JPS5991880A - 組織培養及び細胞増殖の促進物質及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｖｉｔｒｏ　）で培養するだめの、組織培養基礎培地へ
の補足物質として用いられる新規な、細胞増殖促進物質
及びその製法に関連する。さらに詳しくは、成牛、子牛
又は牛脂児の血餅からの、インビートロでの動物細胞培
養の基礎培地への補足物質としての増殖促進物質から成
る滑剤に関する。

多年にわたり、科学者は、完全に化学的に合成された培
養培地中で動物細胞を増殖せしめる努力をして来た。し
かしながら、十分な増殖のためには、はとんど全ての動
物細胞は合成基礎培地を必要とするばかりでなく、さら
にその上に天然産の生物体液又は組織抽出物の補足が必
要である。これら複雑な補足物質はリンパ液、胎児抽出
物、を髄液、脱脂乳、初乳、血ショウ、又は血清などか
ら成っている。その効力、入手し易さ、安定性の理由で
牛血清、特に牛胎児血清が細胞培養の補足物質として広
く用いられるようになった。ＦＢＳとして知られる牛胎
児血清は、研究、診断、医用及び獣医用の生物学的製剤
の製造等の分野で多量に補足物質として用いられている
。

北米において内包装工業に関連した数社の大企業及び多
くの中小企業は、合計で１年に概算１５０．０００リツ
トルの牛胎児血清を生産している。この血清量は約３０
０．０００リツトル以上の胎児全面から生産される。全
血から血清を得る工程では、如伺なる規模においても血
清の収率は全血の４５〜５０チ容量にすぎない。

牛血清は一般に、注意深く採血し、集めた、成牛、子牛
、牛脂児の全血から生産される。

自然凝血プロセスでは４℃で数時間凝塊させる。血清を
分離し、残渣の血餅を捨てる。

（例えば米国特許番号３．４２９．８６７に記載）。

しかしながら、厳密な牛の血液採集条件でないかぎり、
屠殺時に流血を取る場合のように、全く異った血餅が形
成する。この場合、牛の死体の瀉血の間に、切断した頚
から組織ジュースが、流れ落ちる血液に混合し、その混
合物は直ちにゴム状、半固形の処理困難な塊になる。こ
のような屠殺血餅は屠殺場では廃棄されているけれども
、これは、本発明によれば非常に良好な増殖促進物質源
である。それ故従来の血清製造工程の残渣の牛血餅のみ
ならず層殺牛血餅もいずれも本発明における出発物質で
ある。

本発明者らは、牛屠殺での牛血清の製造時に得られ従来
は捨てられていた血餅物質を処理して、組織培養培地の
補足物質用としてＦＢＳと比べても良好な細胞増殖促進
性を有する、効力のある増殖促進物質を取り出せる事を
発見した。さらに、この新しく発見した物質は、補足物
質としてそれだけで用いる事が出来るばかりでな（ＦＢ
Ｓと併用し、それにより胎児の全面からの収率を大巾に
増やす事が出来る。又それは成牛血清又は成牛血餅抽出
物その他の補足物質と併用することも出来る。

またさらにこの新規補足物質を成牛、子牛、牛胎児の血
餅から別々に得て、必要に応じて組合わせて用いること
もでき、あるいは種々の型の血餅を混合してから抽出す
ることもできる。

本発明によれば、凝塊化した全血の場合も、血清分離後
の血餅の場合においても、成牛、子牛あるいは胎児のい
ずれのものであっても（７） その凝塊化した物質の処理により血中に存在する増殖促
進物質を最適な割合で得る事が出来る事を発見した。凝
塊した全血を用いる場合、血清を分離するための凝塊化
を遅らせる注意を払わずにすぐに凝血させてよく、この
方法によれば１回の操作で血清及び凝血物質中に存在す
る増殖促進含有物を得る事が出来る事を発見した。血清
を別に血餅から分離して生産する場合には、血清を分離
し取り出すために、凝塊、化が早すぎないように手段を
とる必要がある。分離された血餅を、本発明に従って処
理する。

このように、本発明に従えば、最初の血量の４０〜５０
チの効力ある増殖促進物を牛血餅から、得る事の出来る
方法を発見した。この増殖促進物質は、その２０−２５
％が、血餅内に閉じこめられた分離不能の血清からで、
他の２０−２５１け血餅内に存在し、固有の従来使われ
なかった増殖促進因子から成る。

本発明の増殖促進物質は１種以上の増殖因子（θ （付着、同化作用及び細胞分裂を促進する化学物質）を
もち、細胞増殖を促進するため相乗的に働くものとみら
れる。本発明に従って製造した増殖促進物質は更に濃縮
又は精製することなく細胞培地の補足物質として直接用
いる事が出来る。

工業的に行なうには、成牛又は子牛全面を生存動物（血
液提供動物）からでもあるいは層殺場での屠殺動物から
でも集める事が出来る。しかし牛胎児全血は健康な妊娠
中の胎児から層殺場でしか得られない。新鮮な全血を、
５００−又は他の大きさの無菌のバキュテイナー血液容
器中に無菌的に採取する。数時間で自然の凝塊化が完了
したら直ちに容器を冷却する。血清を最初に分離する必
要のある場合、無菌の凝塊化した血ｉｔ採血瓶中で約１
５０ＯＲ，Ｐ、Ｍ、　　で遠心分離する。最初の全血の
５０俤容量の上清の血清を、遠沈血餅から吸収し゛て取
り、従来から知られた方法で更に次の工程に用いる。残
部の牛血餅は従来最初の採血容器中に廃棄していたが、
これｔｉｔ、本発明の出発物質Ｙ６る。

一方、牛血清生産が主たる目的ではない場合、屠殺した
成牛又は子牛の全血を単に衛生的条件下で集めればよく
、得られた、血清製造の実現性のない血餅も本発明にお
いてまた同様に良好な出発材料である。

ｐＨ７，２〜７．４に緩衝化した無菌生理食塩水１容量
を１容量の血餅に加え、粉砕混合し、４℃で２４〜４８
時間保存すると、増殖促進物質に富んだ懸濁液が得られ
る。すなわち、血餅退縮、離液、緩衝化食塩水中への拡
散を用いた本発明により、血餅に閉じこめられた血清及
び血餅固有の増殖因子が溶液中に移行する。４℃で２４
〜２８時間保存後、浸出液を約１５０　ＯＲ，Ｐ、Ｍで
遠心分離し、上清の増殖促進物質を無菌的に吸引して取
り出し次の工程に用い墨。収率を最高にするため、遠心
沈降、粉砕した残渣を、再び同様に抽出する。

最初の抽出で得られた上清のタンパク質含量は常に、対
応する血清タンパク質含量の約５０チ以下である。最初
及び２回目の抽出から得た上清のタンパク質含量は対応
する血清タンパク質含量より７５チ以下であるが、これ
を無菌的に合わせ、次の工程に用いるまで冷凍保存する
。血餅遠心沈降物の第３回目の抽出を試みだが、実用的
価値はなかった。

出発物質（牛血餅）の適当な粉砕が極めて重要である事
が判明した。緩衝化食塩水で血餅そのままを浸出するの
では効果がない。無菌ナイフ、ワーリングブレンダー（
ＷａｒｉｎｇＢｌｅｎｄｅｒ　）の使用、凍結−融解の
くりかえし等では赤血球細胞から溶液中に多量のヘモグ
ロビンが溶出してしまう。ステンレススチール線を用い
ると血餅が良く崩壊し、赤血球が壊れにくい。結局、血
餅粉砕に用いる方法は種々のスピードを出せる攪拌モー
ターに付けた小さなステンレススチール製泡立て（料理
人又は台所用）を用いるものである。血餅を無菌リン酸
塩緩衝化食塩水でうすめて後、（１１） 直ちに血餅を無菌泡立てを低速にて高トルクですばやく
粉砕する。又、ワイヤースクリーンを用いる事が出来る
。こうして、するどい刃の切断具は用いる事が出来ず、
丸い刃の切断具が必要である事が判明した。

種々の浸出媒体も試みられた。新鮮な、無菌蒸留水は過
度の溶血を起とし多くのヘモグロビンを放出する事にな
る。生理食塩水（０，９チ塩化ナトリウム）が良好であ
り、最も効果のある浸出媒体は、ダルベツコ（Ｄｕｌｂ
ｅｃｃｏ　）　％によりＪ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、９９．１
６７　（１９５４）に報告されたよりなｐｎ７〜９、よ
り好ましくはｐｎ７．２〜７．４のリン酸塩緩衝化食塩
水である。

このように調節した塩溶液をオートクレーブ処理又はさ
らに好ましくは０．２２ミクロン膜又はカートリッジを
用いる加圧濾過によって無菌化する。無菌のリン酸緩衝
化食塩水を大きな容器から、遠沈血餅を含む容器中へす
ばやく分配する。上述の如く完全な混合粉砕が同時に実
施出来る。容器を層流下で密封し浸（１２） 出の間４℃にする。

数個あるいは数百個の容器を４℃での浸出゛のために用
いることが出来る。容器はベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ
）　Ｊ　−６Ｂ型又はインターナショナル２に型遠心機
中、約１５０　ＯＲ，Ｐ、Ｍ、で遠心分離する。遠心分
離後、常法に従い、上清の増殖促進物質を４リツトルの
血清容器中に無菌的に吸引して取る。４リツトル容器の
含有物を混合し、必要とするサブロツ、ト試験のため５
０ゴ試料を取る。残りの約３．５リツトルを一２０℃で
、１マスタ一ロフト分として十分量蓄積するまで（約１
００〜２５０リツトル）凍結保存する。遠心沈降物を等
量のリン酸緩衝化食塩水で再抽出し、操作をくり返して
、増殖促進物質の収率を最高にする。

数百個の浸出瓶を遠心しなければならないときには血液
容器中の含有物を無菌的に、無菌タンク（ステンレスス
チール製）に移し連続的遠心分離を行ない透明にする。

無菌の上清を、他のタンクに取り、上述の如く検定試験
のためサンプリングする。多量のプールを最終工程のた
め一２０℃で保存し、遠心沈降物を等量のリン酸緩衝化
食塩水でもう１回抽出し同操作をくり返す。

最終工程は中規模でも大規模でも方法は同じである。最
終のプールを混合し、ｐｎと容量オスモル濃度（ｏｓｍ
ｏｌａｒｉｔｙ　）をチェックし上述のプールを、連続
的にザイッ・タイプ・デプス・フィルター（５ｅｉｔｚ
　ｔｙｐｅ　ｄｅｐｔｈｆｉｌｔｅｒ）で加圧濾過して
透明にする。次にゲルマン（Ｑｅｌｍａｎ）　８．０〜
０．４５ミクロン「血清」カートリッジの如きひだ付き
濾過膜を用いて濾過し、最後にボール（ＰａｌＪ）膜０
．２２ミクロンカートリッジ中を通過させて無菌タンク
中に入れる。最後に、タンクにたまった多量の増殖促進
物質は必要とする試験のため、サンプリングの後、無菌
のタイプ■のガラス容器中に、常法に従い、適当量完売
てんする。最終生成物は光学的透明、赤色、等張であり
、タンパク質含量は約２〜３　％　ｗ／ｖである。

そこで、要約すると、牛胎児血餅を包含する牛血餅から
細胞増殖物質を無菌的に製造する良好の方法は以下のこ
とを含んでいる。

１、ｐｌ＋　７．２〜７．４のリン酸塩緩衝化食塩水１
容量の牛血餅に加える。

２、　血餅又は凝塊物を機械的に粉砕し混合する。

３．４℃で２４〜４８時間浸出する。

４、　１５０　ＯＲ，Ｐ、Ｍで４５分間遠心分離する。

５、増殖促進物質を吸引して取る（上清液）６、遠沈物
を上述工程１．２．３に従って再抽出する。

７、　上清を無菌サブロットプールとして合併し、−２
０℃に保存する。

８、　サブロットの一部を取り検定する。

９、最終プール中に適合するサブロットを合併し、ザイ
ツ・フィルター、ゲルマン膜、ボール膜又はカートリッ
ジで順次に濾過して、無菌透明化する。

１０　最終プールを、必要とする試験のため、（１５） サンプリングし、タイプニガラス容器に充てんし、使用
時まで一２０℃で保存する。

これらの方法によ沙、文献で記述されている方法によっ
て得られない特性を持つ、増殖促進物質が得られる。上
述の如く製造した独特の細胞増殖促進物質を含む、異質
物質の無い組成物は、同じ全血から製造した対応する血
清又は多くの市販の良血清よりずっとすぐれた増殖促進
活性を有する。（等タンパク質量基準）。

種々の型の細胞増殖促進活性を有する本組成物の効力と
特性を後述の如く、物理的、化学的実験及び組織培養実
験で示す。成牛、子牛、胎児血餅由来の新規増殖促進組
成物を用いて細胞増殖比較試験を行った。基準として同
一の牛全血由来の相当する血清、又は、異種の牛胎児血
清の最良品を、同じ基礎培地中で用いた。用いた代表的
な検定細胞は、サルの轟細胞、ヒトニ培体細胞ＷＩ−３
８株、ベロ・モンキー（Ｖｅｒｏ　ｍｏｎｋｅｙ）腎細
胞株である。

（１６） 代表的な栄養合成培地、ＣＭＲＬ−１９６９゜ｔヒーリ
ー（Ｍｅａｌｙ　）等、アプライド・マイクロバイオロ
ジー（ＡＩ）ｐｌ、Ｍ％ｅｒｏｂｉｏｌ　、）　、　２
１　：　１　。

１９７１［ＣＭＲＬ−１９６９，コンノート・ラボラト
リ−社（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ　Ｌｔｄ、）。

トロント、オンタリオにて入手〕〕を実験を通じて使用
した。細胞増殖促進物質はコード番号を付け、細胞系に
用いる協力研究室に送られた事を注目されたい。これら
の研究室の報告によると、イーグル（Ｅａｇ　１　ｅ　
）の最小必須培地（ＭＥＭ）［市販で入手出来る。例え
ば、グランド・アイランド・バイオロジカル社（Ｇｒａ
ｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏ、、
ＧｒａｎｄＩ　ｓ　］　ａｎｄ、　Ｎ、Ｙ−）又はケー
・シー・パイｉ℃シカル社（Ｋ、Ｃ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｉｎｃ、、Ｌｅｎｎｏｘ、Ｋａｎｓａｓ））を用
い、他の細胞型において同様の結果が得られた。文献記
載の他の基礎培地も用いることができる。例えばボール
（Ｐａｕｌ）著「セル・アンド・ティッシエ・カルチア
Ｊ（Ｃｅｌｌａｎｄ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）
　Ｊ第５版、〔イー・アンド・ニス・リビングストン社
、ニシンバラ（Ｅ、ａｎｄ　Ｓ、Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ
　Ｌｔｄ、、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ））１９７５年第■章
及び付録Ｉに記載されている。

我々自身の研究室で行４７をここに記載する増殖定量試
験において、２５ｄコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ　）組
織培養フラスコに各々２５０、０００細胞数を用いた。

培養フラスコは各々の処理について３箇宛作製した。こ
の各処理とは、基礎培地ＣＭＲＬ−１９６９（添加物な
し、対照）：基礎培地ＣＭＲＬ＋２０１血餅抽出物：基
礎培地ＣＭＲＬ−１９６９＋１０％牛血清である。３７
℃で７日間培養後、各培養物を常法によって取り、細胞
数を測定する。次に７日間の細胞数の増加項数を計算す
る。表と記号説明は自明の事である。以下の実施例は本
発明を例示しているが、これに限定するものと解釈すべ
きではない。

実施例　１ 本実施例は次の事に関連する。

１、本発明による、同一の牛全面から製した成牛血清及
び成牛血餅抽出増殖促進物質（血餅の第１回抽出物）の
比較。

２、　サル腎初代細胞（上皮細胞）を用い、基礎培地Ｃ
ＭＲＬ−１．９６９中これら補足物質を加えた場合の増
殖比較。

注：成牛全血１０．５リツトルから４．９１Ｊツトルの
成牛血清を得た。（全タン／＜り質６１φ）。

増殖促進物質の収量（血餅の第１回抽 出物）は、５リツトル（全タンパク質 ３．０チｗ／ｖ　）。（血餅の第２回抽出は行わなかっ
た）。

表　　１ 成牛血清及び成牛血餅抽出物を用いた基礎培地中（ＣＭ
ＲＬ−１９６９）サル腎初代細胞（Ｃｅｒｏｃｏｐｉｔ
ｈｅｃｕｓ　ａｅｔｈｊｏｐｓ　）の７日間の培養によ
る平均収量 （１９） ９０％　　　成牛血清　　　　　　　、、６ｘ１０係 ８０％　　　成牛血餅抽出物　　　。□、。、２０チ条 黄　血餅抽出物の容量（３ｇ）タンパク質）、補足物質
は全血清容量（６％タンパク質で１０−）に対して当量
に調節する。

実施例　■ 本実施例は次の事に関連する。

１、本発明に従い、同一の成牛全血から製造した増殖促
進物質（血餅と第１回の抽出物）と、胎児血清、成牛血
清の比較。

２、　ヒト二倍体細胞ＷＩ−３８（線繊芽細胞）を用い
、同じ基本培地中、３種の量での補足物で得られる増殖
比較。

注：Ａ＝牛脂児血清４％全タンパク質 Ｂ−成牛血清７チ全タンパク質 Ｃ−成牛血餅抽出物３．５チ全タンパク質（２０） 表　　２ 基礎培地ＣＭＲＬ−１９６９のみ、及び種々の補足物質
を加えたＣＭＲＬ−１９６９中でのＷＩ−３８細胞の増
殖。各培養基は、２Ｘ１０’細胞数／フラスコ（２５ｃ
ｎｌ）を接種し、３７℃で培養し、６日後に細胞数測定
。

Ａ　　９８％　　　　２　　　　２　　　４．９Ｘ９５
％　　　　５　　　　３　　　１２．９Ｘ９０チ　　　
　１０　　　　３　　　２０．２ＸＢ　　９８チ　　　
　２　　　　３　　　７．８Ｘ９５％　　　　５　　　
　３　　　１１．１Ｘ９０％　　　１０　　　　３　　
　３１．５ＸＢ０％　　　　２０　　　　３　　　３６
．０Ｘ１００チ　　　　０　　　　１　　　　１．４Ｘ
餐血餅抽出物量は、その低蛋白含量を補うため血清の２
倍の容量を用いた。（２０−〇血餅抽出物３．５％タン
パク質−７％での成牛血清１０−０ 実施例　■ 本実施例は次の事に関連する。

１、胎児牛血清の一流商品Ａ：と胎児牛血清Ｂ：胎児牛
血餅抽出物Ｃ：の比較。

補足物質ＢとＣは発明者の研究室において、本発明に従
い、同一の全胎児牛血液から製造した。

２、基礎培地ＣＭＲＬ−１９６９中に同レベルのこれら
の３種補足物質によって増殖比較。

注：八−胎児牛血清３．９％全タンパクＢ−胎児牛血清
４．３チ全タンパク Ｃ一本発明の胎児牛血餅抽出物２．１％全タンパク 表　　３ 基礎培地ＣＭＲＬ−１９６９中、補足物質なし、および
市販胎児牛血清（デキストランプロダクト社）、または
胎児牛血清および同−源の胎児牛血餅抽出物を補足した
培地中におけるＷＴ−３８細胞の増殖、２Ｘ１０’細胞
／フラスコ（２ｓｄ）で播種し３７℃でインキュベート
を行なった、細胞は７日目に計数した。

１回の継代。

血餅抽出物（２チタンバク）補足物質の容量はタンパク
量において牛胎児血清容量（４チタンバクにおいて１０
−）に相応するように調整した。

実施例　■ 本実施例は次の事に関連する。

１、通常の方法で牛脂児血清を製する牛胎児全血（１９
リツトル）と、その残余血餅から本発明に従って増殖促
進物質（−次血餅抽出物）を製すること。本実施例にお
いて（２３） 一次血餅抽出物からの遠心沈降物を収量を最大にするた
め本発明に従って再抽出して増殖促進物質（二次血餅抽
出物）を製する。

２、基礎培地ＣＭＲＬ−１９６９中においてこれらの補
足物質によって得られるアフリカミドリザル腎（Ａｆｒ
ｉｃＱｎ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍｏｎｋｅｙ　ｋｉｄｎｅｙ）
の樹立細胞系ブエロ（Ｖｅｒｏ）　（上皮細胞）の増殖
比較。

注：牛胎児血液１９リットル。

牛脂児証清の収量９リツトル（全タンパク４％Ｗ／ｖ）
。

増殖促進物質（−次血餅抽出物）の収量１０リツトル（
全タンパク１．９　％　ｗ／ｖ）。

増殖促進物質（二次血餅抽出物）の収量１０リツトル（
全タンパク０．９　％　ｗ／ｖ）。

表　　４ 基礎培地ＣＭＲＬ−１９６９単独中、および牛脂児血清
（デキストランプロダクト社）牛胎児血餅抽出物または
同一の牛胎児血餅抽出物を補足した培地中でのブエロ細
胞の増殖。

（２４） ２Ｘ１０’細胞／フラスコ（２５ｃｆＩ）で接種し、３
７℃でインキュベーションを行ない細胞は７日目に計数
した。

１００％　　Ｏ（対照＞　　　　　　１．５　Ｘ　。

畳　血餅抽出物の容量（２％タンパク）はタンパク量に
おいてＦＢＳ（４％タンパクにおいて１０ｍ）に相応す
るように調整した。

実施例　Ｖ 本実施例は次の事に関連する。

１、子牛全血液を衛生的な許可を得た屠殺場において層
殺した子牛より収集した。層殺し得られた血餅約２リツ
トルはそれぞれ滅菌した４支　　リットルの広口びんに
入れマ研究室に移送した。固い血餅を本発明に従って子
牛血清の予備的分離なしに等量のリン酸塩緩衝化生理食
塩水に分散せしめた。層殺し得られた二次□血餅抽出物
の遠心沈降物を本発明に従って再抽出し二次血餅抽出物
を製（ｚ　′ｒ、、。

２、基礎培地ＣＭＲＬ−１９６９中にこれらの補足物質
によって得られるアフリカミドリザル腎の樹立細胞系ブ
エロ（上皮細胞）の増殖比較。

注：新鮮な凝固した子牛全血液もとの容量２０リツトル
。

子牛血清の収量θリットル。

増殖促進物質（−次血餅抽出物）の収量１０リツトル（
全タンパク２．５％ｗ／ｖ　）。

増殖促進物質（二次血餅抽出物）の収量８．５リツトル
（全タンパク１．８チｗ／ｖ　）。

表５ 基礎培地ＣＭＲＬ−１９６９；および、デキストランプ
ロダクト社の牛脂児血清または−次血餅抽出物中たは二
次血餅抽出物により補足された培地中でのブエロ細胞の
増殖。

２ＸＩＯ’細胞／フラスコ（２５ｃａ　）で接種し３７
℃でインキュベーションを行なった。

７日目に細胞を計数した。

８４係　　発明− 一次血餅抽出物１６チ　　　３７× ７８チ　　発明− 二次血餅抽出物２２チ　　　３７× ９０％　　　牛胎児血清］、　Ｏ％　　　　　２０　Ｘ
１００係　　０（対照）１．５％ 本実施例においてブエロ細胞の増殖比較および細胞収量
は次のデータで示す。

抽出物≠２２ｘｌＯ５７，５ｘｌＯ’　　３７ｘ　　　
１．２（２７） このデータが示すように、上質の牛胎児血清に比して細
胞数で約２倍の最大細胞収量が４８　ｈｒ　速く抽出物
≠２で得ることが可能である。ウィルスのワクチンを商
業的に作るために、製造者は３週間に渡って３回の連続
的な継代または７日のサイクルでその細胞を少なくとも
１０回の細胞数倍加を得ることができなければならない
。抽出物１２では、これが１３日で得られる（４倍加１
５日＋４倍加１５日＋２倍力日／３日）。

以上の実施例が例示するように、血餅抽出物は対照やＦ
ＢＳの成牛血清と比較して高い程度の細胞増殖をもたら
す。

実施例１、表１では成牛の血餅抽出物の増殖促進活性が
成牛血清に比して、サル腎初代細胞に関して高いことが
明らかに示される。

実施例ＴＩ　％表２では成牛の血餅抽出物は人工培体細
胞に関して、成牛および胎児牛血清と比して高い増殖促
進活性を示す。

実施例■、表３では牛胎児血餅物質の一次（２８） 抽出物に対する人工培体細胞の増殖応答が対照および異
なる原料の牛胎児血清の２つの試料と比して有意に大き
いことが明らかである。

実施例■、表４はアフリカミドリザル腎細胞に関して同
じ牛胎児全血液の試料から抽出した牛胎児血清よりも一
次および二次牛胎児血餅抽出物の方が優れた活性を持つ
ことを示している。

実施例ｖ１表５は一次および二次屠殺血餅抽出物を基礎
培地ＣＭＲＬ−１９６９に補足物質として添加すると胎
児牛血清（同一タンパク量）よりも優れた増殖活性のあ
ることが示される。本実施例は必要なときは新鮮な凝固
した屠殺血液から多量の血餅抽出物を牛血清の製造を経
由せずに得ることができることを示している。

製法および実施例を総括すると、細胞培養の目的で牛血
清の製造に用いられる原材料は抗凝固剤や他の添加物な
しで採収された通常の全血液である。自然の凝固過程と
上清の血清（容積で５０チ）の無菌的除去に続いて、残
渣（容積で５０％）は容積で約１１５が同伴された血清
で４１５が凝固物または血餅である。

この関係は胎児牛、子午および成牛の血餅残渣で得られ
る。血餅残渣の２０チは血餅からの吸着した牛血清であ
り８０％は本発明において増殖促進物質または単に血餅
抽出物と呼んでいるものであり、との残渣にリン酸塩で
緩衝化した平衡塩類溶液を注入し続いてろ過または遠心
によって透明化する。使用量と応答のデータから、上記
の実施例に示されたように培養培地中の成分の全般的な
増殖促進活性は次のようになる： １、基礎培地ＣＭＲＬ−１９６９１，４Ｘ２、抽出物中
に残った成牛または 胎児牛血清４ないし５ｍ／　　　　　　１１．ＩＸ３、
実際の血餅抽出物中の活性ある 実体　　　　　　　　　　　　　　２３．５Ｘ計３６．
ＯＸ または他の言い方をすれば実施例において示された相対
的増殖応答は： 基礎培地ＣＭＲＬ−１９６９４チ、成牛または胎児牛血
清３１チ、本来の成牛または胎児牛血餅因子６５チであ
る。もちろん、他の基礎培地、細胞および条件に関して
はこの比率は変化するであろうが、同じ様式の増殖促進
の増加が出願の産物によって示されるであろう。

多くの透析やセファデックス排除クロマトグラフィーの
実験より、生物学的活性は血餅抽出物の低分子量フラク
ションには残っておらず、高分子量フラクションにのみ
残っていると断言できる。

増殖促進物質（血餅抽出物）の成分が全血清とは異なる
ととは同じアガロースゲルにおける成牛または胎児牛血
清と成牛または胎児牛血餅抽出物のゾーン電気泳動によ
り十分水されている。血餅抽出物は独得な血餅抽出物に
対する信頼できる１マーカー〃となる顕著な電気泳動上
の前ベータ帯で特徴づけられる。

成牛または子牛または胎児牛血餅抽出物は（３１） それぞれ別々に利用できるが、それらは望ましい比率で
それぞれ組合わせても利用でき、あるいはまたそれらは
成牛または子牛または胎児血清捷たは他の補足物質とと
もに組合わせて利用することもできる。

（３２） 第１頁の続き ０発　明　者　フォルテ・ホルスト カナダ国エム９ダブリュ１エヌ ４オンタリオ・レックスディル ・ベスリツジ・ロード１６５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　牛血液から得られた血餅の抽出物より成ることを
   特徴とする、細胞及１び組織増殖培養のための補足物質
   。 ２　抽出物が、緩衝化した食塩水溶液中に得られる、特
   許請求の範囲第１項に記載の細胞及び組織増殖培養のた
   めの補足物質。 ３、　抽出物が、成牛血液の血餅、から得られる、特許
   請求の範囲第１項に記載の細胞及び組織増殖培養のため
   の補足物質。 ４、抽出物が、子牛血液の血餅から得られる特許請求の
   範囲第１項に記載の細胞及び組織増殖培養のための補足
   物質。 ５、抽出物が牛胎児血液の血餅から得られる特許請求の
   範囲第１項に記載の細胞及び組織増殖培養のための補足
   物質。 ６、抽出物が、新たに凝塊化した牛全血から得られる特
   許請求の範囲第１項に記載の細胞及び組織増殖培養のた
   めの補足物質。 ７、牛血餅を緩衝化した食塩水の存在下で粉砕し、得ら
   れた懸濁液を完全に浸出させ、そとから増殖促進物質を
   分離する事を特徴とする細胞及び組織増殖培養のための
   増殖促進補足物質の製法。 ８、従来の血清採取工程から得られる牛血餅を、緩衝化
   した食塩水存在下で粉砕し、得られた懸濁液を完全に浸
   出させ、そこから増殖促進物質を分離する事を特徴とす
   る細胞及び組織増殖培養のための増殖促進補足物質の製
   法。 ９、増殖促進物質の分離後の残渣を、更に緩衝化した食
   塩水中で再抽出、浸出し、そこから増殖促進物質のフラ
   クションを得る事を特徴とする特許請求の範囲第７項に
   記載の細胞及び組織増殖培養のための増殖促進物質の製
   法。 １０、牛全血を凝塊化し、血餅を血清と分離、緩衝化し
   た食塩水の存在下で血餅を粉砕して得られた懸濁液を４
   ℃で２４〜７２時間浸出させ、そこから増殖促進物質を
   分離する事を特徴とする、細胞及び組織増殖培養のだめ
   の増殖促進補足物質の製法。 １１、固く凝塊化した、新鮮な、成牛、子牛、又は牛胎
   児血液を血清を分離することなく緩衝化した食塩水の存
   在下で粉砕し、得られた懸濁液を完全に浸出させ、そこ
   から増殖促進物質を分離する事を特徴とする、細胞及び
   組織増殖培養のための増殖促進補足物質の製法。 １２、増殖促進物質を分離後の残渣を、更に緩衝化した
   食塩水を用いて再抽出し浸出させそこから更に増殖促進
   物質のフラクションを得る、特許請求の範囲第７項に記
   載の細胞及び組織増殖培養のための増殖促進物質の製法
   。 １３、遠心分離、抽出後の残渣を、緩衝化した食塩水を
   用いて更に浸出させ、再び遠心分離して第二の増殖促進
   血餅抽出物を得る、特許請求の範囲第１２項に記載の細
   胞及び組織増殖培養のだめの増殖促進補足物質の製法。 １４、特許請求の範囲第７項の方法により得られた細胞
   及び組織増殖のだめの補足物。 １５、特許請求の範囲第８項の方法により得られた細胞
   及び組織増殖のための補足物。 １６、特許請求の範囲第１１項の方法により得られた細
   胞及び組織増殖のだめの補足物。