JPS5990055A - 抗体、その製造方法およびその定量方法 - Google Patents
抗体、その製造方法およびその定量方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
１１Ｓ原病の語は今日、結合組織に全身性に起こる一部
の疾患に対する病名で、リウマチ熱、慢性関節リウマチ
、全身性エリテマトーデス、ホルトン側頭動脈炎のほか
多くの疾患が包含される。自動免疫疾患とも呼ばれるこ
れらの疾患の一部は、その臨床症状によっては鑑別が難
しい場合がある。
の疾患に対する病名で、リウマチ熱、慢性関節リウマチ
、全身性エリテマトーデス、ホルトン側頭動脈炎のほか
多くの疾患が包含される。自動免疫疾患とも呼ばれるこ
れらの疾患の一部は、その臨床症状によっては鑑別が難
しい場合がある。
しかも膠原病の様々な表出は同−患者内でも別の形で現
れることがある。
れることがある。
上述の疾患中リウマチ熱はその病因因子が溶血性Ａ群連
鎖球菌に対する以前の感染である点で特殊な疾患である
。この患者は血清のいわゆるロイマ試験で高度の（８０
〜９０％）陽性反応を生じる。これは連鎖球菌の細胞内
成分たとえばストレプトリジン０、デソギシリボヌクレ
アーゼ、ヒアルロニダーゼ等に対する抗体によるもので
ある。
鎖球菌に対する以前の感染である点で特殊な疾患である
。この患者は血清のいわゆるロイマ試験で高度の（８０
〜９０％）陽性反応を生じる。これは連鎖球菌の細胞内
成分たとえばストレプトリジン０、デソギシリボヌクレ
アーゼ、ヒアルロニダーゼ等に対する抗体によるもので
ある。
一方、慢性関節リウマチは最も多い膠原病で、健康の著
しい劣化を招く。最近では総人口の少なくとも１０％が
・罹病しているといわれる。し、がしながらロイマ試験
の結果は患者の約半分が陽性を示すのみであり、とくに
小児ではそうである。
しい劣化を招く。最近では総人口の少なくとも１０％が
・罹病しているといわれる。し、がしながらロイマ試験
の結果は患者の約半分が陽性を示すのみであり、とくに
小児ではそうである。
慢性関節リウマチの病因およびその診断について熱心な
研究が行われてきた結果、バクテリアの細胞内成分が抗
原として作用して抗体の産生を促し、これが慢性炎症反
応の引き金となる一方、結合組織に免疫複合体を形成す
るという考え方が重要視されるようになってきた。
研究が行われてきた結果、バクテリアの細胞内成分が抗
原として作用して抗体の産生を促し、これが慢性炎症反
応の引き金となる一方、結合組織に免疫複合体を形成す
るという考え方が重要視されるようになってきた。
しかしながら、最近の研究によりさらに、初期の細菌学
的に検知できる感染の有無にかかわらず、慢性炎症過程
を誘発する持続的免疫反応にはバクテリア細胞壁とくに
ペプチドグリカンがきわめて重要であることがわかって
きた。
的に検知できる感染の有無にかかわらず、慢性炎症過程
を誘発する持続的免疫反応にはバクテリア細胞壁とくに
ペプチドグリカンがきわめて重要であることがわかって
きた。
ペプチドグリカン（ミュレインまたはムコペン０チドと
もいう）は細胞壁のもつとも重要な成分で、すべてのバ
クテリアに存在する。一方、かび、リケッチアおよびウ
ィルスには相当する成分はない。
もいう）は細胞壁のもつとも重要な成分で、すべてのバ
クテリアに存在する。一方、かび、リケッチアおよびウ
ィルスには相当する成分はない。
動物実験の結果、ペプチドグリカンは急性炎症過程を誘
発すると同時に、顕著な慢性炎症を哺乳動物に起こすこ
とも明らかにされた。しかも、公知のすべての動物酵素
に対するかなりの抵抗性のため、バクテリア細胞壁は何
カ月から何年もの同組織中に桟ることもわかってきた。
発すると同時に、顕著な慢性炎症を哺乳動物に起こすこ
とも明らかにされた。しかも、公知のすべての動物酵素
に対するかなりの抵抗性のため、バクテリア細胞壁は何
カ月から何年もの同組織中に桟ることもわかってきた。
したがって、−この種の病原成分が、これまで病因のわ
かっていない一次性慢性炎症（たとえば慢性関節リウマ
チ）の形成に関与している可能性も考えられる。
かっていない一次性慢性炎症（たとえば慢性関節リウマ
チ）の形成に関与している可能性も考えられる。
ペプチドグリカンは実際に広く存在するきわめて強力な
抗原で、これに対する抗体が動物に形成されることは多
い。
抗原で、これに対する抗体が動物に形成されることは多
い。
連鎖球菌やぶどう球菌にとくに多く、交差結合に与らな
い、Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ （Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌ
ａ、−Ｄ−Ａｌａ）の構造をもつペンタペプチドがペプ
チドグリカンの主な抗原決定基であることが知られてい
る。このペプチドを以下、「ペプチドサブユニットペン
タペプチド」と呼ぶ。ペプチドサブユニットペンタペプ
チドのａ末端配列−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａは免疫優性
基であり、抗原決定基Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ （Ｌ−
Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ ）に対する特異的抗
体の結合に決定的重要性を有する。
い、Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ （Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌ
ａ、−Ｄ−Ａｌａ）の構造をもつペンタペプチドがペプ
チドグリカンの主な抗原決定基であることが知られてい
る。このペプチドを以下、「ペプチドサブユニットペン
タペプチド」と呼ぶ。ペプチドサブユニットペンタペプ
チドのａ末端配列−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａは免疫優性
基であり、抗原決定基Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ （Ｌ−
Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ ）に対する特異的抗
体の結合に決定的重要性を有する。
したがって、このペプチドサブユニットペンタペプチド
に対する特異的抗体は自動免疫疾患（たとえば慢性関節
リウマチ）の確認または治療の監視に診断的意義がある
。すなわち、その存在は病因因子としての連鎖球菌また
はぶどう球菌の指標となる。
に対する特異的抗体は自動免疫疾患（たとえば慢性関節
リウマチ）の確認または治療の監視に診断的意義がある
。すなわち、その存在は病因因子としての連鎖球菌また
はぶどう球菌の指標となる。
これまでにも、動物血清中に、バクテリア細胞壁のペプ
チドグリカン成分に対する抗体が存在することは、免疫
沈降のような各種技術を用いて報告されてきた。動物血
清中のペプチドグリカンのペプチドサブユニットペンタ
ペプチドに対する抗体の検出については、ハプテン結合
定量の報告がある［Ｊ、工ｍｍ＋ｒｎｏ１．１１４：１
１９１−１１９６（１９７５）］ｏＬかしながら、報告
された方法では、定量がウサギ高度免疫血清を用いて行
われているので、ヒト血清中の抗体含量についてはおお
よその定量値が得られるにすぎない。
チドグリカン成分に対する抗体が存在することは、免疫
沈降のような各種技術を用いて報告されてきた。動物血
清中のペプチドグリカンのペプチドサブユニットペンタ
ペプチドに対する抗体の検出については、ハプテン結合
定量の報告がある［Ｊ、工ｍｍ＋ｒｎｏ１．１１４：１
１９１−１１９６（１９７５）］ｏＬかしながら、報告
された方法では、定量がウサギ高度免疫血清を用いて行
われているので、ヒト血清中の抗体含量についてはおお
よその定量値が得られるにすぎない。
この方法には多くの欠点が菖る。ずなわち、１、 非沈
降性抗体の検知には使用できない。報告者自身が各種方
法で定量された抗体含量の間に大きな偏差があることを
認めている（たとえばハプテン結合法による特異的抗体
含量：４．６ｍｙ／π）、沈降法による特異的抗体含量
＝２．２〜／ｎｔｌｌ ） ２、沈降した蛋白が免疫グロブリンであるという証拠は
ない。したがって、非免疫グロブリンの共沈が起こって
いる可能性は否定できない。
降性抗体の検知には使用できない。報告者自身が各種方
法で定量された抗体含量の間に大きな偏差があることを
認めている（たとえばハプテン結合法による特異的抗体
含量：４．６ｍｙ／π）、沈降法による特異的抗体含量
＝２．２〜／ｎｔｌｌ ） ２、沈降した蛋白が免疫グロブリンであるという証拠は
ない。したがって、非免疫グロブリンの共沈が起こって
いる可能性は否定できない。
ろ、 多くの免疫学的研究から、動物の抗体は親和性の
点で同じ抗原に対するヒト抗体と対比できないことが明
らかにされている。
点で同じ抗原に対するヒト抗体と対比できないことが明
らかにされている。
へブテン結合試験自体、試験が行われる形では免疫グロ
ブリンのクラスを識別できないという問題がある。
ブリンのクラスを識別できないという問題がある。
しかも、報告されている形のハプテン結合試験は試験試
料にある物質、たとえば類似構造の遊離抗原また抗体で
簡単に妨害されてしまう。信頼性が低いのはこの種の物
質が可溶性抗体／ハプテン複合体の平衡状態に影響を与
える結果である。
料にある物質、たとえば類似構造の遊離抗原また抗体で
簡単に妨害されてしまう。信頼性が低いのはこの種の物
質が可溶性抗体／ハプテン複合体の平衡状態に影響を与
える結果である。
ペプチドグリカンに対する抗体の慣用検知方法としてハ
プテン結合試験を用いることの難点は、２５ 抗原標識用の 工に加えて内部標準として２２Ｎａを
使用することである。かなりの放射能で使用される二次
同位元素（２２，８１強力なβ線放射元素）は和学的研
究の場合には例外的に許されるとしても、このような慣
用試験への応用はすすめられない。
プテン結合試験を用いることの難点は、２５ 抗原標識用の 工に加えて内部標準として２２Ｎａを
使用することである。かなりの放射能で使用される二次
同位元素（２２，８１強力なβ線放射元素）は和学的研
究の場合には例外的に許されるとしても、このような慣
用試験への応用はすすめられない。
本発明はペプチドグリカンのペプチドサブユニットペプ
チドＬ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ−（Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌ
ａ−Ｄ−Ａｌａ）およυζこのペプチドグリカンを含有
するバクテリア細胞壁に対する免疫グロブリンＧクラス
がらの抗体、その製造方法および生物試験試料の中のそ
の抗体の、慣用的に応用できる定量方法に関する。
チドＬ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ−（Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌ
ａ−Ｄ−Ａｌａ）およυζこのペプチドグリカンを含有
するバクテリア細胞壁に対する免疫グロブリンＧクラス
がらの抗体、その製造方法および生物試験試料の中のそ
の抗体の、慣用的に応用できる定量方法に関する。
本発明の抗体は次の特徴を有する。
（ａ）一般式
％式％
（式中ＲはＧｌｙ、Ｌ−Ａｌａ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｌｙ
ｓがら選はれる１１１ｄから６個まで好ましくは６個の
アミノ酸構成要素であり、Ａ１はアミノ戯Ｄ −Ａｌａ
、Ｄ−８ｅｒ、Ｄ−ＶａｌまたはＤ−Ｌｅｕのひとつで
ある）で表されるペンタペプチドに対する特異的結合性 （ｂ）これらのペプチドを含有するグラム陽性バクテリ
アに対する結合性 本発明はざらにペプチドグリカンのペプチドサブユニッ
トペンタペプチドＬ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ（Ｌ−Ｌｙｓ
−Ｄ−Ａｌａ−トＡｌａ ）およびこれらのペンタペプ
チドに対する抗体の製造方法に関する。
ｓがら選はれる１１１ｄから６個まで好ましくは６個の
アミノ酸構成要素であり、Ａ１はアミノ戯Ｄ −Ａｌａ
、Ｄ−８ｅｒ、Ｄ−ＶａｌまたはＤ−Ｌｅｕのひとつで
ある）で表されるペンタペプチドに対する特異的結合性 （ｂ）これらのペプチドを含有するグラム陽性バクテリ
アに対する結合性 本発明はざらにペプチドグリカンのペプチドサブユニッ
トペンタペプチドＬ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ（Ｌ−Ｌｙｓ
−Ｄ−Ａｌａ−トＡｌａ ）およびこれらのペンタペプ
チドに対する抗体の製造方法に関する。
本発明はさらに生物試験試料中のペプチドグリカンのペ
プチドサブユニットペンタペプチドＬ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇ
ｌｕ（Ｌ−Ｉ＋ｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ ）に対
する抗体の定量方法に関する。この方法には二重抗体放
射免疫定量法、二重抗体酵素免疫定量法、比濁法、同相
サンドウィッチ放射免疫定量法、固＃Ｉ酵素定量法、同
相螢光免疫定量法およびラテックス沈降凝集法を採用す
ることができる。
プチドサブユニットペンタペプチドＬ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇ
ｌｕ（Ｌ−Ｉ＋ｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ ）に対
する抗体の定量方法に関する。この方法には二重抗体放
射免疫定量法、二重抗体酵素免疫定量法、比濁法、同相
サンドウィッチ放射免疫定量法、固＃Ｉ酵素定量法、同
相螢光免疫定量法およびラテックス沈降凝集法を採用す
ることができる。
抗体の定量
１、標品の調製
ペプチドサブユニットＬ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ（Ｌ−Ｌ
ｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ ）に対して特異性を有
する抗体の標準溶液は、この種の抗体が検知された患者
血清から親和性クロマトグラフィーによって得る（配列
Ｒ−Ｄ＝Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａのマトリックス結合ペプチ
ド）。
ｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ ）に対して特異性を有
する抗体の標準溶液は、この種の抗体が検知された患者
血清から親和性クロマトグラフィーによって得る（配列
Ｒ−Ｄ＝Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａのマトリックス結合ペプチ
ド）。
特異的抗体が親和性マトリックスに結合したのち緩衝液
で洗浄して非結合血清蛋白を除去する。固体マトリック
スに結合した抗体の溶出は配列Ｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａ
ｌａ のペプチドとの結合免疫グロブリンの特異的脱着
によって行われる。脱着は原理的に公知の方法、たとえ
ば低ＰＨ値または高濃度塩類の使用によって行われろ。
で洗浄して非結合血清蛋白を除去する。固体マトリック
スに結合した抗体の溶出は配列Ｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａ
ｌａ のペプチドとの結合免疫グロブリンの特異的脱着
によって行われる。脱着は原理的に公知の方法、たとえ
ば低ＰＨ値または高濃度塩類の使用によって行われろ。
緩挽液で透析したのち、ペプチドグリカンのペプチドサ
ブユニットに対する特異的抗体の含量は、精製分画の免
疫グロブリン含量によって定量ずろ。
ブユニットに対する特異的抗体の含量は、精製分画の免
疫グロブリン含量によって定量ずろ。
２、試験手順
ペプチドグリカンのペプチドサブユニットに対する各種
免疫グロブリンクラスの特異的抗体の定量は基本的に異
なる２種の方法で実施できる。
免疫グロブリンクラスの特異的抗体の定量は基本的に異
なる２種の方法で実施できる。
（ａ） 溶液系における定量（均一相での測定）（ｂ
） 不均一系における定量（不均一相での測定、同相
免疫定量法） ２．１．均一相における測定 ２、１．１．ペプチドグリカンのペプチドザブユニット
に対する抗体の二重抗体放射免疫定量法による定量 配列Ｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａのペプチドを放射標識
し、次式にしたがって試験混合物をｉ１ｇ製する。
） 不均一系における定量（不均一相での測定、同相
免疫定量法） ２．１．均一相における測定 ２、１．１．ペプチドグリカンのペプチドザブユニット
に対する抗体の二重抗体放射免疫定量法による定量 配列Ｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａのペプチドを放射標識
し、次式にしたがって試験混合物をｉ１ｇ製する。
＊Ｐｅｐｔ、 ＋ Ａｂ −＋ ＊Ｐｅｐｔ、 −Ａ
ｂ放射標識抗体結合抗原から放射標識遊離抗原の分離は
次式にしたがって二次抗体を用いる免疫グロブリンの特
異的沈降により、二重抗体法で行う。
ｂ放射標識抗体結合抗原から放射標識遊離抗原の分離は
次式にしたがって二次抗体を用いる免疫グロブリンの特
異的沈降により、二重抗体法で行う。
＊Ｐｅｐｔ、−Ａｂ＋Ａｎｔｉ−Ａｂ →＊Ｐｅｐｔ、
−Ａｂ −（Ａｎｔｉ−Ａｂ） −複合体 抗原の放射標識はたとえば （ａ）ペプチドのＮ末端にチロシンをカップリングしつ
いで常法により１２５工でヨード化する（ｂ）（Ｎ−ス
クシンイミジル−３−（４−ヒドロキシ−５−（１２５
工）ヨードフェニル）プロピオネートでヨード化する （０）Ｎ−スクシンイミジル（２，３−３Ｈ）プロピオ
ネートで抗原をトリチウム化する 等の方法で実施できる。
−Ａｂ −（Ａｎｔｉ−Ａｂ） −複合体 抗原の放射標識はたとえば （ａ）ペプチドのＮ末端にチロシンをカップリングしつ
いで常法により１２５工でヨード化する（ｂ）（Ｎ−ス
クシンイミジル−３−（４−ヒドロキシ−５−（１２５
工）ヨードフェニル）プロピオネートでヨード化する （０）Ｎ−スクシンイミジル（２，３−３Ｈ）プロピオ
ネートで抗原をトリチウム化する 等の方法で実施できる。
二次抗体の特異性を適当に選択することにより、免疫グ
ロブリンの異なるクラスたとえば工ｇＧ。
ロブリンの異なるクラスたとえば工ｇＧ。
１ｇＭ 等を別個に定置することもできる。
含まれている可能性があるペプチドグリカンに対する抗
体を除去するため、配列Ｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａの
マトリックス結合ペプチドに対し親和性クロマトグラフ
ィーを行い、抗抗体を精製することが好ましい。
体を除去するため、配列Ｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａの
マトリックス結合ペプチドに対し親和性クロマトグラフ
ィーを行い、抗抗体を精製することが好ましい。
２、１．２．ペラ０チドサブユニツトペンタペフ０チド
に対する抗体の二重抗体酵素免疫定量法による定量２、
１．１．における試験方法において、抗抗体の標品を放
射能に代えて酵素、たとえばアルカリホスファターゼ、
パーオキシダーゼ、グルコース−オキシダーゼ−パー副
キシダーゼ、グルコース−６−ホスフニートーデヒドロ
デナーゼ、マレードープヒトロケゞナーゼ等を用いて行
う。
に対する抗体の二重抗体酵素免疫定量法による定量２、
１．１．における試験方法において、抗抗体の標品を放
射能に代えて酵素、たとえばアルカリホスファターゼ、
パーオキシダーゼ、グルコース−オキシダーゼ−パー副
キシダーゼ、グルコース−６−ホスフニートーデヒドロ
デナーゼ、マレードープヒトロケゞナーゼ等を用いて行
う。
２１、ろ、ペプチドグリカンのペプチド−リブユニット
に幻する抗体の比濁法にょる定頃 配列Ｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＡｌａのペプチドをそのＮ末
端アミノ酸を介して可溶性マトリックス、たとえばプロ
ティン、ポリビニルピロリドン等に結合させ、試１１ｆ
ｉ ６」次式にしたがって行う。
に幻する抗体の比濁法にょる定頃 配列Ｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＡｌａのペプチドをそのＮ末
端アミノ酸を介して可溶性マトリックス、たとえばプロ
ティン、ポリビニルピロリドン等に結合させ、試１１ｆ
ｉ ６」次式にしたがって行う。
７トリツクスー（Ｐｅｐｔ、） ＋ Ａｂ −、＞マト
リックス−（Ｐｅｐｔ、） −Ａｂ−複合体白濁 担体イオ料へのペプチドのカップリングは、たとえば １、マトリックスへのヨードアセチル化ペプチドの結合 ２、カルボジイミド法 ６、二官能性試薬たとえばジインシアネート、グルタル
ジアルデヒド等を用いる方法 によって行われる。
リックス−（Ｐｅｐｔ、） −Ａｂ−複合体白濁 担体イオ料へのペプチドのカップリングは、たとえば １、マトリックスへのヨードアセチル化ペプチドの結合 ２、カルボジイミド法 ６、二官能性試薬たとえばジインシアネート、グルタル
ジアルデヒド等を用いる方法 によって行われる。
２．２．不均一相における測定
配列Ｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＡｌａのペプチドをＮ末端ア
ミン基を介して固体不溶性マトリックスたとえばろ紙、
プラスチックス、ラテックス等に結合させる。カップリ
ングは常法による。ペプチドはマトリックスに直接結合
させてもよいし、またいわゆるスペーサーをはさんで結
合させてもよい。この柚のスヘーサートしては脂肪族炭
化水素鎖、アルブミンのような蛋白、ＲＮａｓｅ等があ
る。
ミン基を介して固体不溶性マトリックスたとえばろ紙、
プラスチックス、ラテックス等に結合させる。カップリ
ングは常法による。ペプチドはマトリックスに直接結合
させてもよいし、またいわゆるスペーサーをはさんで結
合させてもよい。この柚のスヘーサートしては脂肪族炭
化水素鎖、アルブミンのような蛋白、ＲＮａｓｅ等があ
る。
２、２．１．ペプチドグリカンのペプチドサブユニット
ペプチドに対する抗体の同相サンドウィッチ放射免疫定
量法による定量 ２、２．２．ペプチドグリカンのベプチドサデュニット
ベプヂドに対する抗体の固相酵累放射免疫定量法による
定量 試験操作は抗抗体を放射能に代えて、２．１．２．と同
様、酵素で標識するほかは２．２．１．と同じである。
ペプチドに対する抗体の同相サンドウィッチ放射免疫定
量法による定量 ２、２．２．ペプチドグリカンのベプチドサデュニット
ベプヂドに対する抗体の固相酵累放射免疫定量法による
定量 試験操作は抗抗体を放射能に代えて、２．１．２．と同
様、酵素で標識するほかは２．２．１．と同じである。
２、２．３．ペプチドグリカンのペプチドサブユニット
ペプチドに対する抗体の固相螢光免疫定置法による定量 抗体を螢光染料（たとえばＦ工ＡＸ■−３ｔｉＱＴＭ系
）で標識するほかは２．２．１．と同様に操作する。
ペプチドに対する抗体の固相螢光免疫定置法による定量 抗体を螢光染料（たとえばＦ工ＡＸ■−３ｔｉＱＴＭ系
）で標識するほかは２．２．１．と同様に操作する。
２、２．４．ペプチドグリカンのペプチドサブユニット
ペプチドに対する抗体のラテックス凝集試験による定量 配列Ｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａのペプチドをラテック
ス粒子に直接またはプロティンのＪ、うなスペーサーを
介してカップリングさせる。
ペプチドに対する抗体のラテックス凝集試験による定量 配列Ｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａのペプチドをラテック
ス粒子に直接またはプロティンのＪ、うなスペーサーを
介してカップリングさせる。
２．１．および ２．２．に示した定量法においては、
定量は、１に記載の抗体標準溶液を用いてプロットした
検嵐曲線によって行う。
定量は、１に記載の抗体標準溶液を用いてプロットした
検嵐曲線によって行う。
ヘンタペプチドに対するクラスエｇＧ抗体の定徂例
１、抱合体の製造
０末端にＤ−Ａｌａを有する配列Ｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−
Ａｌａのペプチド、好ましくはＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ
−Ｄ−Ａｌａとヨードアセチルスクシンイミドエステル
の当モル量ヲ、１００ ｍｍｏｌ／ｊ！の炭酸水素ナト
リウムを含むジオキサン／水（／、Ｖ／Ｖ ）にとり、
おだやかに攪拌しながら２０時間、４°Ｃでインキュベ
ートする。ついでジオキサンを真空中で除法し、得られ
た反応生成物を水相からＨ（Ｊで酸性にして沈殿させる
。塩酸メジウム中で洗浄したのち、生成物を凍結乾燥す
る。
Ａｌａのペプチド、好ましくはＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ
−Ｄ−Ａｌａとヨードアセチルスクシンイミドエステル
の当モル量ヲ、１００ ｍｍｏｌ／ｊ！の炭酸水素ナト
リウムを含むジオキサン／水（／、Ｖ／Ｖ ）にとり、
おだやかに攪拌しながら２０時間、４°Ｃでインキュベ
ートする。ついでジオキサンを真空中で除法し、得られ
た反応生成物を水相からＨ（Ｊで酸性にして沈殿させる
。塩酸メジウム中で洗浄したのち、生成物を凍結乾燥す
る。
ヨードアセチル化ペプチｐ１ｏｏ〜と担体プロティン、
たとえばヒト血清アルブミン２５０１ｎｇをＱ、ｉｍＭ
炭酸水素ナトリウム含有８モル尿素溶液中、６７°Ｃで
７２時間インキュベートする。蒸留水に対して３日間透
析したのも（透析液は６回がえる）、アルブミンにカッ
プリングしたペプチドを凍結乾燥する。この方法で担体
プロティン１モルに対して平均１０モルのペプチドを共
有結合させることができる。
たとえばヒト血清アルブミン２５０１ｎｇをＱ、ｉｍＭ
炭酸水素ナトリウム含有８モル尿素溶液中、６７°Ｃで
７２時間インキュベートする。蒸留水に対して３日間透
析したのも（透析液は６回がえる）、アルブミンにカッ
プリングしたペプチドを凍結乾燥する。この方法で担体
プロティン１モルに対して平均１０モルのペプチドを共
有結合させることができる。
２、プラスチックス表面たとえばポリスチレンへの抱合
体の吸着 本例では容量２ ｍｌ ％高さ４ ｃｔｎ、径１ｃｒｎ
のポリスチレン管を用いた。結合には、類似プラスチッ
クス材料の微小滴定板、球、皿等を同様に適当である。
体の吸着 本例では容量２ ｍｌ ％高さ４ ｃｔｎ、径１ｃｒｎ
のポリスチレン管を用いた。結合には、類似プラスチッ
クス材料の微小滴定板、球、皿等を同様に適当である。
抱合体溶液（０，１モル重炭酸塩緩衝液、Ｐｆ４９−６
中抱合体５０ ｍｇに相当）１００μノを管にピペット
でとり、６７°Ｃで２４時間乾燥する。管をそれぞれ１
回、０．１％ＰＢＳ （！Ｊン酸緩衝食塩水）／ツずす
ぎ、吸σ１濾過する。抱合体でコーティングされた管は
３７℃で乾燥棚に保存する。
中抱合体５０ ｍｇに相当）１００μノを管にピペット
でとり、６７°Ｃで２４時間乾燥する。管をそれぞれ１
回、０．１％ＰＢＳ （！Ｊン酸緩衝食塩水）／ツずす
ぎ、吸σ１濾過する。抱合体でコーティングされた管は
３７℃で乾燥棚に保存する。
６、試験操作
ＰＢＳ／ツイーン８０緩衝液中にＩｇＧｏ、１μｇ〜１
０ ｐｇ（標品製造の項参照）を含有する特異的標準溶
液１００μＺをピペットで、上述のコーテイング管にと
り、２０°Ｃで１時間インキュベートする。標準曲線の
測定範囲内に入るように、生物試料サンプルたとえば患
者血清をその方何に応じて１ ：５〜１ ： ２ＤＤＤ
ｋ：ｐＢｓ／ツ（−ンＳＯで希釈し、同容量使用する。
０ ｐｇ（標品製造の項参照）を含有する特異的標準溶
液１００μＺをピペットで、上述のコーテイング管にと
り、２０°Ｃで１時間インキュベートする。標準曲線の
測定範囲内に入るように、生物試料サンプルたとえば患
者血清をその方何に応じて１ ：５〜１ ： ２ＤＤＤ
ｋ：ｐＢｓ／ツ（−ンＳＯで希釈し、同容量使用する。
インキュベーション混合物を吸す１濾過し、ついでＰＢ
Ｓ／ツイーン８ｏ緩衝液２００ ｐＨで２回洗浄し、再
び吸引濾過する。
Ｓ／ツイーン８ｏ緩衝液２００ ｐＨで２回洗浄し、再
び吸引濾過する。
パーオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼで標識
した（抗ヒトｘｇａ）免疫グロブリン（たとえばヤギか
ら得る）１ｏＯμｌをピペットで管にとり、２０℃、２
５℃または６７℃の一定温度で１時間インキュベートす
る。管を各回２０ ｐＨのＰＥＳ／ツイーン緩衝液で２
回洗浄する。指示系として抱合パーオキシダーゼを用い
た場合は、基質としてクエンｓａ衝液（０，１ｍａｔ：
／ｌｌ １ｐＨ５−０）巾０−フェニレンジアミンおよ
びＨ２Ｏ，ヲ加え、管を恒温で１５分間インキュベート
する。
した（抗ヒトｘｇａ）免疫グロブリン（たとえばヤギか
ら得る）１ｏＯμｌをピペットで管にとり、２０℃、２
５℃または６７℃の一定温度で１時間インキュベートす
る。管を各回２０ ｐＨのＰＥＳ／ツイーン緩衝液で２
回洗浄する。指示系として抱合パーオキシダーゼを用い
た場合は、基質としてクエンｓａ衝液（０，１ｍａｔ：
／ｌｌ １ｐＨ５−０）巾０−フェニレンジアミンおよ
びＨ２Ｏ，ヲ加え、管を恒温で１５分間インキュベート
する。
反応の停止には５ Ｎ Ｈ２ＢＯ３５０ｐＨを加える。
４９２ ｎｍにおける吸収は使用した免疫グロブリンの
量に比例する。
量に比例する。
ヒト血清には１ｄ中１μｇ〜１ダの範囲の濃度で定量さ
れろ。
れろ。
特異重工ｇＧ定凰の変動係数は検量曲線の中央付近で６
．６％である。
．６％である。
特異的ヒト免疫グロブリンＧ標品の調製１、アルブミン
−Ｄ −ＡＩＩＬ −３抱合体のセファロース４ｂへの
カップリング 合成は試験の項に述べたと同様に実施する。
−Ｄ −ＡＩＩＬ −３抱合体のセファロース４ｂへの
カップリング 合成は試験の項に述べたと同様に実施する。
１０ｍ６のセファロ−スプルを４〜５倍過剰の蒸留水で
５回洗浄し、水１０ｍ＃に懸濁する。これに水８ ｍ／
！に溶解したプロモシアノゲン４３０■を加えろ。反応
は室温で起こる。ＰＨは水酸化ナトリウム溶液（２ｍｏ
：Ｌ／ｌ）を加えて常に１１．０に維持すムおだやかに
攪拌しながら１５分間反応させ、ゲルをブフナ〜濾斗上
で吸引濾過し、炭酸水素ナトリウム（０，１ｍｏＩ／
ｌ）溶液６０ｍ１で洗浄する。セファロースを、アルブ
ミン−Ｄ −Ａｌａ −５ｔｆ＆合体５０ ｍＶを含有
する炭酸水素ナトリウム（０，１ｍｏＶｌ）７−５ａｌ
中に攪拌しながら注ぐ。−夜４℃でおだやかに攪拌して
カップリングを行う。反応終了径、物質を再び吸引濾過
し、カップリングしたゲルを以下の洗液で各２回洗浄す
る。水３ｏ〜４０ｄ、炭酸水素ナトリウム（０，１ｍｏ
Ｉｉ／ｌ）、０．２ ｍｏｕｌｔ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ４，５）、０．２ ｍｏｆ／ｌ！１ン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７−２）および０．０１ｍｏＩＡＰＢＳ
（ｐＨ７，２）である。親和性デルはＰＢＳ緩衝液（
ｐｉ（７，２）に４℃でとる。
５回洗浄し、水１０ｍ＃に懸濁する。これに水８ ｍ／
！に溶解したプロモシアノゲン４３０■を加えろ。反応
は室温で起こる。ＰＨは水酸化ナトリウム溶液（２ｍｏ
：Ｌ／ｌ）を加えて常に１１．０に維持すムおだやかに
攪拌しながら１５分間反応させ、ゲルをブフナ〜濾斗上
で吸引濾過し、炭酸水素ナトリウム（０，１ｍｏＩ／
ｌ）溶液６０ｍ１で洗浄する。セファロースを、アルブ
ミン−Ｄ −Ａｌａ −５ｔｆ＆合体５０ ｍＶを含有
する炭酸水素ナトリウム（０，１ｍｏＶｌ）７−５ａｌ
中に攪拌しながら注ぐ。−夜４℃でおだやかに攪拌して
カップリングを行う。反応終了径、物質を再び吸引濾過
し、カップリングしたゲルを以下の洗液で各２回洗浄す
る。水３ｏ〜４０ｄ、炭酸水素ナトリウム（０，１ｍｏ
Ｉｉ／ｌ）、０．２ ｍｏｕｌｔ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ４，５）、０．２ ｍｏｆ／ｌ！１ン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７−２）および０．０１ｍｏＩＡＰＢＳ
（ｐＨ７，２）である。親和性デルはＰＢＳ緩衝液（
ｐｉ（７，２）に４℃でとる。
２、親和性クロマトグラフィー操作
ゲルを適当なカラムに置き、抗体または濃縮免疫グロブ
リン分画を含む血清を加える。カラムをＰＢＳ緩衝液（
ツイーンを含まない）で、溶出液の２８０ ｎｍにおけ
る吸収が０．０３以下（血清の約２倍の緩衝液を消費）
に低下するまで洗浄する。
リン分画を含む血清を加える。カラムをＰＢＳ緩衝液（
ツイーンを含まない）で、溶出液の２８０ ｎｍにおけ
る吸収が０．０３以下（血清の約２倍の緩衝液を消費）
に低下するまで洗浄する。
溶出は酢酸（０，１〜１ ｍｏ１／ｌ ）で実施する。
抗体は酢酸の最初の分画に溶出する。抗体を含む分画を
合し、中和する。溶出液を合して、十分な量のＰＢ８で
透析し、濃縮し、ついで七ファデックスＧ２００上クロ
マトグラフィーに付す。
合し、中和する。溶出液を合して、十分な量のＰＢ８で
透析し、濃縮し、ついで七ファデックスＧ２００上クロ
マトグラフィーに付す。
６、抗体分画の特性
２８ ＯｒＬｍで測定すると、目盛内セファデックスＧ
２００カラムから精製免疫グロブリンは対称なピークと
して溶出した。この分画の分子量は約１５０．０００で
あった。分子量および均一性は２８０ ｎｍの紫外部吸
収を測定し、分析超遠心法でチェックした。７°０ナイ
ンは均一なバンドとして沈降した。標準条件における５
２０Ｗは７．８であった。セルロースアセタール電気泳
動において、γ−グロブリンの領域に均一なバンドが得
られた。
２００カラムから精製免疫グロブリンは対称なピークと
して溶出した。この分画の分子量は約１５０．０００で
あった。分子量および均一性は２８０ ｎｍの紫外部吸
収を測定し、分析超遠心法でチェックした。７°０ナイ
ンは均一なバンドとして沈降した。標準条件における５
２０Ｗは７．８であった。セルロースアセタール電気泳
動において、γ−グロブリンの領域に均一なバンドが得
られた。
免疫電気泳動では、多価抗血清を用いた場合、免疫りｏ
７／ＩＪンａ領域に沈降線が認められた。
７／ＩＪンａ領域に沈降線が認められた。
図面はペンタペプチドＲ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａに対
する特異的免疫グロブリンａ （ｘｇａ ）の定量用の
検量曲線の一例である。インディケータ−としてはパー
オキシダーゼ系を用いた。精製特異重工ｇＧの濃度に対
し、４９２ｍｍにおける吸収をプロットしたものである
。 代理人 浅 村 皓 図面の浄書（内容に変更なし） 遁 Ｌ （Ｐｇ／ｍＬ） 第１頁の続き くユ発 明 者 ルドウイッグ・ヴアイスドイツ連邦共
和国ミュンヘン９０ ハウベリザー・ストラーセ７ 手続補正書（方式） ％式％ １６事件の表示 昭和５８ 年特許願第 １５１４７１ 号２、発
明の名称 ３、補正をする者 事件との関係 特Ｘ（出願人 昭和５８年 １１月 ２９日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 図面の浄−Ｕ （内容に変更なし） ８、補正の内容 別紙のとおり 一３４ダ ）
する特異的免疫グロブリンａ （ｘｇａ ）の定量用の
検量曲線の一例である。インディケータ−としてはパー
オキシダーゼ系を用いた。精製特異重工ｇＧの濃度に対
し、４９２ｍｍにおける吸収をプロットしたものである
。 代理人 浅 村 皓 図面の浄書（内容に変更なし） 遁 Ｌ （Ｐｇ／ｍＬ） 第１頁の続き くユ発 明 者 ルドウイッグ・ヴアイスドイツ連邦共
和国ミュンヘン９０ ハウベリザー・ストラーセ７ 手続補正書（方式） ％式％ １６事件の表示 昭和５８ 年特許願第 １５１４７１ 号２、発
明の名称 ３、補正をする者 事件との関係 特Ｘ（出願人 昭和５８年 １１月 ２９日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 図面の浄−Ｕ （内容に変更なし） ８、補正の内容 別紙のとおり 一３４ダ ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （］、） （ａ）一般式 ％式％（） （式中ＲはＧｌｙ 、 Ｌ−Ａｌａ 、 Ｄ−Ｇｌｕ
、 Ｌ−Ｌｙｓから選はれる１個から６個まで好ましく
は６個のアミノ酸をもったアミノ酸構成要素であり、Ａ
１ はアミノ酸Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−３ｅｒ、Ｄ−Ｖａｌま
たはＤ−ＬＱｕのひとつである）で表されるペンタペプ
チドに対する特異的結合、（ｂ）一般式Ｉのペンタペプ
チドを含有する単離バクテリア細胞壁に対する特異的結
合、または（ｃ） 一般式■のペンタペプチドを含有す
るグラム陽性バクテリアに対する特異的結合を特徴とす
る、生物試験試料中のペプチドグリカンのペプチドサブ
ユニットであるペンタペプチドＬ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ
−（Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ） 、および
これらのペプチドグリカンを含有する細菌細胞壁に対す
る免疫グロブリンＧのクラスからの抗体。 （２、特許請求の範囲第１項の一般式■のペンタペプチ
ドをそれ自体公知の方法で固相にカップリングさせ、こ
の形で、沈降反応によって濃縮したヒト血漿の免疫グロ
ブリン分画からの免疫グロブリンＧクラスの特異的抗体
の選択的結合および選択的溶出に使用することを特徴と
するペプチドグリカンのペプチドサブユニットであるペ
ンタペラ０チドＬ−Ａｌａ−Ｄ−（）ｌｕ （Ｌ−Ｌｙ
ｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ ）およびこれらのペプチ
ドグリカンを含有する細胞壁に対する抗体の製造方法。 （３）抗原として一般式 ％式％（１） （式中ＲはＧｌｙ、Ｌ−Ａｌａ、 Ｄ−Ｇｌｕ、 Ｌ−
Ｌｙｓから選はれる１個から６個まで好ましくは６個の
アミノ酸をもった構成要素であり、Ａエ はアミノ酸Ｄ
−Ａｌａ＋Ｄ−８ｅｒ、Ｄ−ＶａｌまたはＤ−ＬＱｕの
ひとつである）で表される化合物を用いることを特徴と
し、それ自体公知の免疫化学的方法による、生物試験試
料中のペプチドグリカンのペプチドサブユニットである
ペンタペプチドＬ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ （Ｉ＋−Ｌｙ
ｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、）に対する免疫グロブリ
ンＧクラスからの抗体の定に方法。 （４）抗体の定量は二重抗体放射免疫法による特許１ｊ
ｌＷ求の範囲第６項記載の定量方法。 （Ｆ’ｊ） Ｕｊ体の定量は二重抗体酵素免疫法によ
る特許請求の範囲第５項記載の定量方法。 （６）抗体の定量は比濁法を用いて行う特許請求の範囲
第６項記載の定量方法。 （力 抗体の定量は同相サンドウィッチ放射免疫法によ
って行う特許請求の範囲第６項記載の定量方法。 （８）抗体の定量は面相酵素免疫法によって行う特１１
１請求の範囲第６項記載の定量方法。 （９）抗体の定量は固相螢光免疫法によって行う特許請
求の範囲第３項記載の定量方法。 ００）抗体の定量はラテックス凝集試験によって行う特
許ｈ１′１求の範囲第３項記載の定量方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19823231204 DE3231204A1 (de) | 1982-08-21 | 1982-08-21 | Antikoerper gegen bakterielle peptidoglycane, verfahren zu ihrer herstellung und methoden zu ihrer quantitativen bestimmung |
| DE32312040 | 1982-08-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5990055A true JPS5990055A (ja) | 1984-05-24 |
Family
ID=6171441
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58151471A Pending JPS5990055A (ja) | 1982-08-21 | 1983-08-19 | 抗体、その製造方法およびその定量方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0101886A3 (ja) |
| JP (1) | JPS5990055A (ja) |
| AU (1) | AU557044B2 (ja) |
| CA (1) | CA1218299A (ja) |
| DE (1) | DE3231204A1 (ja) |
| IL (1) | IL69531A (ja) |
| ZA (1) | ZA836125B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6170463A (ja) * | 1984-09-14 | 1986-04-11 | Medekusu:Kk | リウマチ特異蛋白質の精製方法 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3328832A1 (de) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Boehringer Ingelheim Diagnostika GmbH, 8046 Garching | Reagenz und verfahren zur quantitativen bestimmung von antikoerpern |
| DE3402739A1 (de) * | 1984-01-27 | 1985-08-01 | Boehringer Ingelheim Diagnostika GmbH, 8046 Garching | Antikoerper gegen den glycanstrang des peptidoglycans, verfahren und reagenzien zu ihrer herstellung und methoden zu ihrer quantitativen bestimmung |
| DE3580882D1 (de) * | 1984-09-14 | 1991-01-24 | Asahi Medical Co | Ein im wesentlichen reines fuer rheumatoide arthritis spezifisches protein und ein antikoerper dagegen. |
| DE102010048382B4 (de) * | 2010-10-13 | 2012-07-12 | Vag-Armaturen Gmbh | Korrosionsgeschützte Armatur |
| WO2020118042A1 (en) | 2018-12-05 | 2020-06-11 | Jacobs Wagner Christine | Borrelia burgdorferi peptidoglycan as a diagnostic and target for therapeutic intervention of lyme disease-related pathologies |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3966898A (en) * | 1973-06-28 | 1976-06-29 | Pharmacia Diagnostics Ab | Method and reagent for determining immunologic materials |
-
1982
- 1982-08-21 DE DE19823231204 patent/DE3231204A1/de not_active Withdrawn
-
1983
- 1983-07-20 EP EP83107087A patent/EP0101886A3/de not_active Withdrawn
- 1983-08-19 CA CA000434968A patent/CA1218299A/en not_active Expired
- 1983-08-19 AU AU18136/83A patent/AU557044B2/en not_active Ceased
- 1983-08-19 JP JP58151471A patent/JPS5990055A/ja active Pending
- 1983-08-19 IL IL69531A patent/IL69531A/xx unknown
- 1983-08-19 ZA ZA836125A patent/ZA836125B/xx unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6170463A (ja) * | 1984-09-14 | 1986-04-11 | Medekusu:Kk | リウマチ特異蛋白質の精製方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3231204A1 (de) | 1984-03-01 |
| IL69531A (en) | 1987-10-30 |
| EP0101886A3 (de) | 1986-07-02 |
| ZA836125B (en) | 1985-04-24 |
| EP0101886A2 (de) | 1984-03-07 |
| IL69531A0 (en) | 1983-11-30 |
| AU1813683A (en) | 1984-02-23 |
| CA1218299A (en) | 1987-02-24 |
| AU557044B2 (en) | 1986-12-04 |
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