JPS5982097A - 固定化酵素法による６−アミノペニシラン酸の改良製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 定化酵素法による６−アミノベニクラン酸（６−ＡＰＡ
　）の製造法に関する。

従来、ＰｃＧから６　−　ＡＰＡ　全製造する方法とし
ては、化学的脱アシル化法ならびに酪素的脱アシル化法
が種々報告さ几ている。化学的脱アシル化法としては、
脱水乾燥し’ｉＰｅＧルペニシリン全エステル基により
保護し、絖いてイミノクロライド化、さらにイミノエー
テル化した後、加水分解する方法が用いら几ているが、
その工程の煩雑さのみならず、６−ＡＰＡが医薬品製造
のための中間体であることから、不純物の混入の点で問
題があった。

一方、酵素的脱アシル化法においては、最近ペニシリン
アシラーゼを固定化した固定化ペニシリンアシラーゼを
用いる方法が、ペニシリンアシラーゼの連続使用ならび
に酵素反応の連続化が可能となり、製造コストの面で工
業化が可能となったが、固定化ペニシリンアシラーゼの
酵素活性の失活の防止、それに併なう連続使用回数の向
上による製造コストの低減が計ら几でいる。

ところで、６−ＡＰＡ製造コストの低減の成否のもう一
つの大きな要素であるＰｃＧは、通常ＰｃＧ醗酵プロス
からナトリウム塩またはカリウム塩とＬ７て単離、精製
さｆした市販の工業用原料バルクの形で使用さｎて来た
ｏしかしながら、該醗酵プロスからＰａＧを抽出および
転溶金繰り返し、塩形成しで単離、精製、乾燥する工程
はＰｃＧの製造コストの面で相当大きい要素となってお
り、酵素的脱アシル化法においては、上記の工業用原料
バルクに再度水溶液に溶液化して使用ｊ　ｒＬることか
ら、Ｆ。

Ｇｉａｅｏｂｂｅらは該醗酵プロスを有機溶媒で抽出し
た抽出液を水性媒体に転溶した粗ＰｃＧ水溶’１ｆｆｌ
ｋ用い、膠醗酵ブロスからＰａＧを裸地するのに塩形成
、単離、精製、乾燥する工程を省略することにより製造
コストの低減を計ること全目的として、固定化酵素法に
よる６　−ＡＰＡの製造が試みら几た（　Ｂｒ＋ｚ声ｅ
Ｅｎｇｉｎｎａｒｌｎｇ、Ｖｏｌ、　４　、２４５〜２
５２　、　Ｐｌａｎｌｌｕｍ　Ｐｒｅｓｓ。

１９７８　　）　　。

このＧｉａｅｏｂｂｅ法では、６−　ＡＰＡの製造コス
トが従来の市販の工業用バルク音用いる方法より低減ζ
′ｎ−たが、醗酵プロスから得たＰｃＧの水性抽出液と
実質的に純粋なＰｅＧ　ｆ交互に使用しており、醗酵プ
ロスから得た水性抽出液のみヲ使用した方法ではない。

しかも使用［７た固定化ペニシリンアシラーゼの酵素活
性が、従来の固定化酵素法による６　−ＡＰＡの製造法
より烙らに低下するために、固定化酵素の連続使用回数
が低減するという欠点があり、現在のところ醗酵プロス
から得たＰｅＧの水性抽出液のみを用いて工業的に固定
化酵素法により、６　　ＡＰＡを製造することは不可能
である。

そこで、本発明者らは、上記の欠点全解決すべく種々研
究を続けた結果、ＰｃＧ旅酵ブロスを有機　３− 溶媒で抽出した抽出液を酸性水溶液に転溶した粗ＰｅＧ
水溶液を分子量５０００以上の限外濾過処理し、得ら；
ｎ、７（処理液に固定化ペニシリンアンラーゼを作用さ
せて６−ＡＰＡ’ｉｆｉ造すると、ペニシリンアクラー
ゼ活性が低下することなく、長期間連続使用が可能とな
り、６−ＡＰＡの製造コストの低減に大きく寄与するこ
と金知った。

さらに、本発明者らは、ＰＣＧのナトリウム塩またはカ
リウム塩の市販工業用原料バルクがメーカーによりその
品質に著しい差異があり、純度の低いバルクの中にはベ
ニクリンアクラーゼ活性ヲ失活させる因子が存在するこ
とを知り、該バルクを使用して固定化酵素法に↓る６　
−ＡＰＡの製造を行うと、固定化ペニシリンアンラーゼ
の活性が低下することにより、著しく連続使用回数が低
下し、６−　ＡＰＡの製造コストが増悪することを知っ
た。

ところが、該バルクを水溶液としｆｃ後テ、前記と同様
に限外濾過処理した後、酵素反応を行わせると、ペニシ
リンアシラーゼ活性を低下させることなく、長期間連続
使用が可能となり、６−ＡＰＡの　４− 製造コストの低減に大きく寄与することを知った。

本発明は、これら上記の知見に基いて完成されたもので
あり、ＰｃＧに水性媒体中固定化ペニシリンアシラーゼ
を作用させて酵素的に６−　ＡＰＡを製造する方法にお
いて、粗製ＰｃＧまたにその水溶性塩の水性溶液を分子
量５０００以上の限外濾過処理を行い、得られた処理液
に固定化ベニ７リンアシラーゼを作用させることを特徴
とする６　−ＡＰＡの製造法であって、この発明の第一
の目的とするところは１．ＰｃＧ　’１７　ＰｃＧ醗酵
プロスから単離することなく水性抽出液の状態で固定化
酵素法による６−ＡＰＡの製造に使用し、しかもペニシ
リンアシラーゼ活性を低下させず、長期間連続使用可能
とし、そ１．によって６−　ＡＰＡの製造コス）ｋ低減
できる製造法全提供することにあり、第二の目的とする
ところは、市販の工業用ＰｅＧバルク全用いて固定化酵
素法による６　−ＡＰＡの製造において、該バルク中の
ペニシリンアクラーゼ活性を失活させる因子を除くこと
により、ペニシリンアクラーゼ活性を低下させず、長期
間連続使用可能とし、そｎによって６−　ＡＰＡの製造
コストを低減できる製造法を提供することにある。

水性有機溶媒、例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、メチル
インブチルケトン、ブタノールなどで抽出し、得らｎ２
抽出液からＰｃＧを水性媒体に転溶した水溶液の状態で
用いらｆる。該水溶液は、後に固定化ペニシリンアシラ
ーゼを作用させるのであるから、予め該ペニシリンアク
ラーゼの至適姐に調節さｎ、るべきである。

また、本発明において使用するＰｃＧは、市販の工業原
料用ＰｃＧカリウム塩またはナトリウム塩バルクを水性
媒体に溶解した水溶液の状態で用いらｎ、る。該水溶液
は前記と同様にペニシリンアシラーゼの至適姐に調節さ
几るべきである。上記バルクは、通常、上記で述べた有
機溶媒抽出と水性媒体への転溶を数回繰り返し、有機溶
媒の溶液中でカリウム塩またはナトリウム塩に塩形成さ
せ、そ几全単離、乾燥し、場合によりさらに精製さｎた
製品であるが、製造コストの面から実質的に純粋なＰｃ
Ｇ水溶性塩である必要はなく、ペニシリンアシラーゼ活
性全失活化させる因子、例えば本酵素と結合し易いよう
なポリペプチドまたは蛋白質の如き高分子物質を含有し
ているような純度の悪い粗製バルクでよい。

このようにペニシリンアシラーゼの至適声に調節さｆ′
したＰｃＧ水溶性塩の水溶液は、分子ｆｆｉ：　５００
０以上の高分子を濾過可能な限外濾過機に通さ几、限外
濾過処理さ几る。上記の限外濾過は公知の限外濾過膜を
用いる方法で行わｎるが、少なくとも分子量５０００以
上、３００００以下の高分子物質を除去すべきである。

上記の限外濾過処理により得ら扛た処理液に固定化ペニ
シリンアシラーゼと作用させることにより所望の６−　
ＡＰＡが製造さ１．る。

上記ペニシリンアシラーゼは微生物、特に細菌の生産す
るペニシリンアクラーゼが使用さｆる。

このようなペニシリンアクラーゼ生産菌は、例えばアク
チップラセス属、アースロバフタ−属、バ　７− チルス属、エルビニア属、エツクエリヒア属、フラボバ
クテリウム属、ミクロコツカス属、ミクロモノスポラ属
、ノカルディア属、プロテウス属、クユードモナス属、
セラチア属、ストレプトマイセス属などに属する微生物
である。その例としては、 Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ　ｕｔａｈｅｎｓｌｓ　　　
ＡＴＣＣ１４５３９Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｔｉｖ
ｎｅ＋＋ｃｅｎｓ　　　ＡＴＣＣ６９４７Ａｒｔｈｒｏ
ｈａｃｔｅｒ　ｖｉｓｃｏｓｕｇ　　　　ＡＴＣＣ１５
２９４Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｌｕｒｎ　　
　　ＡＴＣＣＩ　４９４５ＡＴＣＣ１４９４６ Ｂ−４００１ＲＭ−Ｐ７４８ Ｅｒｗｉｎｌａ　ｓｔｅｗｓｒｔｉｌ　　　　　ＡＴＣ
Ｃ１３５３１Ｅｓｄｈｅｒｉｃｈｌａ　ｃａｌｌ　　　
　　　ＡＴＣＩＣ９６３７ＡＴＣＣ１１１０５ ＡＴＣＣ１３５２９ ＭＣＩＢ８７４３ ＭＣＩＢ８７４３Ａ Ｆｌａｖｏｂａｅｔｅｒｉｕｍｓｕａｖｅｏｌｅｎｇ　
　ＡＴＣＣ１３５３３Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　’ｃａ
ｎｄｌｄｕｇ　　　　ＡＴＣＣ８４５６８− Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　　ｒｏｓｅｕ＋＋　　　　　
　　　　ＡＴＣＣ４１６Ｍｌｃｒｏｍｏｎｏｍｐｏｒａ
ｐｕｒｐｕｒｅｏｅｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　　　ＡＴＣ
Ｃ１３６３４ＮｏｃａｒｄＬａ　ｓｐ　　　　ＡＴＣＣ
１３６３５Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｒｅｔｔＩｒｅｒｌ　　　
　　　　　　　ＡＴＣＣ９２５０ＡＴＣＣ３１０５２ Ｐｓａｕｄｏｍｏｎａ＠ａａｒｕｇｉｎｏ＊ａ　　　　
　ＮＲＲＬＩｏｌ　４ＪＰｓｓｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｆ
ｌｕｏｒｅｇｃａｎｓ　　　　　ＮＲＲＬＢＩＯＰｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｌｌａ　　　　　Ａ
ＴＣＣ１７８０８Ｓｅｒｒａｔｉａ　　ｒｕｂｉｄａｅ
ａ　　　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ１８１Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｓｕｇ　　　　　　
　ＩＦＯ３３５５Ｓｔｒｅｐｔｏｒｒｒｙｃｅｓ　１ａ
ｖｅｎｄｕｌａｅ　　　　ＡＴＣＣ１３６６４ＡＴＣＣ
１３６６５ ＡＴＣＣ２１１３８ などが挙げらｎるが、特にバチルス属、エツシエリヒア
属に属するペニシリンアシラーゼ生産菌が好ましい。上
記のペニシリンアシラーゼはその微生物の種類により菌
体内酵素または菌体外酵素として産生さ几るが、これら
は公知の方法により培養物より採取される。菌体内酵素
の場合には、ペニシリンアクラーゼ全細胞から採取して
もよいし、細胞のま＼で使用してもよい。

上記ペニシリンアシラーゼの固定化は、酵素を固定化す
る公知の固定化酵素の製造法により行われる。例えば次
の方法が挙げらｎる。

細胞をセルローストリアセテートで包括する方法〔特開
和４７−３９６９４号、Ｊ、　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｅｓ
、　２Ｊ２２Ｂ（１９７３）　）、 細胞をポリアクリルアミドで包括する方法〔特開昭４９
−１１８８９２号、ＥｕｒｏｐｅａＪ　Ｊ、　Ａｐｐｌ
、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　。

互、　１５３　（１９７６）　）、 細胞をグリシジルメタアクリレート、Ｎ、ｄ−メチレン
ビスアクリルアミドおよびジメチルアミノプロピオニト
リルで包括する方法〔特開昭５３−６９８８８号〕、 細胞をエポキシポリマーで包括する方法（Ｂｉ。

ｔｅｃｈｎｏｌ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ、土、　１７１　（
１９７９）　］、酵素をアルキル化法によりＤＥＡＥセ
ルロースト共有結合させる方法［：　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｅｔａ、　、　２８４　。

２７８　（１９７２）　］、 酵素をサクシエル化し、ＤＥＡＥセファデックと吸着結
合する方法〔特開昭４７−２８１８７号〕、酵素をアク
リルアミド、Ｎ、Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミ
ドと無水マレイン酸のコポリマーと共有結合させる方法
〔特開昭４８−６１６９２号〕、酵素をグルタルアルデ
ヒドおよびヘキサメチレンジアミンによりアンバーライ
トＸＡＤ　−７と共有結合させる方法〔特開昭４９−５
０１８３号〕、酵素を臭化シアン活性化法により水溶性
フィコール（クヨ糖トエピクロロヒドリンとのコポリマ
ー）と共有結合させる方法〔特開昭４９−９３５８８号
〕、酵素を臭化シアン活性化法よりデキストランと共有
結合させる方法〔特開昭４９−１２５５８７２５５８７
号〕化シアン活性化法によりセファロ−ステロ、セファ
デックスＧ　−２００またはα−グルカンと共有結合さ
せる方法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎ＋ｃｙｍｅ、　
Ｖｏｌ。

４４　、７５９　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒａｓｓ、
　ＮｅｗＹｏｒｋ、　１９７６　］、酵素をグルタルア
ルデヒドによりアンバーライトＩＲＣ−５０と共有結合
させる方法〔特開昭５０−９５４７９号〕、 酵素をジイミドまｆｃはグルタルアルデヒドによ一員一 りグリシジルメタアクリレートとエチレンジメタアクリ
レートとのコポリマーと共有結合させる方法［Ｂｌｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ、　Ｅｉｏｅｎｇ、　、　２１　＊　１３
１７　（１９７９）　］、酵素をグルタルアルデヒドに
よす０ＭセルロースまたはアンバーライトＸＡＤ　７と
共有結合させる方法［Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌ、　Ｂｉｏ
ｅｎｇ、　、　２２　、７３５　（１９８０）　）、酵
素をグルタルアルデヒドにより部分的に゛ｒミノ化され
た多孔性ポリアクリロニトリルと共有結合させる方法〔
特開昭５５−４８３９２号、特開昭５５−３９７１２号
〕。

上記の固定化ペニシリンアシラーゼを水性媒体中ＰｃＧ
に作用させるのであるが、固定化酵素が水に不溶性であ
る場合には、バッチ法でもカラム法でも行うことができ
る。例えば、バッチ法による場合、ＰｃＧ溶液に固定化
酵素を懸濁させ、一定ｐＨに調節しつつ攪拌することに
より反応を進行させることができる。反応液から固定化
酵素を濾過または遠心分離することにより回収し、再度
これを反覆使用することができる。また、このバッチ法
を連続的に行なうこともできる。

１２− カラム法による場合は、固定化酵素をカラムに充填し、
このカラム内ＫＰｃＧ溶液を通過させるのであるが、こ
の場合、高流速でカラムを再循環させることが好捷しい
。即ち、一度のカラム通過による脱アシル化反応率を制
限することにより、生成するカルボン酸に基づ＜　ｐＨ
の極度の低下を抑えることができる。カラムを通過した
反応液は冷却して貯蔵槽に貯め、水酸化アルカリなどの
アルカリでｐＨを常に６．５〜９５に中和し、熱交換器
金倉して再びカラムに再循環させることにより、ＰＨ低
下による固定化酵素活性の劣化、ベニンリン分解の防止
に有効であり、且つ脱アシル化反応を促進させることが
できる。カラムは高流速による圧損失を最小にするため
、床のなるべく浅いものを適宜設計して使用するのが好
ましく、再循環は通常毎時１００〜３００床容積の流量
で行なわ几る。再循環はＰｅＧの９０チ以上が（ｉ　−
ＡＰＡに転換き几るまで続けるのが好ましい。

上記の酵素反応は通常１５〜４０℃の範囲で行なわ扛る
。反応の至適ｐＨはペニシリンアシラーゼの生産菌株に
よっても異なるが、通常ｐＨを至適〆■に保持する必要
のある場合には６〜９の付近に保持して反応を行なうよ
うにすｎ、ばよい。反応時間は酵素力価基質浸量、流速
等によっても異なるが、通常１−１０時間である。従っ
て、カラム式の場合にはその好適な反応時間内に通過さ
せるのがよい。

上記の酵素反応におけるＰｃＧの濃度は１〜２０Ｗ／Ｖ
チの範囲で用いらｎるが、高反応率、再使用率、固定化
酵素の活性劣化防止などの点で通常３〜１２　ｗ　／　
ｖ％の範囲で使用するのが好ましい。

次いで、反応液から６−　ＡＰＡを単離、精製するので
あるが、公知の方法により行なうことができる。例えば
反応液中に残存するＰｅＧおよびカルボン酸をメチルイ
ンブチルケトン、酢酸エチル、酢酸ブチルなどの非親水
性有機溶媒で酸性上抽出除去した後、ＰＨを４３に調節
して６−ＡＰＡを等電点沈澱させてもよいが、反応液に
アセトン、メタノール等の親水性有機溶媒を加えた後、
直接ｐＩ（４，３で６−　ＡＰＡを等電点沈澱させても
よい。本発明においては、基質濃度が極めて高いために
反応液を濃縮することなく、高収率、高純度で反応液か
ら直接６−　ＡＰＡを結晶化させることができる。

ＰｃＧ　（１’）　６−　ＡＰＡへの転換率は、種々の
方法により求めることができる。例えば、高速液体クロ
マトグラフィー、カルボン酸生成によるアルカリ消費哲
から求めら几、また反応液をｐ　Ｈ２ｊ）に調節し、メ
チルインブチルケトンで未反応ペニシリンと生成カルボ
ン酸全抽出除去し、水層中の６−　ＡＰＡをヨード吸収
法により定量すると同時にフェニル酢酸クロライドでア
クル化し、生成するＰｃＧの抗菌力をペーパーディスク
法で生物検定することにより定量できる。

ペニシリンアシラーゼの力価測定法 ０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　４．５　ｍｌ
、４（Ｗ／Ｖ）％　ＰｃＧカリウム塩／　０．Ｉ　Ｍリ
ン酸緩衝液（ＰＨ７，５）０．５　ｍＩ！よりなるＭ液
中にあらかじめ重量全測定した固定化酵素を添加し、３
７℃、３０分間反応せしめる０こ几から０．５ｍｌ！’
ｉとり、０．０５　Ｎ　ＮａＯＨ１ｍｌ、　２０チ酢酸
２ｍｌよりなる緩衝液３１ｎｌＸＯ，５（、Ｗ／　Ｖ）
％Ｐ−ジメチルアミノベンジルアルデヒド／メタノ１５
− 一ル溶液０．５　ｍｌ中に加え、室温下１０分間反応さ
せ、４１５ｎ＋ｎＶｃおける吸光度を測定し、生成する
６−ＡＰＡ量を求める。

酵素活性は、１分間に１μモルの６−ＡＰＡｉ生成する
活性を１単位（ＩＵ）とする。

次に、参加例および実施例を挙げて本発明を具体的に説
明するが、こｆｌ、　Ｋより本発明を限定するものでは
ない。

参考例１ 水素化リチウムアルミニウム１．５ｔにＥＪジエチルエ
ーテル１２ＯｍＪ金加え、こ几に多孔質構造を有するポ
リアクリルニトリル繊維（旭化成工業製、アクリロニト
リル９０チ以上、多孔質ポアサイズ４０〜４０００Ａ　
）１．５　ｆを加え、５０℃の油浴中、１時間加熱還流
した。反応後、繊維を取り出し、エーテルで洗浄した後
、１Ｎ塩酸、水、ｌＮ水酸化ナトリウム水啓液、水、０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）の順に洗浄して多孔
質構造金有するアミノ化ポリアクリロニトリル繊維７ｔ
（湿重量）を得た。

参考例２ １６− 固定化ペニシリンアシラーゼ 参考例１で得た多孔性構造全有するアミン化ポリアクリ
ロニトリル繊維を、冷却しｉ１２．５％グルタルアルデ
ヒド／ホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）　、２４０７８／！
中に加え、０℃、２０分間投押し、と１．を−ノ１νし
た後ホウ酸緩衝液（ｐＨｌ’１．５　）　、０．１　Ｍ
　−ＩＩン酸緩価液（ｐＨ７，５）の頓で洗浄し、こｆ
ｉ、　’％７　、バチルス・メガテリウム・Ｒ−４００
（ＦＥＲＭ　Ｐ　−７４８）の生産するアシラーゼ酵素
液（６０Ｕ　／　ｍｌ　）　１１３　ｍｌに加えて室温
で４時間攪拌し、さらに５℃で一夜放置した後、戸数し
、た（Ｆ液中のアシラーゼ活性は認めら几なかった）。

こ′ｎ−全づらに０．５　Ｍ食塩含有０．１　Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，５）、０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，５）の順で洗浄し、固定化ペニシリンアシラーゼ（
５８４Ｕ／ｇ　）　６．８　ｆ（湿重量）全得た。

実施例１ ＰｃＧカリウム４７４．　（ＰｃＧＫ　）　（ファイザ
ー社製、Ｌｏｔ　＆　Ｇ２３２４８−３４００８　）　
３００　ｆ　ｆ蒸留水ｌｔに溶かし、こｆ′１．を限外
濾過器（旭化成工業社製、限外濾過モジュールＡＣＬ　
−１０１０、中空糸状膜、分画分子量１３００Ｑ　）に
通して限外濾過処理した。この処理液に蒸留水３００ｍ
／づつ３回加え、ＰｃＧＫ　２８１．２＃（収率９３．
７　％　）を含む限外濾過液１９００　ｍｌ　（ＰｃＧ
Ｋ１４８■／　ｍｅ　）を得た。

実施例２ 参考例２で得た固定化ペニシリンアシラーゼ１７．０　
？（湿重量）をカラム（３，４Ｘ　５　ｃｍ　）に充填
し、貯蔵槽に実施例１で得たＰｃＧＫの限外濾過液３３
８ｍ１！（ＰｃＧＫとして５ｏｔ）’ｒ加え、Ｏ，１２
Ｍ２Ｍホウ酸緩衝液ＰＨ８，４）を加えて全量全５００
−とした。このＰｃＧＫ水溶液をホンダにより５０ｔ／
時の流速でカラムの下部よりカラムに流入し、カラム流
出液は貯蔵槽に戻し、連続循環させた。その間、貯蔵槽
内の水溶液の温度を恒温槽で３４℃に保持すると共に４
Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で自動ｐＨ調節器に工りｐＨ
ｉ　８．４に調節し、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）により残存するＰｃＧ量を追跡した０残存Ｐｅ
Ｇ量が２．０■／ｆｎｌ以下になった時点で反応液の循
環全停止し、カラム内の反応液を回収するために、カラ
ムの下部より洗浄用の０．４Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７，
５）　１００　ｍｅに流入し、カラム内の反応液および
洗浄液を貯蔵槽に流し出した。

貯蔵槽中の反応液にメタノール３４０ｍ１ｆ、（加え、
冷却下６Ｎ塩酸でｐＨ４，３（／Ｃ調節し、冷蔵庫中で
一夜放置した。析出した沈澱物を戸数し、冷メタノール
１５０−で洗浄、乾燥して６−　ＡＰＡを得た。循環開
始から洗浄終了迄の工程ｉ１パッチとし、反応液中の残
存ＰａＧ量が２．Ｏｆｌに！／　ｄ以下になる迄の反応
時間、６−ＡＰＡの乾燥重量、その収率および固定化ペ
ニシリンアシラーゼの活性残存率を求めた。

次に、新たに貯蔵槽全セットしてＰ　ｃＧＫ水溶液全仕
込み、前記と同一工程を連続的に繰り返し行って６−　
ＡＰＡ　Ｑ製造した。その間、各バッチ毎に反応時間、
６−ＡＰＡの乾燥重量、その収率および固定化ベニｙ　
ＩＪンアシラーゼの活性残存率ヲ求めた。

そｎらの結果は第１表の通りであった。

１９− 第１表 参考例３ 実施例２において、限外濾過処理したｐ　ｃＧＫ水溶液
の代りにｐｃＧＫ　（ファイザー社製、ＬｏｔＡＧ２３
２４８−３４００８　）５０　Ｐ全０．１２　Ｍホウ酸
緩衝液（ｐＨ８，４）にｔｏｗ／ｖ％濃度で溶解した限
外濾過処理の水溶１５００＋ｎ！、’ｉ用いて、実施例
２に記載の工程に従って各バッチ毎に５−　ＡＰＡを製
造した。

その結果は第２表の通りである。

２０− 第２表 以上の結果より純度の悪いＰ　ｅＧＫバルクを使用して
固定化酵素法により６−　ＡＰＡ　’（ｒ製造すると、
初めのｌバッチですでにペニシリンアシラーゼ活性が２
０％以上低下しており、バッチを増す毎にペニシリンア
シラーゼ活性の安定性の著しい低下と反応時間の長期化
を示しているだけでなく１固定化ペニシリンアシラーゼ
の長期的に連続便用が不可能であること全示している。

こｎに対し実施例２において純度の悪いＰ　ｃＧＫバル
クを予め限外濾過処理した水溶液を用いて得た第１表の
結果によｎ、げ、ペニシリンアシラーゼ活性の安定性が
極めて良好であり、長期的に連続使用が可能であること
を示しており、本発明によ几は参考例３における製造例
よりも工業的には６−　ＡＰＡの製造コストがより安価
に製造可能であることを意味している０ 実施例３ ＰｃＧ醗酵ブロス（東洋醸造社、Ｌｏｔ　Ａ　２０９６
　）からドラム・フィルターにより菌体除去した培養涙
液（ＰｃＧＫとして３０ｑ／ｄ含有）１０ｔで６Ｎ塩酸
でＰＨ２，０に調節した後、酢酸ブチルＩｔで３回づつ
抽出した。酢酸プナル層を合わせ、炭酸カリウム−酢酸
カリウム緩衝液（ｐｌ（７，２〜７．３　）　３００　
ｍｌで３回づつ水層のｐＨｋ酢酸カリウム水溶液で７．
２〜７．３に調節しなからＰｅＧを水層に転溶した。水
層全減圧下で酢酸ブチルが留去するまで濃縮した。

得ら几た水性抽出液９００　ｍｌ　（ＰｃＧＫとして２
５７ｇ含有）を限外ｐ過器（旭化成工業社製、限外濾過
モジュールＡＣＬ　−１０１０、中空糸状膜、分子量１
３０００以上分画沖過）に通して限外ｐ過処理した。こ
の処理液に蒸留水３００　ｍ７！づつ３回加え、ｐｃＧ
Ｋ２４１．２　ｇ（収率９４　’ｆＡ　）　ｋ　會む限
外濾過液１８００　ｍｌ　（ＰｃＧＫ１３４■／７斤得
た。

実施例４ 実施例２において、ＰＣＧＫ水溶液の代りに実施例３で
得たＰｃＧＫの限外濾過！、　３７３　ｍｌ（ＰｃＧＫ
として５０ｔ）に０．１２　Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，
４）を加えて５００−とじた水溶液を用いて、実施例２
に記載の工程に従って、各バッチ毎ＩＣ６−ＡＩ”Ａ　
全製造した。

その結果は第３表の通りであつｆｃ、。

第３表 一２３二 参考例４ 実施例２において、限外Ｆ　：ｉＭ　Ｌ　＊　ＰｃＧＫ
水溶液の代りに実施例３で得た限外濾過処理しない水性
抽出液１７５　ｍｌ　（ＰｃＧＫとして５０９）に０．
１２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，４）を加えて５００コと
した水溶液を用いて、実施例２に記載の工程に従って、
各バッチ毎に５−　ＡＰＡ全製造した。その結果は第４
表の通りであった。

第４表 第４表の結果より、参考例４の従来の固定化酵素法にお
いて、ＰｃＧＫとして醗酵ブロスから得ら几２４− た水性抽出液を使用すると、酵素活性残存率が著しく低
下し、各バッチにおける反応時間が大巾に長期化し、固
定化ペニシリンアクラーゼが長期的に連続使用が不可能
となり、工業的な方法とはいえない。

こ１に対し、実施例４において、Ｐ（！Ｇ＃酵ブロブロ
ス得た水性抽出液金子め限外濾過処理した水溶液を用い
て得た第３表の結果によ几ば、ペニシリンアシラーゼ活
性が長期間の連続使用に対しても比較的安定であり、長
期的に連続使用が可能であることを示している。例４に
おける製造例よりも工業的にに６−　ＡＰＡの製造が可
能であることを意味している。

従来、醗酵ブロスから得らｆる水性抽出液からＰｃＧＫ
としてｍ離収率に高々８５チ程度であることを考慮する
と、本発明ではこの単離工程が不要であるため、少なく
ともその工程の製造コストの低減につながり、本発明が
原料であるＰａＧｉｈ酵プロスより得らｎ−た水性抽出
液の形で使用する固定化酵素法による６　−ＡＰＡの製
造法として充分に工渠内な方法であるといえる。

特許出願人 東洋醗造株式会社 一屏　−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ）ベンジルペニシリンに水性媒体中固定化ペニシリン
   アシラーゼを作用させて酸素的に６−アミノペニシラン
   酸ｔｌ−製造する方法において、粗製ベンジルペニシリ
   ンまたはその水溶性塩の水性溶液を分子量５０００以上
   の限外濾過処理を行い、得ら几た処理液に固定化ペニシ
   リンアシラーゼを作用させることを特徴とする６−アミ
   ノベニクラン酸の製造法。 ２）水性溶液がベンジルペニシリン醗酵プロスから抽出
   工程により得ら九たベンジルペニシリンの水性抽出液で
   ある特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ３）水性抽出液がペニシリンアシラーゼの至適ｐＨまた
   はその付近にｐＨを調節した浴液である特許請求の範囲
   第２項記載の製造法。 ４）水性溶液がベンジルペニシリン醗酵プロスから単離
   された粗製ベンジルペニシリンまたはその水溶性塩全水
   性媒体に溶液化した溶液である特許請求の範囲第１項記
   載の製造法。 ５１　　ａａｉｚペニシ１１ンアクラーゼの至適ｐＨま
   たはその付近ＫｐＨを調節した溶液である特許請求の範
   囲第４項記載の製造法。