JPS5989631A - ウシのウイルス性下痢症ウイルス変異株を含有するワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はウシのウィルス性下痢症（ＢＶＤ）ウィルスの
変異株、その製法およびそれらを含むワクチンに関する
。

ウシのウィルス性下痢疾患は家畜の最も広範囲に広まっ
た、経済上重大な疾患のひとつである。

該疾患は消化器粘膜の潰瘍化および下痢症を伴なった急
性で致死率の高い牛疫様症候群の群の発生が観察されて
初めて米国で確認されたものである。

〔オラ１’）Ｊら（ＯＬＡＦＳＯＮ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃ
ｏｒｎｅｌｌＶｅｔ、、Ｖｏｌ、３６　＋　２０５〜２
１３．１９４６）参照〕同時期、重度、慢性度および蔓
延率の程度が異なる類似の症例がラムセイ、エフ、ケイ
ら（ＲＡＭＳＥＹ、Ｆ、に、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｏｒｔｈ
、Ａｍ、Ｖｅｔ、、Ｖｏｌ。

３４．６２９〜６３３．１９５３　）によって報告され
、粘膜病と命名された。暫くの間、数種の異なった感染
が存在すると考えられていた。しかし、両方の用語が文
献中に浸透し、粘膜病症候群なる語が常用されるように
なった後、結局、同じウィルスがこの２つの症候群の原
因であると結論されるに至った。そこで、該疾患は優先
性によ虱ウィルス性下痢疾患と称されるようになった。

ＢＶＤの病因因子は、トガビリダｘ　（Ｔｏｇａｖｉｒ
ｉｄａｅ）科のペストウィルス（ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ
）として分類されるＲＮＡウィルスである〔アントリ、
１−ス・シイら（ＡＮＤＲＥＷＥＳ　、　Ｃ０ｅｔ　ａ
ｌ　、、Ｖｉｒｕｓｅｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｖｅｒｔｅｂｒ
ａｔｅｓ、４ｔｈ　ｅｄ、、Ｉ、ｏｎｄｏｎ　；Ｂａ１
ｌｌｉｅｒｅ　Ｔｉｎｄａｌｌ、　　ｌ　９７８）参照
〕。

飼育場における臨床症状の発現はかなり変化する。一般
に、７〜１１日の潜伏期間後、−相性または二相性の３
９．５〜４１．５°Ｃの発熱、食欲不振、下痢が起こる
。時々、該下痢症は激しいしぶりを伴なって、未消化食
物、血液凝集粘液およびジフテリアストランドの排泄に
進行する。多飲多渇症の併発にもかかわらず、該動物は
脱水状態となり、速かに、衰弱する。

ＴＳＶＤは主に消化管の感染と関連するが、一連の症状
は、通常、呼吸器併発症、すなわち、呼吸頻繁および咳
と共に、後に化膿する漿液性まだは粘液性の鼻面から開
始することが示唆されている（ニス・エフ・ロスナ−（
Ｓ　、Ｆ　、ＲＯ３ＮＥＲ、Ｉ　ｏｗａＶｅｔ、Ｖｏｌ
、３５．１１〜１４．１９６４）参照〕。

多くの著者も鼻面が漿液性から粘液化膿性に進行するこ
とを報告している。

該疾患に関連する主な病理学的変化は消化器粘膜の充血
、出血、浮腫、びらんおよび潰瘍である。

肺性浮ＩＦｎと共に気道粘膜表面の充血も観察される。

通常、著しい白血球減少が特に感染の早期においてみら
れる。総白血球数は実験的接種後約１４日で正常値に回
復することが観察されている〔スコット・エフ・ダブリ
ユウら（５ＣＯＴＴ　Ｆ、Ｗ、ｅｔａｌ、、　Ｃｏｒｎ
ｅｌｌ　Ｖｅｔ、、ＶＯＩ、　６３　、５３６〜５６０
．１９７３）参照〕。

これらに基づいて、ミルズ・ジエイ・エイチ・ｘ　）ｖ
ら（ＭＩＬＬＳ　　Ｊ、ＨｏＬ、ｅｔ　ａｌ、、Ａｍ、
Ｊ、ＶｅＬ。

Ｒｅｓ、、Ｖｏｌ、２９．１３６７〜１３７５．１９６
８）は、「呼吸経路による伝播が１つの可能な拡散様式
である」と示唆している。

ＤＶＤ感染に対する先天性免疫耐性がこの希にみる致命
症の潜在的原因とされており、またコルチコイド処理に
よって誘発される免疫抑制がｎｖＤの人工感染の発病力
を増強させることが知られている。該免疫抑制動物は、
しばしば、全身ウィルス性血症で死ぬことがある〔ロー
プ・シイら（ＲＯＩ−ＩＤＥ　、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ｚ
ｂｌ　、Ｖｅｔ、Ｍｅｄ、　、Ｖｏｌ　、１７　。

Ｂ：６８６．１９７０）およびショーペ・アール・イー
（５ｈｏｐｅ　、Ｒ，Ｅ、ｃｌ　ａｌ、’、Ｃａｎ、Ｊ
＋Ｃｏｍｐ。

Ｍｅｄ、、Ｖｏｌ、４０，３５５〜３５９．１９７６）
参照〕。

一旦、明白な臨床的徴候が群の中に観察されると、通常
、おかされている個体および群において該感染が十分に
確立していることとなる。これらの臨床症例を治療する
ために用いる特異的な治療方法はない。重度ならば通常
は死亡するし、軽度ならば抗生物質によって二次感染を
制御して回復を早めることができる。

普通の飼育場条件下で「隔離群」を維持す試みはＤＶＤ
ウィルスによる感染を防ぐには不十分であることが立証
されている。そのため、予防法は主にワクチンに基〈。

不活化ワクチンについてはかなりの研究が行なわれてき
た〔マツグ・クラ−キン・エイーグブリユウら（ＭｃＣ
ＬＵＲＫＩＮ　Ａ、Ｗ、ｅｔ　ａｌ　、、Ｐｒｏ、ＵＳ
Ａｎｉｍ、Ｈｅａｌ　Ｌｈ、Ａｓ５ｏｃ、、Ｖｏｌ　、
７９　、　ｌ　ｌ　４〜１２３．１９７５）参照〕。し
かし、今までのところまだ商業上利用できるものではな
い。所望の抗原物質を経済的に許容できる様式で投与す
るために許容される剤形を製造する技術を欠くだめ、そ
の実用化が妨げられている。

いくつかの商業用ＢＶＤ生ワクチンが知られている。ア
ール・エム・フィリップスラ（ＲｏＭ。

ＰＨＩＬＬＩＰＳ　　ｅｔ　ａｌ、、Ａｍ、Ｊ、Ｖｅｔ
、Ｒｅｓ、、Ｖｏｌ、３５．１３５〜１４０（１９７，
５）〕は［ＢＶＩ）抑制用生ワクチンの早期開発は、ウ
サギまたはウシ腎細胞培養での連続継代によるウィルス
の弱毒化に基づいて行なわれだ。これらのワクチンは家
畜におけるＢＶＤウィルス感染を防ぐのに有効であるこ
とが証明されたが、一方では接種後の合併症についての
報告がみられた」と報告している。同じ報文においてフ
ィリップスらはまた、ブタ細胞系弱毒化ＢＶＤ生ウィル
スワクチンの開発について記載している。

しかしながら、これらの入手可能な生ＲＶ　Ｉ）ワクチ
ンは以前から知られているワクチンの他の固有の弊害を
さけられない（ＴＥＲＰ　５ＴＲＡ　、　Ｃ、Ｅ　ＩＫ
ＥＬＥＮＢＯＯＭ　、　Ｊ　、　Ｌ　、ａｎｄ　ＧＬＡ
Ｓ　、ＣｏＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ　ｔｈｅ　ＸＩ
Ｔ　ｔｈ　ｗｏｒｌｄ　ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｎ　ｄｉ
ｓｅａｓｅｓｏｆ　ｃａｔｉｌｅ、Ｖｏｌ、１　、１７
７　、１９８２　）。

飼育場において種々の頻度で発生する重篤なワクチン接
種後合併症を説明する試みにおいて、ワクチン株自体の
発病力以外にいくつかのもつともらしい理由が仮定され
た。しかし、合併症の原因は評価するのが〕・准しく、
該ワクチンは非常に疑問視されてきた。

本発明は、ＢＶＤウィルスの温度感受性（１Ｓ）変異株
、すなわち、動物の体温にかなり制限される複製能を示
すが、重篤な副作用なしでウシに免疫を誘起させること
のできる株を提供することによって今日まで知られてい
るＢＶＤ生ワクチンの弊害を克服するものである。

本発明の変異株は、ＢＶＤウィルス株の突然変異誘発、
さらに詳しくは、感染動物から単離されだＢ　Ｖ　Ｄウ
ィルス、例えば、単離され、ヨーロッパ特許条約（ＥＰ
Ｃ）の規定に従ってパリのアンスティーＦニー・パス７
−）ｖ　（Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｐａ５ｔｅｕｒ。

Ｃ：ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
　）に１９８２年７月２０日付で受託番号ｌ−１９８と
して寄託されているＢＶＤ野性野性型皿硝酸処理のごと
く、化学変異誘発剤によるＤＶＤウィルス株の処理によ
って調製される。

化学的薬剤による突然変異は当該分野で公知の技術であ
り、突然変異を誘発することが知られておυ、かつ、本
発明方法に使用することのできる化学的薬剤は、前記の
亜硝酸の他にＮ−メチル−Ｎ−ニトロソ−Ｎ−二トログ
アニジン、メタンスルホン酸メチル、メタンスルホン酸
エチル、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、ヒド
ロキシルアミン、５−アミノアクリジンのようなアクリ
ジン糸染料およびプロフラビンがある。さらに詳述する
と、米国特許第３９０７９８６号および第３９６２４２
４号は亜硝酸処理による温度感受性ウィルス変異株の調
製および家畜における呼吸器疾曵を予防するのに何月な
生ワクチン調製での該変異株の使用について記載してい
る。しかし、ＢＶＤウィルスの温度感受性変異体は本発
明以前には知られていない。

本発明によれば、舒性型ＢＶＤウィルス株からワクチン
株を調製するために、該株を化学的突然変異誘発剤、例
えば亜硝酸と初期ウィルス力価を２〜３　ｌｏｇ、。減
少させる操作条件下で反応させ、得られた変異株を３５
°Ｃおよび３９．５°Ｃで各々培養することによって３
９．５°Ｃ（ウシの体内型管温度）においてその３５°
Ｃにおける増殖能よりも約３１ｏｇ　ｉ　ｏ小さい増殖
能を示す温度感受性（ＩＳ）変異株を単離する。該温度
感受性変異株は、ウシのウィルス性下痢症ウィルスの増
殖用の公知の組織培養〔例えば、入手制限なしでアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託番号Ａ
ＴＣＣＣＣｌ４４として寄託されているウシ腎細胞系ま
たは、マツクラ−キン・エイ・ダブリユウら（Ｍｃ　Ｃ
ＬＵＲＫ　Ｉ　Ｎ　Ａ　、Ｗ、ｅ　ｔ　ａｌ　、　、　
Ａｒ　ｃｈ　、Ｇｅ　ｓａｍ。

Ｖｉｒｕｓｒｏｒｓｃｈ、、Ｖｏｌ、４５　、２８５〜
２８９　、１９７４）によって記載されているウシ鼻甲
介単層細胞〕中で適当な希釈度でクローンし、終点希釈
によシフローンの選択を行なうことによシ単離される。

さらに詳述すると、ウシのウィルス性下痢症の典型的な
症状を示す動物から単離した野性型皿、例えばＣ０Ｎ、
Ｃ６Ｍ、　Ｉ　−１９８ウィルス株を、ウシ下痢症ウィ
ルスを増殖させる組織培養、例えばウシ腎細胞糸または
ウシ鼻甲介細胞系のような細胞系で増殖させ、該株を前
記組織培養に順応はせた後、前記ウシ下痢症ウィルスの
懸ｍｇ！を室温にて化学的突然変異誘発剤、例えば、亜
硝酸緩衝水溶液、例えば、培養液中の亜硝酸および酢酸
緩衝液の濃度が各々４ＮおよびＩＮであるような酢酸緩
衝液中亜硝酸と、１〜１５分間、例えば、６（±１）分
間、ｐＨ５〜６、例えば、ｐｒ−＋　５．７　（±０．
１）で反応させ、その後、例えば、ＩＮ水酸化ナトリウ
ムを滴下してｐＨを７．５に調整することにより反応を
止める。ついで、該懸濁液を好ましくは透析し、希釈し
た各希釈物を前記に示すような組織培養中で増殖させる
。その後、陽性の培養を３５°Ｃおよび３９．５°Ｃで
比較培養し、力価を６１１１定し、両温展間で約３　ｌ
ｏｇ　１　（ＩＴ　ＣＩ　Ｄ５０の力価差を示す培養を
選択する。ついで、かかる温度感受性変異株を前記に示
すよう々ウィルス増殖用の組織培養中で増殖させ、該温
度感受性変異株、例えばｐ。

Ｎ、Ｃ，Ｍ、　Ｉ　−１９９ウィルス株を単離するため
に、少なくとも１同経点希釈継代によりクローンする。

Ｃ１Ｎ、Ｃ１Ｍ、　Ｉ　−１９９株含有ワクチンを用い
て免疫抑制動物で行なわれた実験は、本発明によるこの
ワクチンが従来存在しているワクチンより著しく改善さ
れていることの強力な証拠を示した。

Ｃ０Ｎ、Ｃ，Ｍ、Ｉ　−１９９株で観察される症候の低
レベルはビルレントまだｄ弱毒化Ｊ　ＢＶＤ株を免疫抑
制動物に使用した研究に記載されている重い病像とは実
にきわだって対照的である。ビルレント株を用いた研究
結果はショーペ・アール・イーら（５ＨＯＰＥ　ＲｏＥ
、ｅｔ　ａｌ、　、　Ｃａｎ、Ｊ、ＶｏｍｐｏＭｅｄ、
。

Ｖｏｌ　　４０　、３５５〜３５９．１９７６　）によ
って報告されており、また「弱毒化」株を用いた研究結
果はビトル・ジエイ・ニスら（ＢＩＴＴＬＥ　Ｊ　。

Ｓ　、ａｎｄ　ＨＯＵＳＥ　Ｊ、Ａ、、　Ｊ　、Ａ、Ｖ
ｏＭ、Ａ、、Ｖｏｌ　、　１６３　。

８７８〜８７９．１９７３　）によシウシを実験動物に
して報告されている。後者の場合、ビトルらは２頭の仔
ウシをデキサメタシンで１１日間処理し、［弱毒化ウィ
ルス（Ｃ２４Ｖ）Ｊによるワクチン接種以前では該動物
は正常なままであったが免疫抑制処理を中止すると直ち
に熱および白面」゛・ｋ減少を伴なう典型的な粘膜病の
症状が発現すると報告している。ワクチン接種後２４時
間で１頭が死亡したが、もう１頭は最終的に回復した。

本発明のＣ，Ｎ、Ｃ１Ｍ、■−１ｇ　ｇ株含有ワクチン
を免疫抑制された仔ウシに使用した試験では、甲種にお
さまる種々な程度の下痢以外には一！Ｉ＋！型的な粘膜
病の臨床的徴候は何ら観察され々かった。′ｆ）た、消
化上の問題が観察された期間、毎日、ウィルスの回収を
試みたが、ワクチン接種動物から該ＢＶＤウィルスは回
収されなかった。すなわち、該臨床所見はワクチン接種
動物の糞便中または叫声分泌物におけるワクチンウィル
スの存在とは関連がない。観察された症候はウィルス面
層とも関係ない。また、遺伝学的に変化したワクチンウ
ィルスの出現が観察されなかったことも注目すべきこと
である。

さらに、活性成分が温度感受性変異株であって、生体の
低温部位に投与される従来のワクチンとは対照的に、本
発明のワクチンはこのような経路で投与された場合は感
染性ではなく、伝統的な非経口的経路、すなわち、動物
の皮下または筋肉内のいずれかに投与されなければなら
ない。但し、前記非経口投与後、例えば２〜３週間後、
何らかのブースター（追加抗原刺激）を投与する。

本発明によるワクチンの好ましい投与量単位は少くなく
とも１０３５ＴＣＩＤ５ｏ、より好ましくは、少くなく
とも１０　ＴＣＩＤ５ｏの変異ウィルス株を含む。本発
明方法より得られるＢＶＤ変異ウィルス株および非経口
投与することのできるその他のウシ生呼吸器ウィルスワ
クチン（すなわち、ウシ呼吸器シンシチウム（ＢＲ５）
ウィルスワクチン）を含む複合ワクチンで行った実験は
、該変異ＢＶＤウィルス株がもう一方の接種ウィルスの
免疫原性を干渉しない（すなわち、影響を及ぼさない）
ことを示しており、それゆえ他の態様に従えば、本発明
は前記に示すような温度感受性ＢＶＤウィルス変異株と
、非経口的経路によって投与することのできる他のウシ
用生ウイルスワクチンからなる複合生ウイルスワクチン
に関する。

本発明を次の実施例によってさらに詳しく説明するが、
これらに限定されるものではない。

実施例１ 突然変異誘発および突然変異株の選択 該疾患の典型的な症状を発現する仔ウシの鼻粘膜由来の
ウシ下痢症ウィルス株を、仔つシ製九細胞培養中で１０
継代して該組織培養中に順応させ、ヨーロッパ特許条約
の規定に従って、パリのアンスティチュー−パスツール
ＣＩｎ５ｔｉｔｕｔｅＰａｓｔｅｕｒ　　Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　（Ｃ１Ｎ、Ｃ，
Ｍ、））に受託番号ｌ−１９８として１９８２年７月′
り０日に寄託した。

該ウィルスを、ウシラクトアルブミン氷解物０．２５％
（Ｗ／Ｖ）で補足しだイーグｗ　（Ｉｉ、ａｇｌ　ｅ）
の基礎および最少培地の５０１５０（Ｖ／Ｖ）混合物か
らなる培地を用い、本明細書ではＮ　Ｔ−１１１（４細
胞系と称するウシ腎細胞系中で６継代して増殖させる。

第１６代納代から得られる１０４・０ＴＣＩＤ５０１０
．１−を含有するウィルス懸濁液１．２５ｍ１容を、１
モル酢酸／酢酸すｌ−ＩＪウム緩衝液１．２５ｍ１およ
び４モル亜硝酸すｌ−ＩＪウム水溶液１．２５４と混合
する。該混合液の最終ｐＨは５．７であった。ついで、
該混合液を室温にて６分間反応させ、その後、ＰＩ（７
，５（±０．５）までＩＮ水酸化ナトリウムを滴下して
該反応を止める。ｐＨ調整は、ウィルス懸濁液中に存在
させたフェノールレッド指示薬の変色に従う。

該処理ウィルス懸濁液を、ＮａＣｌ８ｇ、ＫＣｌ０．２
ｇ、Ｎａ２　ＨＰＯ４１，ｌ　５　／／、ＫＨ２Ｐ　０
４０．２ｇおよび蒸留水（８００−まで）からなり、蒸
留水１００ｄ中ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０溶液、その後蒸留
水１００ｄ中ＣａＣｌ２０．１　ｆ溶液と混合し、最終
溶液を滅菌濾過し、最終ｐＨを７．２〜７．４としたリ
ン酸緩衝食塩水中で５°Ｃにて５時間透析する。透析後
、該ウィルス懸濁液を液体窒素中で保存する。

感染力価試験は、１０倍希釈当シ４本の試験管を用い、
３７°Ｃで行なう。得られたウィルス懸濁液の残留感染
力は、出発Ｃ０Ｎ、Ｃ０Ｍ、Ｉ　−１９８つイ／Ｌ’７
．懸濁液の感染力の１０　−ｒＣＴ　ｎ５０１０．１−
であった。ウィルス懸濁液の一部０．１　ｍｌづつをウ
シラクトアルブミン氷解物０．２５％（Ｗ／Ｖ）を補足
したイーグルの基礎および最少培地の５０１５０　（Ｖ
／Ｖ　）混合培養液で１７９に希釈し、ＮＬＢＫ４ウシ
腎細胞系の試験官８０本に接種し、ついで、３７°Ｃに
て５日間インキュベートする。

試験管８０本のうち３１本がウィルス増体ｉに、ｌ：る
細胞変性効果を示した。

細胞変性効果を示しだ各試験管を３５°Ｃお」：び３９
．５°Ｃで比較培養し、力価を測定する。これらのイン
キュベーション温度は、出発ウィルス（Ｃ０Ｎ、Ｃ，Ｍ
、　Ｉ−１９８）が両温度では同等に増殖するが４０°
Ｃでは増殖困難であったことから、各々許容温度および
制限温度として選択した。該単離物の１つは３５°Ｃお
よび３９．５°ｃの力価差が３．０１ｏｇ１０−ｒ　Ｃ
Ｉ　Ｄ５０　（培養物（Ｄ　５０　’１６　ヲに、染す
セル’ＭＡ１織培養感染用量）であって温度感受性を示
す。先の継代と同じ操作条件下でさらに継代して増殖（
＠１９代）させ、これを凍結乾燥する。

ついで、該ウィルスを前記と同様の培養液を用い、本明
細書ではＮ　Ｌ　Ｂ　Ｔ１　　と称するウシ鼻甲介細胞
糸で２継代して増殖し、第２１代の継代の時点でウィル
スのストックを調製する。

このウィルス・ストックから、１０−４・５希釈で、同
様な操作条件において９６培養物を用いてさらにクロー
ン継代を行ない、８個の陽性培養を得た。このうちの１
つを、同じ条件でさらに１代納代しく！２４代）、種ロ
フトを形成さぜ、各々、１０３・”Ｔ　ＣＩ　Ｄ５０の
ウィルスを含有するガラスバイアル中で凍結乾燥する。

このクローンの試料ハヨーロッパ特許条約の規定に従っ
て、１９８２年７月２０日付でパリのアンスティチュー
・パスツールに受託番号ｌ−１９９として寄託された。

実施例２ ワクチンの製法 該種ロット（Ｃ０Ｎ、Ｃ，Ｍ、Ｉ　−１９９）の試料を
再水和し、Ｎ　Ｌ　Ｂ　Ｔ１　細胞培養中に接種し、つ
いで前記維持培地で覆う。

該細胞を許容温度（３５°Ｃ±０．５）で５日間インキ
ュベートする。ついで、上澄液を新だに別の培養系列に
接種する。細胞変性効果が該中層細胞の５０％に現われ
だ時、上澄液を集め、保存し、これにカシトン（ｃａｓ
ｉｔｏｎｅ、　６％Ｗ／Ｖ　）を添加し、該混合液を一
７０°Ｃで保管する。このウィルス懸濁液を解凍し、ガ
ラスバイアルに分注し、凍結乾燥して１バイアル当りｌ
　Ｑ’　　−ｒ　ＣＩ　Ｄ５０またはその複数倍を含有
させる。

投与する直前に、投与量当り２．　Ｏｒｎｌの食塩水（
滅菌蒸留水中ＮａＣ１０９９％）を用い、該ワクチンを
再水和する。該ワクチンは筋肉内経路により］り与され
、好ましくは、２回、例えば３週間間隔で投与する。

実施例３ 該変異株の温度感受性 種々の温度で培養した後、０．２−肖シの１０ｇ１ｏＰ
Ｆ　Ｕ　（ｐｌａｕｑｕｅ　ｆｏｒ＋ｎｉｎｇ　ｕｎｉ
ｔ　；ブラック形成単位）として表示されるブラック形
成能（ＥＯＰ）をＣ，Ｎ、Ｃ０Ｍ、Ｉ　−１９８株およ
びｌ−１９９株の各々について測定する。結果を第１表
に示す。

この結果はＥＯＰが野性株Ｃ，Ｎ、Ｃ０Ｍ、■−１ｇ　
Ｂでば１０４°５〜１０５“０であるが、変異株Ｃ０Ｎ
、Ｃ，Ｍ。

ｌ−１９９株は３５〜３７°Ｃで最適なＥＯＰを有し、
これが３９°Ｃでは１．５　ｌｏｇ’１０．３９．５°
Ｃでは３゜Ｑ　、ｌｏｇｌ　０減少し、感染性ウィルス
が接種培養物から回収されず、３９．５°ＣにおけるＣ
ＰＥが陽性で々いことを示す。

＠１表 また、３５°Ｃおよび３９．５°Ｃにおける力価を種々
の継代レベルのウィルスについて測定し、その結果を［
Ｓ２表に示す。第２表は、３５°Ｃおよび３９．５°Ｃ
における力価差がウィルスの種々の継代レベルにわたっ
て安定であることを示している。

第２表 実施例４ 正常な仔ウシ用の弱毒化 ワクチンの種ロフトを５頭の血清陰性動物で試験する。

まず、ワクチンの１０投与量をＩＮ食塩水２ｍｌで再水
和し、各動物に筋肉内経路によって接種する。３週間後
、同投与量のワクチンを同様に投与する。

臨床検査、直腸温度記録および白血球測定を第） １回投与後１４日間毎日行なう。

その結果、何らの症状も観察されず、また、第３表に示
すごとく、３９．２°Ｃ以上の体温上昇は記録されなか
った。

第３表 （Ｘｌ　　日数０とは第１回投与の接種口のことである
。

白血球（ＷＢＣ）数の平均値は、観察期間を通じて正常
値のままであった。

ＢＶＤに対する血清転化によって示されるように、全動
物が免疫付与された。

実施例５ 免疫抑制動物用の弱毒化 ＢＶＤおよびウシ呼吸器シンシチウム（ＢＲ５）ウィル
スの両方に対して血清陰性の９頭の仔ウシに、ワクチン
の第１同棲種を行なう５日前から連続１２日間、デキサ
メタシン０．１　ｑｌＫｇで毎日処理する。

４頭の動物（番号：１６，３０．８２および８３）にＯ
日日に筋肉内経路によって種ロフトを接種し、寸だ、２
１日日日も同様に同投与量を投与する。ここでいう０日
日のワクチン接種とは第１回のワクチン接種で、第４回
ワクチン接種に用いるワクチンの投与量は実施例２で得
られたワクチンのｌ　Ｑ　　Ｔ　ＣＩ　Ｄ５０である。

０日日および２１日日日３頭の動物（すなわち、番号＝
１３．１４および１９）には、ＢＲＳウィルス１０・Ｔ
　ＣＩ　Ｄ５０およびＢＶＤウィルス１０５ＴＣＩＤ５
ｏを含有するＢＲ３／ＢＶＤ複合ウィルスでワクチン接
種する。２頭の動物（すなわち、番号＝８０および８１
）には０日日および２１日日日、投与量あたりＩ　Ｑ”
Ｔ　ＣＩ　Ｄ５ｏのウィルスを含有する同様のＢ　ＲＳ
ウィルスワクチンでワクチン接種する。

臨床検査、体温記録および白血球数測定を第１回接種後
１４日間行なう。同期間中、接種された４頭の仔ウシの
血液試料、叫声ぬぐい液および糞便についてウィルスの
検出を毎日試みた。その結果および説明を第４表および
第５表に示す。

第５表 臨床的評点の計算方法 種々な程度の食欲不振および下痢症がワクチン接種され
た仔ウシのすべてに観察されたことがわかる。しかし、
それらの仔ウシのうち高熱または白血球減少症の両方を
呈するものはなく、ＢＶＤウィルスは採集された試料か
ら再検出されなかった。また、ＲＲ５とＢＶＤの併用に
よる累積的病原性、あるいは干渉も何ら観察されなかっ
た。

実施例６ 人工的攻撃に対するＣ８Ｎ、Ｃ０Ｍ１株ｌ−１９９の効
果 免疫抑制処理の間にワクチン接種された動物は、第２回
の接種後に血清転換する。該動物を、２頭の対照群（Ｂ
Ｒ５のみでワクチン接種された動物）と共に第１同棲種
後３５日日に攻撃した。

攻撃に用いたＢＶＤウィルスはオスロス（Ｏｓｌｏｓｓ
）株である〔ロープ・シイら（ＲＯＨＤＥ　、　Ｇ　、
ａｎｄＬＩＥＳＳ　、Ｂ、　、Ｚｂｌ　、Ｖｅｔ、Ｍｅ
ｄ、、Ｖｏｌ、ｌ　７　、　Ｂ。

６８６．１９７０）参照〕。動物当り１０６・８ＴＣＩ
Ｄ５０を用いて鼻内に投与した。

臨床症状、体温、白血球数を攻撃後１４日間観察した。

ウィルスの再検出は全動物の血液より試みた。

その結果、臨床症状も高熱も何も観察されなかった。

ワクチンを２回接種した仔ウシでは、攻撃後の白血球数
の減少はみられないが、対照群（動物番号：８０および
８１）では白血球減少がみられた。

１０６・８ＴＣＩＤ５ｏ／動物の高投与量においてもオ
スロス株は病原性を示さなかった。ＢＲＳウィルスワク
チンを単独でワクチン接種した対照の番号８０および８
１の動物でも、高熱や臨床症状が観察されなかった。し
かし、これらの２頭の動物はＲＶＤワクチンを２回接種
した仔ウシよりも白血球数が少なく、ウィルス血症の形
跡がみられた。

ＤＶＤ／ＢＲ５複合ワクチンでワクチン接種された動物
も同様に、十分に保護された（番号：１９．１３および
１４）。

その結果を第６表にまとめる。

第６表 −ＩＦ（免疫螢光検査法）陰性 ＋ＩＦ（免疫螢光検査法）陽性 １’ＪＴ　　検査せず 野性５ＢＶＤウィルス株による実験的感染はめったに重
篤な臨床症状をもたらさないことが知られているので、
′＠６表の結果は文献の結果と著しく相異するものでは
ない（５ＡＵＲＡＴ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、。

Ｉ−ａ　Ｍａｌａｄｉｅ　ｄｅｓ　Ｍｕｑｕｅｕｓｅｓ
、Ｅｄ、Ｌ’　ＥｘｐａｎｓｉｏｎＳｃ　ｉ　ｅｎ口ｆ
ｉｑｕｅ　Ｆｒａｎｃａｉｓｅ、Ｐａｒｉｓ　　ｌ　９
７２　。

１’、７６参照）。

該指数（すなわち、試験した試料数に対する陽性の試料
数の比率）は、ＢＲ５のみでワクチン接種した動物群の
指数（９／２０）が、２頭の仔ウシが一時的に陽性であ
るその他の仔ウシ群よりも著しく高い。

実施例７ 飼育場におけるＣ８Ｎ、Ｃ０Ｍ、　■−１ｇ　ｇ株の効
果ＢＶＤに対する抗体価の低い（すなわちく８）１５日
〜１８ケ月令の１０３頭の仔ウシに、実施例２のワクチ
ンの１０４・０Ｔ　ＣＩ　Ｄ５０の投与量を筋肉内経路
にて３週間間隔で２回投与した。ワクチンに基く臨床反
応は何ら報告されず、飼育場条件下におけるワクチンの
安全性が実証された。

結果を第７表にまとめる。

＋Ｊ１１ 第７表 第７表から明らかなように、全体として、７３％の動物
はワクチン接種後顕著な抗体力価の士別を示す。しかし
、ワクチン接種時に血清陰性の仔ウシだけを考慮すると
、より若い動物（４５％）に比較して２ケ月令以上の動
物（９０％）では直情転換率に明確な差（ｐ＜０．００
１）がある。血清陽性動物も同じ傾向を示す。高冷動物
の方がより良好な応答が観察された。

２ケ月令以上の血清陰性動物において、温度感受性株Ｃ
１Ｎ、Ｃ０Ｍ、■−１ｇ　ｇは、１０’　ＴＣＩ　Ｄ５
０（３２） を２回投与後９０％の直情転換を誘発する。この所見は
、商業上入手できるワクチンを用いて至適条件下で得ら
れる９５〜９８％の比率と相違はなイ〔ランヘルド・シ
イら（ＬＡＭＢ　ＥＲＴ　、　Ｇ　、　ｅｔ　ａｌ　、
　。

Ｍｏｄｅｒｎ　Ｖｅｔ、Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　ｐ、３４
．Ａｐｒｉｌ　１９７０）参照〕。

２ケ月令以下の仔牛に観察される５０％の血清転換率は
スミス・ビイ・イーら（ＳＭＩＴＨＰ、Ｅ。

ｅｔ　ａｌ　、ＶｅｔｏＭｅｄ、Ｓｍａｌｌ　Ａｎｉｍ
、Ｖｏｌ　５３　、４５７．１９６８）の結果と一致し
ている。彼らは、６０日令の動物では５／１０、ワクチ
ン接種時に同様な免疫条件を有するより高冷の動物では
４２／４８の割合で陽性反応を報告している。本実験で
は、低い母性抗体力価を有する１６頭の血清陽性動物に
ワクチン接種し、５０％の血清転換が得られた。数は少
ないけれども、これらの結果は、ワクチン接種時に低い
抗体力価を有する２ケ月令以上の動物において免疫付与
がうまく達成ざ、れたことを示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）有効量のウシのウィルス性下痢症ウィルスの温度
   感受性変異株からなることを特徴とするウシに免疫付与
   するウシのウィルス性下痢症生ウイルスワクチン。 （２）該変異株が３５°Ｃと３９．５°Ｃの間で約３１
   ｏｇＨ）ＴＣＩＤ５ｇの感染力価の差を示す前記第（１
   ）項のワクチン。 （３）有効量が、少なくとも、該温度感受性変顕４ｑ、
   の１０３”’　Ｔ　ＣＩ　Ｄ５０である前記第（１）項
   のワクチン。 （４）該温度感受性変異株が化学的変異誘発剤による変
   異誘発で得られる前記第（１）項、第（２）項または・
   第（３）項のワクチン。 （５）該化学的変異誘発剤が亜硝酸である前記＠（４）
   項のワクチン。 （６）ウシのウィルス性下痢症ウィルス株を、ｐＴ−１
   ５〜６にて緩衝水性培地中で亜硝酸と１〜１５分間接触
   させて変異誘発を行なう前記第（５）頃のワクチンＯ （カナなくとも、１つの他の生ウシ呼吸器ウィルスワク
   チンと組合せた前記第（１）項、第（２）項または＠（
   ３）項のワクチン。 （８）生つシ呼吸器シンシチウムウィルスワクチンと組
   合せた前記第（１）項、第（２）項まだは第（３）項の
   ワクチン。 （９）該温度感受性変異株がウシのウィルス性下痢症ウ
   ィルスＣ０Ｎ、Ｃ０Ｍ、　Ｉ　−１９９株である前記第
   （１）項、第（２）項または第（３）項のワクチン。 ０のウシのウィルス性下痢症ウィルスＣ０Ｎ、　Ｃ０Ｍ
   。 ｌ−１９９株。 Ｑｌ）ウシのウィルス性下痢症１クイルス株を、当初の
   ウィルス力価を２〜３１ｏｇ１ｏ減少させる操作条件で
   室温にて化学的変異誘発剤と接触させ、３５°Ｃおよび
   ３９．５°Ｃで、各々、培養および力価測定を行ない、
   ３５°Ｃおよび３９．５°Ｃにおける力価に約３１ｏｇ
   １０　Ｔ　ＣＩ　Ｄ５０の差を示す温度感受性変異株を
   単離することを特徴とするワクチン用のウシのウィルス
   性下痢症ウィルス変異株の製法。 ｏ２．）化学的変異誘発剤が亜硝酸である前記第Φ）項
   の製法。 Ｑ３）ウシのウィルス性下痢症ウィルス株を、ｐ１１５
   〜６にて緩衝水性培地中で亜硝酸と１〜１５分間接触さ
   せる前記第ｃ１２）項の製法。 ０４）反応時間が６±１分、ｐＨが５．７±０．１、反
   応培地がＩＮ酢酸／酢酸塩緩衝液中、４Ｎ亜硝酸である
   前記第■）項の製法。 ０５）単１１ｔサレタｆ異株カＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、　Ｉ　
   −１９９株である前記第０４）項の製法。 Ｃ１６）ウシのウィルス性下痢症ウィルス株を、当初の
   ウィルス力価を２〜３１ｏｇ１０減少させる操作条件で
   室温にて化学的変異誘発剤と接触させ、３５°Ｃおよび
   ３９．５°Ｃで、各々、培養および力価測定を行ない、
   ３５°Ｃおよび３９．５°Ｃにおける力価に約３１ｏｇ
   １０　Ｔ　ＣＩ　Ｄ５０の差を示す温度感受性変異株を
   単離し、得られた変異株を適当な細胞培養中で大量に増
   殖させ、増殖した変異ウィルスを非経口投与用の担体と
   合することを特徴とするウシのウィルス性下痢症ウィル
   スワクチンの製法。 ０７）単離した変異株がＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、　Ｉ　−１９
   ９株である前記第００項の製法。 （１８）変異ウィルスをさらに他の生ウシ呼吸器ウィル
   スワクチンと混合する前記第０６）項または第０７）項
   の製法。 ■）他の生ウシ呼吸器ウィルスワクチンが生つシ呼吸器
   シンシチウムウイルスワクチンである前記第Ｑ８）項の
   製法。