JPS5991883A - 固定化酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明線、特殊な結合手段を用いることなく、直接吸着
剤に吸着させた固定化酵素に関するものである。

更に詳細には、本発明は、食品製造医薬品製造その他の
酵素反応を実施するに際して使用するのに好適ｆＬ１８
Ｕ定化酵素に関するものである。

一般に、酵素を固定化することは現在では広く行なわれ
ている。

従来、酵素を固定化するには、酵素を不溶性な高分子物
質と共有結合によって結合させたり（共有結合法）、あ
るいはイオン的に吸着させたり（イオン結合法）、松数
の官能基を有する試薬と反応させたシ（架橋法：、東に
は、不溶性の基材に閉じ込めたシ（゛包括法、マイクロ
カプセル法）する方法及びこれらを併用するたどの方法
が用いられている。

しかしながら、このようにして得られた固定化酵素は食
品への応用には不適当な試薬を用いたシ、また、固定化
操作が著しく繁雑であったシ実際に食品製造医薬品製造
等に適用したとき酵素が失活しやすいなど、工業的に適
応させるには欠点の多いものであった。

本発明者らは、食品製造その他工業的に安全に使用でき
る固定化酵素を求めて研究した結果、意外にも、疎水性
の結合力を有する多孔性の吸着剤に多くの酵素が直接吸
着されることを見出した。

本発明は、この知見から完成されたもので、疎水性の結
合力を有する多孔性の吸着剤に吸着できる酵素を水性浴
媒中で疎水性の結合力を有する多孔性の吸着剤に直接接
触させ、吸着させてなる固定化酵素に関するものである
。

本発明の固定化酵素は、固定化させるときに各種試薬等
を全く使用していないので、食品製造への応用に適して
いる。例えば、固定化アルカリプロテアーゼは火入れ醤
油中の重タンパク質の分解にきわめて適しており、寸だ
、固定化レンニンは凝乳処理に好適であるなどである。

本発明で用いる吸着剤は、疎水性の結合力を有する多孔
性の吸着剤であるが、その例としてスチレン系合成吸着
剤であるＨＰ−１０，２０，２１゜６０．４０，５０（
三菱化成工業ｃ株・）製）やメタクリル酸エステル系合
成吸着剤ＨＰ−２ＭＧ（三菱化成工業（ａｌ製）あるい
は多孔性ガラスピーズ（コーニング、グラス、ワーカ−
＜ＵＳＡ＞、フジーテヴイソン、ケミカル社製）などが
あげられる。

吸着させる酵素は、疎水性の結合力を有する多孔性の吸
着剤に吸着できる酵素であればいずれの酵素でもよいが
、符にプロテアーゼ系酵素がよく吸着逼れる。例えば、
レンニン、ペプシン、トリフシン、／ξパイン、麹凶ア
ルカリプロテアーゼ、放線ｈプロテアーゼなどがあげら
れる。

吸着に際しては、各酵素が水性溶媒中で吸着剤に吸着さ
せられる。一般的には、レンニン、ペプシン、トリプシ
ン、パノξイン、麹菌アルカリプロテアーゼ、放線菌プ
ロテアーゼ々とを水に溶解し、吸着剤に接触させる。ま
た、これら酵素は優先的に吸着剤に吸着される傾向があ
るので、各酵素含有液であれば、そのままＶ、着処理す
ることができる。例えば、生醤油は麹菌アルカリプロテ
アーゼを多量に含んでいるので、この生醤油をそのまま
吸着剤と接触させて、無菌アルカリプロテアーゼの吸着
した吸着剤す々わち固定化麹菌アルカリプロテアーゼを
得ることができる。レンニンの場合は、仔牛から得た粗
レンニン含有液を吸着剤と接触させれば、レンニンの吸
着した吸着剤すなわち固定化レンニンが得られる。

これら酵素は単一でもよいが、複合させても吸着させる
ことができる。例えば、凝乳酵素群として、レンニンと
ムコールレンネットを適宜混合して水溶液とし、これに
吸着剤を接触させ、同時にレンネットとムコールレンネ
ットの吸着した吸着剤を得ることができる。更に、よシ
速く凝乳させる場合は、これらに酸性プロテアーゼを加
え、三つの酵素を同時に吸着させた複合固定化酵素を得
ることも可能である。

酵素を吸着させるには、酵素含有水性溶媒と吸着剤を接
触させるだけでよい。この吸着の方式は主に物理的な吸
着力に基くものと考えられ、固定化法としては最も温和
な条件であシ、かつ、まったく簡単な操作、すなわち、
単に酵素溶液と合成吸着剤とを接触させてやりさえすれ
ばよいものである。具体的には、吸着剤をつめたカラム
に酵素浴液や生醤油を通液させたり、酵素浴液や生醤油
を入れた容器に吸着剤を投入し、ゆっくり攪拌したりし
て、酵素を吸着剤に吸着させ固定化酵素を得ることがで
きる。

吸着剤への酵素の吸着は、各酵素の失活が起らない温度
、例えば４５℃以下で行なわれ、かつ広い…の範囲、例
えばｐＨ４〜１０で行々われ、しかもイオン強度に関係
なく行なうことができる。そして、得られた固定化酵素
は酵素反応を行なわせても容易に酵素が脱離することの
ない、きわめて安定なものである。

次に、本発明の実験例及び実施例を示すが、ここに用い
る測定法等は次の通りである。

凝乳活性の測定法： ０．０１２％のＣａ　ＣＡ２を含むスキムミルク１０％
（０，０５Ｍ酢酸緩衝液でｐ［−１５，８に調整）溶液
を基質として用い、３５℃に保温した基質１０ｊＩｊに
酵素液１．０＃Ｉｔを添加し、カードのフラグメントが
生じる時間１秒）を測定した。（凝乳活性は、酵素２０
０■凝乳時間４０分（２４００秒）を基準単位としてい
る）この時間をｔとすると、凝乳活性は次式で表わされ
る。

固定化酵素の活性は、吸着剤に添加した酵素の活性量か
ら吸着せず流出した酵素の活性食管差し引いたものであ
られした。

カードタンパク質の回収率： 凝乳によって生じたカードをろ紙沖過して、充分水洗し
た後キエルダール法でＴ二Ｎを求め、また基質スキムミ
ルク溶液１０ＩＲｔに、ＴＣＡ混液（０，１１Ｍ）リク
ロル酢酸、０．２２Ｍ酢酸ナトリウム、０．３３Ｍ酢酸
を含む溶液）を１０１加え生じたカードのＴ−Ｎ（全窒
素）を１００％としてカードタンパク質回収率を求めた
。

カードの８Ｄ８−電気泳動： 凝乳によって生じたカードをろ紙濾過し、充分水洗した
後、クシを試験管にとシ、これに８Ｄ８−緩衝液（２％
、Ｓｎ２，５０％グリセロール、０．０２Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液（ＰＩ−１７，２＋、３％２−メルカゾト
エタノールを含む溶ｉ１０．５ａｕを加えて、１００℃
、５分間で８ＤＳ化した。サンプル重は、泳動カラム一
本当シ、約１００μｇのタンパク質量になるように加え
、常法通夛泳動させた。

実施例 プロテアーゼ６ｇ＃４ｔ■麹菌アルカリプロテアーゼ、
■仔牛レンニン、■ペプシン、■トリプシン、■プロナ
ーゼ（科研化学（株）製、商品名）０プロトリクイフア
ーゼ（上田化学１株）製、商品名））の凝乳性について
検討した。

凝乳時間が約５分になるように濃度を調整した酵素溶液
を基質スキムミルクに加えて２０時間放置後得られたカ
ードタンパク質の回収率を表−１に示す。さらに、得ら
れたカードの８Ｄ８電気泳動パターンを第１図に示す。

第１図で■は麹菌アルカリプロテアーゼ、■は仔牛レン
ニン■はペプシン■はトリプシン■はプロトリクイファ
ーゼに由来するカードのｓｎｓ電気泳動パターンである
。

表−１溶液プロテアーゼの凝乳性 表−１から、ここで検討した６種の酵素には活性に大小
はあるもののいづれも凝乳活性が認められた。また、カ
ードタンパク質の回収率も酵素によって異るが、いづれ
も３０％以上の回収率が得られることが判った。

第１図において、図の右方が高分子タンパク質、左方が
低分子タン／Ｐ：り質であるからレンニンから得られた
タンパク質■に比べ、溶液状態での各プロテアーゼから
得られたタンパク質は、より低分子化されて（パターン
が左寄シ）おシ、過分解さく９） ＡＩ”１ れていることが判る。

実施例 実験例１で用いた６種の酵素を各棟の吸着剤に吸着させ
、固定化酵素を調整した。すなわち、多孔性の吸着剤Ｈ
Ｐ−２０，３０，及び２ＭＧ（いずれも三菱化成工業１
株）製、商品名）を各々１５ａ＋ｊづつカラＡ（φ：１
０．Ｘ２００Ｍ１１に充填し、水に溶解した酵素的２０
０９を室温で通過させ吸着剤に吸着させ固定化酵素カラ
ムを得た。

ここで得た固定化酵素に水を通したところ、流出液は凝
集活性を示さず、固定化プロテアーゼが調整されたこと
が判った。この時、固定化された酵素活性は表−２に示
した。

Ｃ１０） ここに得られた固定化プロテアーゼに、基質スキムミル
ク溶液を常温で約１０ｄ／分の速さで通過させ、流出液
を試験管に取り、直ちに′５５℃の恒温槽に入れ凝乳時
間を測定した。

また、凝乳後２０時間放置し、カードタンパク質の回収
率をみた。とれらの結果は次の表−３に示される。

表−５固定化プロテアーゼによる凝乳 さらに、カードの過分解の有無を確認するため、更に２
０時間放置しその時得られたカードのタンパク質の５Ｄ
Ｓ−電気泳動パターンを第２図及び第５図に示した。

第２図で、■はＴＣＡカードタンパク質（トリクロル酢
酸による沈澱カードタンパク質：対照）■′はＨＰ　−
２０吸着麹菌アルカリプロテアーゼ、■′はＨＰ　−２
０吸着レンニン、■′はＨＰ−２０吸着はプシン、■’
ＨＰ　−２０吸着トリプシン、■′はＨＰ　−２０吸着
プロナーゼ、■′はＨＰ−２０吸着プロトリクィファー
ゼによるカードタンパク質のＳ　Ｄ　Ｓ　′Ｒｃ気泳動
パターンを示す。また、第６図において、■“ｆｉＨＰ
−２ＭＧ吸着麹菌アルカリプロテアーゼ％・“はＨＰ−
２ＭＧ［！ｆレンニン、■“はＨＰ−２ＭＧ吸着はプシ
ン、■“はＨＰ−２ＭＧ吸着トリプシン、■“はＨＰ　
−２ＭＧ吸着プロナーゼ、■“は）（Ｐ−２ＭＧ吸着プ
ロトリクイファーゼによるカードタンパク質のパターン
を示す。

実、龜例１，２から判るように本発明によってプロテア
ーゼを固定化することにより、カードの回収率を上げる
ことができ、また、第２図及び第３図から（）（ＰＩＯ
に固定化した場合も同様な結果で図は省略した。）わか
るように、固定化することによυ各プロテアーゼによっ
て凝乳されたカードタンパク質が゛ｒＣＡカードタンパ
ク質■あるいは固定化レンニン■のものとほとんど変わ
らず、カードタンパク質の過分解が防止されるという効
果を奏することがわかる。

実施例１ 合成吸着剤ＨＰ−２ＭＧ約５１をカラム（φ１０×６０
朋）に充積しこれに黄麹菌のフスマ酸から硫安分画、セ
ファデックスＧ−２５、バイオ−ゲルＰ−１５０のゲル
濾過させて得たアルカリプロテアーゼ画分（部分精製品
）約０．２５ｙ−の水溶液を室温で通過させ、充分水洗
して固定化プロテアーゼとしカラム温度を３０℃に保っ
た。

これに１０％スキムミルク溶液を室温で１Ｑｓ／／分の
流速で通過させ、流出液を２０１づつ集めた。これらの
分画した流出液は直ちに６５℃の恒温槽に移し％凝乳時
間、及び、その時得られたカードタンパク質の回収率を
表−４に示した。

表−４ＨＰ−２ＭＧ＠アルカリプロテアーゼの連続反応
による凝乳とカード回収率 実施例２ 合成吸着剤ＩＴ　Ｐ　−２０約５−をカラム（φ１０Ｘ
１０Ｘ６Ｑに充填し、これに仔牛レンニン（ディフコ・
ラボラトリ−社製、米国）約１．２５　？の水溶液を室
温で通過させ固定化レンニ／とし、カラム温度を３０℃
に保ち、１０％スキムミルク溶液を１［］ｍｌ／分の流
速で通過させ流出液を２０１７づつ集めた。これらの分
画した流出液を直ちに６５℃の恒温槽に移し、凝乳時間
及び、その時得られたカードタンパク質の回収率を表−
５に示した。

表−５ＨＰ−２０固定化レンニンの凝乳活性

【図面の簡単な説明】

第１図は実験例１において、溶液プロテアーゼによって
得られた各カードの５Ｄ８−電気泳動パターンを示す図
である。第２図は実験例２において、ＨＰ−２０吸着プ
ロテアーゼによって得られた谷カードの５ｎｓ−電気泳
動パターンを示す図である。第３図は実験例２において
、ＨＰ−２ＭＧ吸着プロテアーゼによって得られた各カ
ードの５ｎｓ−−１気泳動ノぞターンを示す図である。 代理人　弁理士　　戸　１）親　実 弟　　１　　　図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）疎水性の結合力を有する多孔性の吸着剤に吸着で
   きる酵素を水性溶媒中で疎水性の結合力を有する多孔性
   の合成吸着剤に接触させ、吸着させてなる固定化酵素。 （２１ｆｆ＃素が、レンニン、ハフシン、トリプシン、
   Ａｌξイン、麹菌アルカリプロテアーゼ、放線菌プロテ
   アーゼなどのプロテアーゼ系酵素からなる群から選択さ
   れてなる特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素。 （３）疎水性の結合力を有する多孔性の吸着剤がスチレ
   ン系合成吸着剤メタクリル酸エステル系合成数滑剤又は
   、多孔性ガラスピーズである特許請求の範囲第１項記載
   の固定化酵素。