｆこ影響を与える公算が大である。

ランタニドキレートで標識された抗原の特定の抗体との
結合が、時間分割螢光法によって記録された物理的螢光
信号の下記の変化を均一分析に利用可能ならしめる。

１、抗体との結合がランタニドイオンのまわりの配位平
場の特性に影響を与えるというｌ＄実によって、時間分
解された螢光の強度が変化する。

このことは、測定信号の強度が上記変化によって増大ま
たは減少することを意味する。

２、時間分割螢光の半減期（減衰時間）の変化。

この変化を強度の変化に結合させることができる。ある
いは、量子数Ｊｉ　（ｑｕａｎｔｕｍ　ｙｉｅｌｄ　）
が不変のままで半減期に影響を与えることができる。

半減期は配位平場の変化に応じて、増減させることがで
きる。

３、抗原をこ結合したランタニドイオンのまわりのエネ
ルギー吸収配位平場の形成の抑制（１ｎｈｉｂｉｔｉｏ
ｎ　）。

もしランタニドイオンが螢光ｅこ必要な励起エネルギー
を吸収することができないキレートを介して抗原に結合
されているが、均−分析系が例えばβ−ジケトンがエネ
ルギー吸収ｅこ必要なランタニドイオンのまわりの配位
平場を形成しうろことを要求すると、抗体と抗原の間の
結合がこの配位平場の形成を阻止する。

本発明によれば、前述の原理が均−生特異的親和尺応ｅ
こ用いられる。

次ｅこ本発明の詳細な説明するが本発明はこれらの実施
例ｔこ限定されるものではない。

実施例１ 螢光の半減期（減衰時間）の変化の測定によるインシュ
リンの均一免疫測定。

アミノフェニル−ＥＤＴＡ　−Ｅｕ　（ａｍｉｎｏｐｈ
ｅｎｙｌ−ＥＤＴＡ　−Ｅｕ　）　　とインシュリンを
共役結合さぜることｔＣよりユーロピウムで標識された
インシュリンを得た。このＥｕ−キレートを最初ｅこイ
ンチオシアネート誘導体（１ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔ
ｅ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ　）に変え、これを共役結合
枦こ使用した。インシュリンコ１．４〜を０．５ｇ／の
０．ＩＭホウ酸緩衝液ｐｌ＋９．３に溶解した。続いて
アミノフエニＡ／　−ＥＤＴＡ　−Ｅｕのインチオシア
ネート誘導体の当只の２倍を添加し、室温で一晩反応さ
せた。

ゲル（セファデックス：　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５
）ろ過によって標識を付されたインシュリンから遊離標
識を分間した。共役結合の度合は、既知の濃度のＥｕ溶
液と共役結合物の螢光の強度を比較することｔこより０
．５　Ｅｕ／インシュリン分子の割合とした。

免疫分析はポリスチレンチューブ（１２Ｘ５５ｕ）に次
の成分を添１１１１　して行なった。すなわち、１０μ
４の抗インシュリン血清（１→２０希釈）、標識を付さ
れた１０μｌのインシュリン（２０ｎｇ　）　、　０．
５％のＢＳＡと０．０５％の牛のＩｇＧと５０μＭのＤ
ＴＰＡとを含む７０μｅの０．０５　Ｍ　）リス塩酸緩
衝液ｐＨ７，７・１　（”１μ４の標準インシュリン（
０，１０，５０１２００，１０００，１００００ｎｆ）
　、および０．０５Ｍ）リス塩市拶衝液（ｐＨｅ、ｏ　
）中ｔこ２０μＭβ−ＮＴＡと１００１ｚ１００１ｚと
０．３％Ｆウイーｙ　２０　　（Ｔｗｅｅｎ　２０　）
と０．１５Ｍ　Ｎａ１ｌ　とを含む溶液１．０ｇ／をピ
ペットで加えた。

試料な：５７Ｃｔこ４時間維持し、続いて６試Ｆ１の螢
光を励起復興ツタ時１１］（１００，２００，３００，
４００，４８０および６００μｓｅｃ　）経過後１０μ
ｓｅａ間測定した。その結果を表１（こ示す。

表１　励起復員なる経過時間で測定した標準インシュリ
ンの螢光強度 （μ５ｅｃ）　　　０　　１０　　５０　２００　１０
００１００００１００　　　’１１３７４１３３６４．
１７８５０１９３８５２２１２２２６１７２±１１２±
１２３±１３２±１５０±１５７±２４０２００　　９
８５０１１５７８１５６０２１７０１０１９６１３２２
８９２±９６±９６±１０２±１３６±８８±１４４３
００　　８４４１１０２２５１３６３０１４Ｂ’７１１
６７４６１９８４６±１３０±１３’７±１４６±１７
６±２３８±１５２４００　　７５１８　　Ｆ３Ｂ２５
１２０１３１２７０２１．４８１９１７５５７±１２０
±１１９±９６±１２０±１７９±２４１４８０　　　
’ｉ’０３９．　８３７６１１０７８１２０４２１３９
４０１６３３０±１２３±１４５±１１２±１２８±８
３±２１１６００　　５８４７　６９１４　９０３０　
９７６８１１４５８１３８８８±１０４±１７４±２６
４±１３４±ＬＬＯ±８８信号の強度の変化は一次反応
の動力学ｅこ従うので、使用したインシュリン濃度ｔこ
対する螢光強度の半減期が測定された。螢光強度はイン
シュリンのｂｌの多い場合よりも少ない鴨合の方が早く
減少した。

第１図に示す標準曲線を描くのｔこ８１算された半減期
を用いた。第１図ｅこおいて、縦軸は半減期をマイクロ
秒（μ５ｅｃ）で示し、横軸はインシュリンの量をナノ
グラムで示す。

実施例２ 抗体と結合した標識付きインシュリンのまわりにおける
エネルギー吸収配位平場の形成抑制の測定（こよるイン
シュリンの均質免疫測定。

ユーロピウムで標識されたインシュリンを図１に示す方
法によって生成した。免疫分析測定をポリスチレンチュ
ーブ（１２Ｘ　５５　朋）で行なった。

すなわち、このチューブをこ０．５％ＢＳＡと５０ＩＩ
ＭＤＴＰＡとを含む７０μ４の０．０５Ｍ）リス塩酸緩
衝液ｐＨ’７．７．１０　ｐｌ　ノ抗インシュリン血清
　（１→２０希釈）、１０μ４の標識を付されたインシ
ュリン（２０ｎｇ）　、　１ｏｔｔｌの標準インシュリ
ン（ＯＳｌｏ。

ＴＯＰＯと０．３１％トウイーｙ２０と０．１５　Ｍ　
Ｎａ１ｌ　　とを含む溶液１．０ｍ＋／をピペットで加
えた。チューブを３７℃（こ４時間維持し、続いて各試
料（こ対する時間分割螢光を励起後５０／１ｓｅｃｔこ
２５０　ｔｔｓｅｃ測定した。

測定によれば、「冷（ｃｏｌｄ　）　Ｊインシュリンの
量が増加する１こつれで試料の螢光強度は減少する。

測定結果を第２図に示す。この図ｔこおいて縦軸は抑制
をパーセントで、また横軸はインシュリンの量をナノグ
ラムで、それぞれ示す。

以下、本発明の諸態様を要約して示すが、本発明はこれ
ｔこ限られないこともちろんである。

（１）生竹異的親和性反応、特ｔこ指示グループによっ
て標識を付けられた免疫化学化合物が、この化合物に対
して特異的親和性を示す免疫化学的対応物質と反応して
錯体を形成するとき、前記グループの指示パラメータが
影響される溶液中の免疫反応ｔこおいて、少時異的ｔこ
結合した標識付き化合物とｍ　熱化合物とを分離する必
要なく、前記親和性反応または免疫化学的錯体に存在す
る標識を付けられた化合物の貝を測定する方法をこおい
て、前記指示グループが時間分解された螢光ｅこよって
示されるランタニドキレートからなり、前記指示パラメ
ータが前記螢光の強度もしくは半減期またはこれら両者
である親和性反応の定量測定方法。

（２）形成された錯体が、標識を付されたグループのま
わりのエネルギー吸収配位平場の形成を阻止すること（
こよって前記螢光を消光（ｑｕｅｎｃｈ　）するもので
あるは）項の方法。

（３）ランタニドがユーロピウムからなるｆｉｌ　ＩＪ
の方法。

（４）ランタニドがテルビウムからなる（１）項の方法
。

（５）ランタニドキレートの配位平場がβ−ジケトンも
しくは共力作用する化合物例えばトリオクチルホスフィ
ンオキサイドまたはこれらの混合物によって形成される
（１）項の方法。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図はそれぞれ本発明の第１および第２
の実施例の説明用グラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 指標となるグループによって標識を付けられた免疫化合
   物がこの化合物に対して特異的親和力をもつ免疫対応物
   質と反応して複合体を形成するとぎ、前記標識の指示パ
   ラメータが変化する免疫反応ｔこおいて、生特異的ｔこ
   結合した標識付き化合物と′Ｍ離した化合物とを分離す
   る必要なく前記反応または免疫化学複合体に存在する前
   記標識付き化合物の屓を測定する方法において、 前記指標となるグループが時間分割された螢光１こよっ
   て指示されるフンタニドキレートからなり１前記指示パ
   ヲメータが前記螢光の強度もしくは半減期またはこれら
   両者であることを特徴とする親和反応の定量測定方法。