JPS5998095A - 重合体担体上へのタンパク質の固定化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は恵合体担体上にタンパク質を固定化する分野ン
特に多孔性の重合物質上への酵素の固定化に関連する。

多くの生体反応の夕１、ンパク寅醜媒である酵素は、食
４！および医薬品工業に２いて広く使用されて（１）る
。例えば、グルコースインメラーゼはダルコース反応混
会物のフルクトースへの変換に、ラクターゼはチーズホ
エーからのタンパク質の分離の際のラクトースの除去に
、α−アミラーゼおよびダルコアミラーゼはコーンスタ
ーチの液状シロップへのα化および糖化に、フ・よびペ
ニシリンアミターゼはペニシリンからの６−アミツベニ
シラン敵の製造に使用されている。固体１ｕ体上への酵
素の固定化に利点がある事は長く認められてきた。担体
を通して混合物または基質を通過きせる事による触媒の
処理によっても固定化酵素は基質とともに流れ去るより
もむしろ担体に結合して残っており、基質から酵素を回
収する必要もなくまた、酵素は担体中に残暮しているの
でそこでまた再使用できる。

固体担体にタンパク質を固定化する先行技術の方法は、
６タンパク質固定剤”と題され、１９８０年７月１日に
５ｉｌｖｅｒにより発行された米国特許第４，２１０．
７２２に記載されている（以後５ｉｌｖｅｒとして引用
する）。５ｉｌｖｅｒはβ−ヒドロキシルアルキレンア
ミン部分を言有する水に可溶性のポリマーによる単一層
’Ｅ　７−ｃはコーテングを担体に最初に応用し、極性
担体上へ生′勿学的に活性なタンパク質を固定化する方
法を発表した。５ｉｌｖｅｒの方法はｅｆ：素置電化を
確実にする為、指体上にポリマーを付けなければならな
いという幾分かの難点がある。

０固定化生物学的活性タンパク質”と題され、１９７８
年２月７日に発行されたＬｙｎｎによる米国特許第４，
０７２，５６６（以後Ｌ’／ルルとして引用する）は、
ｐ−フェニレンジアミンを用い、酵素膜たは他の生物学
的に活性のあるタンパク質を無ａ担体！功質に結合Ｔる
方法を記載している。その発明で有用と記載されている
１１体物質は、珪１浚質物寅、酸化すず、：β化チタン
、二酸化マンガン２よぴ酸化ジルコニウムである。実施
例に記載されている唯一の担体は４０から８０メツシユ
の多孔性ガラス粒子分よび１２０から２（ＪＯメツシュ
の多孔性シリカである。Ｌ／ｎｎの方法にはタンパク質
の固定化に関係する多孔性ポリマーから作ったような有
機担体については記載されていない。

“酵素の化学的固定化”と題さ孔、ｉｃｅ’／ｅ８によ
り１９７６年１月２０日に発行爆れた米国特許第８．９
８８，５８９には、アルキルシバライドおよびアルカン
ジアミンで前もってル成させた反応溶液８必要とする固
定化に有効な方法７）Ｓ記、、−元されている。

”架橋酵素膜”と題され、Ｓｉｒルｏｎにより１９８１
年２月２７日に発行された米国’ｌ：ｆｕ′！ｆ第４，
２５１，６３１にはシリカ修飾塩化ビニルポリマー製で
微小孔構造の非、立維性ろ過膜の小孔内へ直接酵素を吸
着させ、酵素分子が膜に化学結合を作る事なく酵素分子
が互いに／Ｐ：橋すゐような２官能基性結合試薬で酵素
を架橋するような架橋酵素Ｎの製造方法を記載している
。Ｓ　ｉ　ｎＬｏ　ｎの発明に必要とされる膜は、を田
かく分割した二酸化シリコンがその中へ埋められている
ようなものである。更に、５ｉｒｎｏｎ法で必要な架橋
はシリカ修飾ポリマー上に１素を固定化した後、例えば
ダルタルアルデヒド、ジオギソペンジジン、ヘキサメチ
レンジイソシアナートＸ７ｃは１．５−ジフルオロ−２
，４−ジニトロベンゼンの様な架橋剤でのｊ漠の処理を
必要とする。Ｓ４ｍｏルのシリカ修飾ポリマーをジアミ
ンで処理する前にＥｌ累はそれらのポリマー上に固定さ
れる。そのよつな処理なしでは多くの他のポリマー上へ
の固定化は不可■化であり、５ｉｒｎｏｎ過ｉはそれら
の他のポリマー上への６１．素の固定化には不適当であ
る。

“１＝ｔｌ定化酵素の製造”と題され、Ｅｒｎｅｒｙら
により１９７４年１０月１５日に発行された米国特許第
８，８４１，９６９にはｐＨ８から７で１１ｐ素をポリ
サッカライド、ナイロンまたはガラスのチタン、すす、
ジルコニウムまたは鉄の訪４体と反応させ、水に不溶の
酵素８襄造する方法が記載されている。

例えば、扁化チタン溶液をナイロン繊維に加え懸濁液を
形成させ、それをオープンで一夜乾燥する。

生じる乾燥粉末を酢酸緩衝液で８度洗浄し、緩衝液２よ
ぴ粉末は遠心により分離する。酵素を生じるスラリーに
加えた後、水不溶性酵素を酢酸緩衝一夜および塩化ナト
リウム溶液で洗浄する。この過程はナイロン藏維には適
しているが、酵素そつまくその上に固定化させる前に、
金椙塩よりむしろジアミンで処理しなければならないあ
る棟の他の担体には不適当である。

“水不宿性生物学的活性物質”と題され、１９７７年′
９月２３にＢａｒｋｅｒらにより発行されプζ米国特許
第４０４８．８６１こは水不溶固体上に酵素を保つ方法
が記載筋れている。そのよつな固体は最初にジアゾ化さ
れたＮ−ジアミノベンゼンで処理しなければならず、適
した担体として記載されているｗＪ質は多孔性ガラス、
多孔性シリカおよび木などのような焦機物である。

゛γ占性炭素担体上への固定化酵素の高密度装填”と題
され、１９８０年５月２０に１３ａｉｌｅｙらにより米
国特許第４，２０４，０４１が発行された。この発明の
方法は活性炭素の多孔性粒子の使用にのみ適しているよ
うに思われる。酵素の固定化試薬として働くカルボジイ
ミドは活性炭素の表面のカルボキシルラジカルと結合す
る。それ故表面にカルボキシルラジカルを待たない担体
物質はカルボジイミド処理にＡさない。ちらに、Ｂａ１
ｌｅｙの７項に記載されてい心ように、固定化の実施に
は２４時間以上かかる。

発明の要約 本発明は、第１に担体を溶媒に溶解した長鎖陽イオン注
辰面活性剤の希薄溶液中に担体を１へ＜浸漬段階お・よ
ひ担体をタンパク質の希薄水溶液に浸丁弔２の浸漬段階
からなる前年で有効な亜合体担体上にタンパク式を固定
化するための方法である。

４１と第２の浸ｒＵ段階の間、希薄陽イオン−溶媒溶液
は穏やかｔＶかきまぜる。

不発明の他の点は、タンパク式が酵素であり、陽イオン
表面活性剤のための良好な溶媒がアセトンであり、第１
の浸漬段階をｌＯから６０分以上実施し、−１弟２の浸
漬段階は４時間以上かける事である。アセトン２よび長
鎖１号イオンの溶液での処理により、同じ陽イオン２よ
び他のいくつかの適当な溶媒で担体を処理するよりも担
体がより商い酵素活性を峙つようになる。本発明の更な
る面ば長ジｂ陽イオン処理に２いて良好なジアミン、Ｎ
−ココ−１，８−ジアミノプロパンの便用により、担体
に比較的旨い酵素活性を残丁４ｊ工である。

本発明のもつ１つの点は、酵素がカタラーゼである事で
ある。

、γ″（転）、゛の発明 酵素が同定δれる屯合体−７７質の良好なものは多孔性
ポリマーである。その物質は、低゛または旨田度ポリエ
チレン、ポリプロピレンまたはポリメチル（ンテンの様
ナオレフインのホモポリマー、ナイロン６．１１または
６６の様す非オレフィンのホモポリマー２よびポリカー
ボネートまたは共車台体である。酵素が固定化される物
質は、例えば粉末、フィルム、管または棒の係にどのよ
うな便利な形ブたは形態でもよい。適した多孔性止金体
物質はＡｃ　ｃｕｒｅ　ｌ■多孔性ポリマー〔粉末形態
としてＡｒｎｗｔ、に社（８００，５ｏｕｔｈ　Ｗａｃ
ｋｅｒ　Ｄｒｉｖｅ。

Ｃｈｉｃａｇｏ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　６０６　Ｕ　６　
）で、フィルムの形でＭｅｍｂｒａｎａ有限会社（７０
７１ＣｏｒｎｒｎｅｖｃｅＣｉｒｃｌｅ、Ｐｌｅａｓａ
ｎｔｏｎ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　９４５６６　）で製
造テれているＪである。Ａｃｃπｒｅｌ■多孔性ポリマ
ーはＣａ５ｔｒＯにより１９８１年１月２７日に発行き
れた米国特許第４，２４７，４９８に記載式れ十分にａ
　１．、ｉｉ　嘔れて２す、引用文献もある。他の多（
Ｌ法ポリマーもまた試験し、いくつかのものは不発明に
適した担体である事が見い出された。

第１の浸漬段階における嵐合体担体の艮鎖陽イオン処理
により、酵素固定化のための担体の多孔１４ミ表向を調
製する。ここにおいて”長鎖１号イオン”とは少くとも
８個の炭素のアルキルまたはアルケニル基が結合しｆｃ
窒素化合物で、アミン、ジアミン、４級アンモニウム化
合物、アばドアミン２よひイミダシリンを意味する。艮
好な陽イオンの中でジアミンが良好に溶媒ｒＣ希釈され
、１６薄ジアミン溶液を生成する；担体をこの溶該に浸
し、ゆるやかにかき筐ぜる。他の適した１劫イオンは１
列えば〇−ヒドロキシーベンジルココアミン（フェノー
ルとココアミンのマンニッヒ反応で畏造）などの屋素言
Ｍ化合物で、その希薄溶液は酵素の固だに適している事
が見い出された。：ｔ＃薄陽イオン溶液を製造するのに
より良好な化合物はジアミン、アミンおよび４級化合物
、各々１ｈｂｏｒｎｅ　ｅ　Ｂ　＠　Ｃ１Ａｒｒｎｅｅ
ｎ■Ｃ１およびＡｒｑｗａｄ■２Ｃである。これらの化
合・′吻は咎々、Ａｒｒｒｕｘ　Ｉｃ社の表品で／）９
、各々、Ｎ−ココ−１，３−ジアミノ−プロパン、ココ
アミン、ひよひジメチルジココアンモニウムクロリドの
Ａｒｒｎａ、に社の登録開栓である。前処理化合物の良
好塾の６１１１定は第２の浸漬段階後の担体中の酵素活
性で６１１］定する；より渇い溶水活性はより、仔効な
担体を意味し、より多い触媒がその上に存在できる事で
ある。酵素力クラーゼの活性のｊＩす定はベーカー　（
Ｂａｋｅｒ）で１ｌｉｉＪす、それは検定条件下（この
場合ｐＨ７，０に２いて０．５１ｙｆ　ＨｔＯ２テロ　
０分）で２６４ｍ９の過酸化水素の分解を触媒するカタ
ラーゼの鼠と定義される。担体の単位面積当りのべ一カ
ー・が高い弔はより高い融媒能力に対応する。それ故、
単位面積当り最も高いベーカーでの活性を持つ１１体を
生じ嘔せるような、第１の段階の化合物が最も良好であ
ろう。表１は本発明に従い、ただ４目のＬｍ段階で使用
するアミン、ジアミン、’Ｅ　ｆｃハ４４ｆ７ンモニウ
ム化合物を変化させて処理したいくつかのＡｃｃｕｒｅ
ｌ■多孔性ポリマーフィルムのカタラーゼ活性を示した
ものである。処理し、その結果を表１に示したすべての
Ａｃｃｗｒｔｔｌ■多孔ｉ生ポリマーフィルポリポリプ
ロピレン製である。

衣　　　Ｉ Ｄｕｏｒｎｅｅｎ■Ｃ＞１８．υ Ａｒｒｎｅ　ＣＷ■Ｃ１１，９ ４ｒｑｕαｄ■２Ｃ１１，２ ０−ヒドロキシベンジルココアミン７．９ベンジルココ
アミン　　　　　　　　　　　　　６．ＯＥｔｈｏｍｅ
ｔｔｎ■Ｃ／１２’　　　　　　　　　　　　　　　５
．２ＡｒｎＬｅｅｚ■２Ｃ”　　　　　　　　　　　　
４．４ＡｒｑｗａｄｏＣ−５０３４，Ｏ Ａｒｍｅ　ｅ　ｎ■ＤＭＣＤ’　　　　　　　　　　２
．９Ａｒｏｒｎｏｚ＠ｌＤＭＭＣ−Ｗ’　　　　　　　
　　１．１これらの開襟は丁べてＡｒｒ脇ｋ　辻（８０
０。

５ｏｕｔｈ　Ｗａｃｋｅｒ　Ｄｒｉｖｅ、Ｃｈｉｃａｇ
ｏ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ６０６０６）により登録されてい
る： １　ビス（２−ヒドロギアエチル〕ココアミンノ登録商
標 ２ジココアミンの登録商標 ３　トリメチルココアンモニウムクロリドの登録曲標−
５０％活注 ’　Ｎ、Ｎ−ジメチルココアミンの登ｋｋ肋標５ジメチ
ルココアミンオキシド（ココ分画の中間部）の登録商標 上記の表に示したように、試験した丁べてのアミン、ジ
アミンおよび４級アンモニウム化食物を第１の浸漬段階
で用いると、担体が活性固定化酵素を持つようＫなる。

反対に、未処理多孔性ポリマー（ポリプロピレン）フィ
ルムは０．１ペーカーの活性しか持たない事が観察され
た。

同イオン表面活性剤のために試した溶媒（まメタノール
、インプロパツール、クロロホルム２よびアセトンであ
る。メタノール溶液で浸漬するとポリプロピレンフィル
ム担体の端が変色し、メタノールは不適当な溶媒である
事が証明でれる。イン１０パノール、クロロホルム２よ
びアセトン溶液はすべて満足できる。しかし、クロロホ
ルム−処理担体はインプロパノ−ルー処理ポリプロピレ
ン担体より篩いカタラーゼ活性を持つのでクロロホルム
が良好な陽イオン溶媒である。

第１υ漬段階での長頌陽イオンでの処理は、担体を５分
または６０分沈入させても同等の効果であった：・矢っ
て、第１の浸漬段１若での艮好な沈入時間は５分である
。この分野に４’ｆｔ　ｍする者（ズ、第１２よひ第２
の浸漬段階に適したとしてここで記載された＋：ｇ　ｉ
ｕＪは−Ｗ則の；温り一よび大気圧下の事であり、これ
らの温度および圧力の変化は良好な沈入時間な伎える事
を理解されたい。さら咳、必要な沈入時間は使用した陽
イオン２よぴ十分には理解でれていない他の因子に依存
するので担体を５分以下しか沈入さぜない事も理解され
たい。わかっている事は１ｕ体を第２の促直べ階で沈入
し、カタラーゼのｌ古ｉ土全決定する１で、第ｌの浸漬
段Ｉ祈での十分な沈入時間が決定できない４１である。

δらに、１婦イオン−溶媒（谷故甲の陽イオンの爵度は
担体のカタラーゼ活性に明らかに影７瞳しない。それ故
、低ａ度の溶媒中の陽イオン〔１％程度（車量／容積）
〕が良好である。

会・ザメもが担体上に固定化され、その活性を測足する
時、そのムＩＪ定匝は固定化された総量の酵素よりむし
ろ担体上の活性な酵累量に変心する。担体上の不活性化
ｒＪ累（即ち、ｊ独媒として機ＩＪ目しない酵素）は通
常固定化過程中に付き、活性および不活性酵素の合計が
担体上に付いた酵素の総量に対応する。Ａｃｃｔｔ、ｒ
ｅｌ■多孔性ポリマー担体の装造に使用した残、仔Ｎ、
Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）メロウアミンおよび
第１の浸漬段階で利用した残存Ｄｕｏｒｎｅｅｎ■Ｃな
どの担体中の他の窒素源を試験し明らかにした恢ならば
、窒素言有担体の窒素言置は担体上に固定されたＴ孝素
の駿に相関すると考えられる。他の・窒素源２よび酵素
の谷々の望素分の寄与を分離するため、別々の窒素分析
を行った。

第ｌの分析は酵素で処理する前に実施し、第２の分析は
醇紫処理佼に実施する。２つの分析の差が存在する酵素
の酩量（活性および不活性）に対応する。

総窒素浮量３よぴ酵素言置の決定は下記の表■に収めた
データからなされる。担体番号１−８はＡｃ　ｃｕｒｅ
　ｌ■多孔性ポリマーである。

表　　　■ １　　　ナシ　　　　ナシ ２ＳルＣｅ２　　　　ナシ ３ＳｎＣ１！ｔ　＆　　　　ナシ　　　１．６Ｄｕｏｒ
ｎｅｅｎ■Ｃ ４Ｄｕｏｒｎｅｅｎ＠Ｃナシ１８ ５　　　ナシ　　　アリ　　　　　　　　　２．８６　
　８ｎＣ７？２　　　　　アリ　　　　　　　　　　　
　３．８７　５ｎＣｅ２　＆　　　　　アリ　　　　　
　　　　　　　８．３Ｄｕ、ｏｒｎｅｅｎ■Ｃ ８１Ｊ）ｕ　ｏｒｎｅ　ｅ　ｎｏｃ　　　アリ　　　　
　　　　　　　　６８酵素カタラーゼの場合特別に、表
■の“チカタラーゼの欄で示したように塩化第１すず・
２水和物で処理すると活Ｖが増加する、但し、貯蔵安定
性における明らかな改良はない。貯蔵安定性は時間によ
る酵素活性の減少の尺度である；高貯蔵安定性を持つ担
体は時間により酵素活性が減少しない。逆もまた同じ。

試１模した多くの他の「１イ素は担体を塩化第１すずま
たは他のどんな余稿で処理しても、酵素γ占性のＪ冑〃
口は示さなかった。

夫栖例１ カタラーゼがその上゛に固定化された担体は以下の過程
で製造する。先に記載したように、各々の□酵素活性は
特定の前処理または過程段階により促進されるが、され
ない場合もある。カタラーゼ活性は金属塩により促進で
れ、カッラーゼの良好な固定化過程は金属塩による前処
理が言１れる。前処理段１・η１・ＣＰいては、５ＦＬ
Ｃ（１・２Ｈ２０９よひ良好な堪溶媒（アセトン）を混
和し希溶液を生成させ。

る。本具体例では１％魔量−容量（Ｗ／ｌ溶液をＡ整し
た、しかし、もし溶液の濃度が０．１％（Ｗ／■）ん・
よひ２５％（Ｗ／Ｖ　）の間であれば堰の濃度は決定ぼ
りではない事は明らかである。Ａｃｃｕｒｅｌ■ｃｃｕ
ｒｅｌ■担体を希５ｎＣｅ２・２１１２０／アセトン溶
孜中に５から１０分間置くと、ぞの担体は５００ｐｐシ
ルのすず濃度を持つ湛が原子吸光により決定される。溶
液を除去し、担体を純粋なアセトンで洗１１）する。

ｊ晶化第１すず・２水和物の代りに試駁した他の金＃４
塩は、」温化第１鉄２水和９１１　（１”ｅｃｅｔ　・
２　Ｈｚ　Ｏ）である。ｌ”ｅｃ１２・２１ｈＯによる
前処理Ｖこより、５ｎＣ１！２・２Ｂ２０で処理した担
体より、担体中のカタラーゼ活性は高い、しかし、第１
鉄陽イオンはＡＣｃｕｒｅ　Ｌ■多孔性ポリマーフィル
ムの著し０１変色を起こす。

第１の浸雛段１省に２いては、金属基処理担体をジアミ
ン溶媒に溶解したジアミンの８薄溶液に１０から６０分
の間置き、ジアミン溶・Ｃ夜は穏やかにかき１せる。ジ
アミン溶媒はクロロホルム、メタノールおよびインプロ
パツールからなる群より選択するが、Ａｃｃｕｒｅｌ■
多孔性ポリマー多孔性ポリマー一体上はクロロホルムが
良好である。アミン、ジアミン、および４級アンモニウ
ム堪は＆１に掲げた群より選択する。表１から明らかｒ
ｌように、Ａｃｃｗｒｅｌ■多孔性ポリマー上にカポリ
ーゼを固定するには、Ｎ−ココ−１，８−ジアミノプロ
パンが最も良好１．ｆ４素言有化甘物である。Ｓ）ぴ、
溶媒に溶解したジアミンの１％（ｗ／ｌ溶液を使用した
、もしアミン溶液の濃度がｔｌ、１　％　（ｔ／／／Ｖ
）ｈ・よひ２５％（ｗ７ｖ）の間であればジアミンの濃
度は決定的でないと思われる。

第２の浸漬段階（酵素を製造した担体に固定する〕の前
に担体をインプロパツールまたはエタノールで湿らぜる
。本具体例で使用するカタラーゼは希薄水溶液により固
定する。Ａｒｒｎｏｕｒ製系会社ＣＤ１ｖｉｓｉｏｎ　
ｏｆ　ｌ１ｅｖｌｏｎ、Ｉｎｃ、、Ｋａｎｋａｋｅｔｔ
。

１１１ｉｎｏｉｓ）−ｍの固体カタラーゼ、筐たはＭｉ
ｌｅｓｌ、ａｂｏｒａｔｏｒｉｅ８有限会社（ＥｒＬｚ
ｙｒｎｅ　ＰｒｏｄｒｂｃｔｓＤｉｖｉｓｉｏｎ、Ｃｈ
ｉｃａｇｏ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　　Ｃカタラーゼ番号８
６−１０６．］）製のチモール飽和緩衝化！′ｔ、濁液
として供給されるカタラーゼを脱イオン水で希釈してこ
こで用いる。試験したカタラーゼの希薄水浴液の濃度は
０．１％（Ｖ／Ｖ）および０．８％（Ｖ／Ｖ）の間で、
この範囲の両端の濃度の溶液を担体上に１１素全１＾１
駕するのに使用した時、Ａｃｃｒｂｒｅｌ■多孔性ポリ
マーフィルム上のカタラーゼはほとんど同一の活性を示
した。担体は希薄酵素−水溶液中に４時間以上かき−ま
ぜながら浸すと、担体上のカタラーゼ活性は浸漬時間の
増〃口に伴い紹〃口する。

しかしながら、４時間といつ時間は第２の浸漬段階の沈
入の最小時間で（ズナく、申請者はより短い１悔間に十
５＋な：′旺素活性が実現する事を示し−Ｃふ・９、で
れは他の因子の中、１吏用した。ｔυ体・白質２よひ沈
入時間、溶媒２よび第１浸漬段階で使用しｆｃ陽イオン
に依存する嘔を理解ざイｔたい。例えｉ、申請者はＡｃ
ｃｕｒｅｌ■ポリプロピレン多孔性ポリマー上にリパー
ゼを固定化するのに第２の浸賃段階は６分で十分であっ
たｒ＄を示した。第２の浸漬゛ｆたは固定化、＋４．−
階の終了時、固定化したカタラーゼの活性７ｉｌ−決定
する前に、担体を酵素水溶液／り）ら除去し、６１倍の
水で洗浄し、表面上の丁べての６丁溶注カタラーゼを除
去する。

ここで要約１−ると、Ａｃｃｕｒｅｌ■多孔性ポリマー
多孔性ポリマーフィルム一体上固定化−「る良好な方法
（よ、担体をアセトンに溶解したＳｎＣ＆・２　Ｉｆ２
０の１％（Ｗ／ｖ）溶液ンこ５分間沈入するｔ！ＩＳ処
理にかけ、前処理した。担体は＋＋ｊｉｌ枠なアセトン
でｒ　ｆ；”　Ｌ、担体を１０から約６０分間Ｄｗｏｒ
ｎｅｅｎ■ＣＣＮ−−１コー１．３−ジアミノプロパン
）の１％（Ｗ／Ｖ）クロロホルム７容（戊申に、り１き
１ぜながら浸す第１の浸漬段階があり、担体をイソプロ
パツールで湿らせ、０．８　％　（Ｗ／Ｖ）カタラーゼ
水溶液中に担体を一夜浸す、へ３２の浸漬段１昔にかけ
る。

上述したように、この方法はこの特定の担体上にこの特
定の酵素の最適の活性を提供する。他の・Ｋ累および他
の多孔性担体は著しく相違した方法の過程で最適の活性
を示す。この過程をＡｃｃｗｒｅｌ■多孔性ポリマー上
のカタラーゼに用いると、担体上に乗ったカタラーゼは
８．８％である事が観察式れ、酵Ｊ　−ｊ１体比が１：
１１に対応する。反応に、ＤＥＡＥ−セルロース上にカ
タラーゼを固定化するのに−Ｖ−純な吸着を用いると、
乗った量は０．７％であり、酵素−１−（ｉ体化は１：
１４１に対応する。

ＤＥＡＥ−セルロースはジエチルアミノ−エチルセル【
コースでアリ、セルロースエーテルはセルロースとエー
テル結合している基（Ｃ２１１５）＊ＮＣＨｘＣＨ２−
を苫イ１−する。

実　　！１１ｊ　　例　　２ グルコースオキシダーゼはβ−Ｄ−グルコースのグルコ
ン酸、？よひ：１ａｌｆｆ化水素への酸化を触媒する。

生成する過ｆ、ｉ化水素がグルコースオキシダーゼのγ
占惟ｔドげるので、カタラーゼを２つの酵素系の一部と
しておよび過酸化水素捕捉剤として担体上に伴に固定化
する；市販用のグルコン酸生産の可能性を持つ理想的な
担体はその上に両方の酵素を持っているべきである。こ
れら２つのｒ孝素を担体上に固定化する良好な方法は、
以後間らかになる力ｆ、カタラーゼのみの場合に最適と
考えられた方法と異っている。

基質に対する酵素の活性は上記：＋７クラーゼ検定で使
用したペーカーよりもむしろ国際＊＝　（ｌＶ＞で測定
する。ＩＵは分当りマイクロモル（μｒｎ）″の仄元を
持ち、分当り生成Ｔる生成物のマイクロモルに対応する
。この具体例においては、生成物はグルコン酸であり、
担体（ま、ＤＥＡＥ−セルロース：多孔性ガシス；　：
ｂ−よひナイロン６、ナイロン１１’！７’ｃｌ；Ｊポ
リプロピレン製のＡｃｃｕｒｅｌ■多孔性ポリマー扮末
からなる群粉末選択する。扮木上にグルコースオキシダ
ーゼあ・よひカタラーゼを固電化する為に（ば、試欧し
た金属塩のすべてが酵素活性を増大さぜないので前処理
段階を必要としない。

第１の浸漬段階にあ・いては、未処理担体粉末をジアミ
ン溶媒に溶解したジアミンの希薄溶液（１％（Ｗ／Ｖ）
＃−ココー１，８−ジアミノプロパンのクロロホルム溶
液）に１０から６０分間浸し、穏やかにかき１ぜる。

インプロパツール唸たは変性エタノールで粉末相体を湿
らせた後、２つの酵素系のための緩衝液を１９．４　′
Ａする。緩衝液は、１．２グラムの塩化ナトリウムあ・
よび１．２グラムの酢酸を４００ミリリツトルの脱イオ
ン水に溶解する。ゲルコールオキシダーゼ固に化の２緩
衝液の艮好なｐＨは６，０であり、希水酸化す）　＋１
ウム溶液を〃口え緩衝液のｐＨｔ上げる。１０ミリリツ
トルのグルコースオキシダーセ（カタログ番号８１−６
１８．アス波ルギルスニガ−［Ａｓｐｅｒｇｉｔｌｑｒ
、ｓ　ｎｉｇｅｒ〕から）２よひ２０ミリリツトルのカ
タラーゼ（カタログ番号３６−１０６、牛肝臓から）（
両方ともＭｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｉｅｓ有限
会社（ｇｎｚｙｒｎｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｄｉｖｉｓ
ｉｏｎ。

Ｃｈｉｃａｇｏ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ３から人手可能）を
この緩衝液に加える。担体をこの希薄酵素緩衝溶液中に
４時間より短くならない期間反す。第２のＣの浸漬段階
の終了時、固定化カタラーゼの活性を検定する前に担体
を緩衝酵素溶液から除き、数倍の量の水で洗浄し、表面
にある可溶性酵素を除去Ｔる。

検定で得た結果全下記の表■に示す。各々の場合、検定
および固定化は０．２クラムの担体試料で実施した。検
定条件は７５−１００ミＩＪ　ｌットルの１０％グルコ
ース基質を６０分１で用いた。

検定は以下のように実施した：茨■に渇げｆｃ各々の担
体をグルコースオキシダーゼ／カタラーゼ言方２：正素
系に調製Ｔる。基質（触媒作用を受（ケるβ−Ｄ−グル
コースを１０％含有している溶液）と調整した担体を表
に示した量２よひ反応時間の間接触させる。閉釦系の中
へ故布器を通して空気をバブルし系内を酸素過剰な状態
に保つ。部分的に変換した基質は高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ”）によりグルコン酸のパーセントを
分析し、その数字は矢式に従ってグルコン酸のμモルに
変換する、ここで（グルコン酸のグラム数／基質のミリ
リットルｆａ）＝（グルコン順パーセント／１００）： 国際単位（ｌＵ）での１４素活性はμモル／分、または
分当り生成するグルコン酸の量の次元である。

表■の各々の検定には０．２グラムの担体を便用した。

８つの別のポリプロピレン試、・倹を行った。最初の２
つのポリプロピレン担体は金属塩で前処理をしないが、
最後のものは上記実施例の過程に従って前処理を行った
。未処理担体の平均活性値（ＩＵｌ＆＝２２９　）と処
理担体（２８０）には有意の差は認められなかった。

実施例８ 第１の浸漬段階では、０．２グラムのＡｅｅｕｒｅｌ■
多孔性ポリマー（ポリプロピレン）粉末担体を１００ｕ
のクロロホルム（ＣＨＣＩ！ｓ）および１グラムの１）
ｕｏｎＬ６ｅｎ■Ｃの溶液に１時間浸す。担体を浴から
除き、クロロホルムで洗浄する。第２の浸漬段階の前に
、担体を８Ａエタノール（約５％のメタノールで変性し
たエタノール）で湿せる。

緩衝液は、５ＱｐＪの脱イオン水にυ、１５グラムの二
堰基性リン１歳ナトリウム２よぴ十分量のリン酸（Ｉｉ
ｓ　ＰＯ２）を刀ＵえｐＨを７．０に調整する。５０ご
リグラムの固体ウレアーゼ、（Ｓｉｇｍα化学会社。

Ｐ、Ｏ，Ｂｏｚ　ｌ　４５　Ｕ　８　＊　Ｓｔ　、Ｌｏ
ｕｉｓ　Ａ１ｉｓｓｏｗｒＡｌ１５ｓｏ；製造番号Ｕ４
００２．タテナタマメ乃）らのＩｌｌ扮禾）を緩衝溶液
に加える。湿った担体をその後緩衝希薄ウレアーゼ溶液
に浸し、−夜装置する。この第２浸漬段階の終了時、担
体をウレアーゼ溶液から除き、５００ＩＩＬｔの脱イオ
ン水で洗浄し、担体の表面にあるすべての可溶性ウレア
ーゼを除去する。

検定は１ず３．０％（Ｗ／Ｖ）尿素水溶液で０．８−の
リン酸ナトリウム（二塩基性）および十分量のリン酸を
含みｐＨを７．０に調整しである１００ａの基質を調製
する。固定化ウレアーゼ粉末を基質溶液に〃口え、磁気
撹拌子で１０分分間中かに撹拌する。この基質−粉末ス
ラリーの一部の２ミリリツトルを１００−の脱イオン水
Ｓ・よひ１ａの１ＯＮ水１便化ナトリウム浴液とただち
に混合し希釈する。Ａｃ　ｃｕｒｔｔ　Ｌ■多孔性ポリ
マー扮粉末用上に固定化されたウレアーゼの世は直接法
により決定する。

固定化ウレアーゼにより生成するアンモニアをＤｒ　ｉ
　ｏ　ｎアンモニア１Ｊｔ極によりモニターし、それは
以下の様に粉末のウレアーゼ活性と比例する：１国隙率
位＝１１Ｕ＝生　　こＮｌｉ、の　モル分 下記の表ＩＶは３つのＡｃｃ１Ｌｒｅｌ■多孔性ポリマ
ーを用い１５分検定した結果を示している：表　　■ １４９０−２１−１　　　ポリプロピレン　　　　２．
Ｂ　８８１４９０−８０−１　　　ポリプロピレン　　
　　２，９８８１４４８−１０６−１　　ナイロン６　
　　　　　１．８８８実施例４ ＠１の浸漬段階は、０．２グラムのＡｃｃｕｒｅｌ■多
孔性ポリマー（ポリプロピレン）粉末担体を１００−の
アセトン２よびｌグラムのＡｒｑｗａｄ■２Ｃの溶液に
１時間浸す。担体を浴から除き、アセトンで洗浄する。

第２の浸＠段階の前に、担体ヲ８　Ａエタノール（約５
％メタノールで変性したエタノール）で湿らせる。

緩衝液は５０αの脱イオン水に０．８ダラムの塩化ナト
リウムｐよびｏ、２２グラムの酢酸ナトリウム３水＠物
を加え、適当量の酢酸ＣＣＨ２Ｃ００Ｈ）でｐＨを７．
０に調整する。５０ミリグラムの固体ウレアーゼ（Ｓｉ
ｇｍａ化学会社、　Ｐ、Ｏ，Ｂｏｚ　１４５０８゜Ｓｔ
、Ｌｏｎｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　６８１７Ｌ　’Ｒ品
番号Ｕ４００２゜タテナタマメからの■型粉末）を緩衝
液に加える。

湿った」、４体を緩衝化した希釈ウレアーゼ溶液に浸し
、−夜装置する。この第２の浸漬段階の終了時、担体を
ウレアーゼ溶液から除き、５００１ｄの脱イオン水で洗
浄し、担体表面の１−べての可溶性ウレアーゼを除去す
る。

検定は１ず水性３．０％（Ｗ／Ｖ　）尿素溶液でＯ，ａ
％の二塩基性リン酸ナトリウムおよびｐＨを７．０に調
量Ｔるのに十分量のリン酸％、また言む１００ａの基質
を調製する。固定化ウレアーゼ粉末を基質に〃日え、磁
気撹拌子で１５分間かき葦ぜる。この基質−粉末スラリ
ーの一部の２ミＩＪ　ＩＪットルを丁ぐ１００ｄの脱イ
オン水および１ｗＬｔの１ＯＮ水酸化す）ｌラム溶液と
混合し希釈する。Ａｃｃｕｒｅｌ■多孔性ポリマー多孔
性ポリマー粉末化体上たウレア−５のブＳ七は直接法に
より決定１−る。１６１定化ウレアーゼにより生成Ｔる
アンモニアはＯｒ’ｉｏｎアンモニア電極でモニターし
、それは、以下の様に粉末のウレアーゼ活性と比例する
： ・２つのＡｃｔ、ｔｂｒｅｌ■多孔性ポリマーの試料を
用い、１５分間倹足した結果を下記の表Ｖに示した：表
　　　Ｖ １４９４−１２２−１　　　ポリプロピＬ／：／　　　
　　１．１００１４９４−１２６−１　　　ポリプロピ
レン　　　　１，３６７実施例５ Ａｒｑｕａｄ■２　Ｃ−７５（４級ジメチルジココアン
モニウムクロリド、７５％活性〕の１％（Ｗ／Ｖ）アセ
トン溶液を２０グラムの４級塩および２リツトルのアセ
トンをガラスビーカー中で混合させて調製する。第１の
浸漬段階では、４０グラムのＡｃｃｒｂｒｅｌ■ナイロ
ン６多孔性ポリマー粉末を４級塩−アセトン溶液に６０
分間沈入し、その間磁気撹拌子で撹拌する。粉末はその
後ブフナーロートで濾過し、０，５から１，０リツトル
の新しいアセトンで洗浄し、ガラス皿で１−２時間風乾
する。

人間の繊毛膜ゴナドトロピンＣＨＣＧ）はタンパク質で
ある；特に妊娠女性からのみ放出されるホルモンで、そ
の検出は妊娠試験の基礎である。８つのＩｆ　ＣＧ溶液
をＨＣＧ、チメロザル（エチル水銀チオサリチル酸ナト
リウム場、防腐剤）、おまひ脱イオン水を以下の如く混
合して調製する：表　　■ Ａ　Ｏ，７５Ｑ、０７５　８７５　０．２Ｂ　Ｏ，１５
００，１５０７５００，０２ＣＯ，０８００，８００１
，５０００，００２１ＨＣＧはＱｒｇａｎｏｎ＠限会社
（４３）ｌｏｕｔｅ　４６゜Ｐｉｎｅ　Ｂｒｏｏｌｃ、
Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅ’／　０７０５８　）より得た。

、第２の浸漬段階に２いて、ホルモンの固定化は５グラ
ムのＡｒｑｗａｄ■２Ｃ−処理Ａｃｔ、ｒｂｒｅＬ■ナ
イロン６扮末を撹拌しながら溶液Ａ中に一夜浸す。粉末
を溶液からプフナーロートを用いる濾過により除き、２
から３リツトルの脱イオン水で洗浄する。

粉末は最後には真空下１５−８０分間乾燥させ、８から
４時間風乾する。

担体の２つの他の・ものは第１の浸漬段階で元々調製し
た４０グラムの試料を他の２つのｎＣＧ溶液に浸す。特
に、ｌＯグラムのＡｒｑｕａｄ■−処理担体を溶液Ｂに
、撹拌しながら一夜浸し、２０グラムのＡｒｑｗαｄ■
２Ｃ−処理担体を撹拌しながら溶液Ｃに一夜浸す。これ
ら両刀とも上に配板した如く濾過し乾燥する。

溶液Ａ％ＢおよびＣは各々１０％、１．０％ふ・よび０
．１％の固定化レベルを持つ担体を調製する目的で処方
きれた。溶液Ａ、＆＝−よびＢ甲にυした担体の観察さ
れた固定化率は７．８％２よび１．０％であつた。溶’
ｔＬ　ＣＫ浸した担体は幾分０．１％以下の固冨化が観
祭芒れたが、この分析法の最低検出限界が０１％なので
正確に決定できない。これらの担体上に乗るＨＣＧは同
定化前および後の溶液中の１１　ＣＧレベルの差を決定
Ｔる事により間接的にｄ［η、芒れる。差Ｃまナイロン
粉末上に固定化きれるＩｊＣＧ：計に対応する。

特許出願人　　アクシナ・インコーボレーテンド第１頁
の続き ■発　明　者　ディーター・フランク アメリカ合衆国イリノイ州６０５４ ０ナパービル・セブンティファ イブス・ストリート２５ダブリユ ７１０ 手続補正書 昭和４！年ツノ月）ψ日 特許庁坂官若杉和夫殿 王事件の表示 昭和４２年特許願第　／ねｙ？Ｆ号 ２、発明の名称 １ん＞ｑ１↓◇ト上へのクンｆ　％”クリ（２ぎりでイ
し６、補正をする者 事件との関係　　特許出願人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、溶媒に溶解した長鎖陽イオンの希薄溶液中に止合体
   担体を１けく第１浸漬段階、上記担体を上記第１浸漬段
   階の間穏やかにかきまぜ、および上記４ｕ体をタンパク
   質の希薄水溶液中に浸す第２浸漬段１＠からなるタンパ
   ク質８重合体担体上に固定化する方法。 ２、上記溶媒に溶解した陽イオンの希薄毒液中に上記担
   体を５から６０分の間置き、上記担体を第２の浸漬段階
   では４時間以上浸丁事からなる特許ル１°Ｓ求の範囲第
   １項記載の方法。 ３、上記タンパク質かホルモンである特許δＮ求の１陀
   囲第１項記・ｉ、１！の方法。 ４、上記長釦陽イオンがジアミンのＮ−ココ−１゜３−
   ７アミノブロパンである特許請求の範囲第１．２または
   ３項記載の方法。 ５、上記ホルモンが人間の絨毛膜ゴナドトロピンである
   特許請求の範囲第３項記載Ｃ／）方法。 ６、ジアミン溶媒に溶解したジアミンの希薄水溶液中に
   担体曾５から６０分置くε！４１浸漬段階、上記ジアミ
   ン溶液を上記第１浸漬段階の間穏やか罠かき１ぜ、上記
   担体を上記ホルモンの水溶液中に浸す第２浸漬段階、お
   よび上記水溶液が（１，ＯＵ２チ（Ｗ／Ｖ）から０．２
   ９６　（Ｗ／Ｖ）の濃度を持ツコとからなる担体にホル
   モンを固定化する方法。 ７、溶媒に溶解した長鎖陽イオンの希薄溶液中に重合体
   担体装置く第１浸漬段階、上記担体を上記第１浸漬貧階
   中穏やかにかきまぜる、および上記担体を酵素の希薄水
   溶液中に浸す第２段４からなる上記担体上に酵素を固定
   化する方法。 ８、上記溶媒に溶解した陽イオンの希薄溶液中に上記担
   体を１０から６０分の間置き、上記担体を上記浸漬段階
   では４時間以上浸すことからなる特許請求の範囲第７項
   記載の方法。 ９、上記溶媒がアセトンである特許請求の範囲第８項記
   載の方法。 １０、上記長釦陽イオンがＮ−ココ−１，８−ジアばノ
   プロパンのジアミンである特許５１ｓ求の範囲第７．８
   または９項記載の方法。 ■、上記酵素がカタラーゼとグルコースオキシダーゼの
   ２つの酵素系である特許請求の範囲第７頂層Ｒｉ２の方
   法。 ν、上記酵Ｒがカタラーゼおよびグルコースオキシダー
   ゼの２つの酵素系である特許請求の範囲第８項記載の方
   法。 Ｂ、上を己酵索がカタラーゼおよびグルコースオキシダ
   ーゼの２つの酵素系である特許請求の範囲第９項記載の
   方法。 １１１、　上記醇累がカタラーゼおよびグルコースオキ
   シダーゼの２つの酵素系である喘・許請求の範囲第１０
   項記載の方法。 １！ｉ、加溶媒に溶解した金属塩の希薄溶液に５から１
   ０分の間担体を置く前処理段階、上記加溶媒または他の
   加溶媒で上記担体を洗浄し、ジアミン溶媒に沼解し７た
   ジアミンの希薄溶液に１０から６０＋］の間上記４Ｌ！
   体を置く第１浸漬段階、上記ジアミン溶液を上記第１浸
   漬段階の間中穏やかにかきまぜ、２よひ上記担体を０．
   ８％（Ｗ／Ｖ）のカタラーゼ水溶液中でかきまぜながら
   浸す第２浸漬段階からなる担体上に酵素を固定化する方
   法。 郭、上記塩７容媒がアセトンである特許請求の範囲第１
   ５項記載の方法。 瓦上記アミン溶媒がアセトンである特許請求の範囲第１
   ５項記載の方法。 侶、上記アミン溶媒がアセトンである特許請求の範囲第
   １６項記載の方法。 す、上記金ら塩がＳルＣｌ！　ｚ　、　２１１ｔＯであ
   る特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０、上記金属塩がＦｅＣｌ２・２１１２０である特許
   請求の範囲第１８項記載の方法。 ２１、上記ジアミンがＮ−ココ−１，８−ジアミノプロ
   パンである特許請求の範囲第１９葦たは２０項記載の方
   法。 ２２、上記酵素カタラーゼである特許請求の範囲第２１
   項記載の方法。 ２８、Ｓ　ｎｃｌ！ｔ　・２　Ｈｔ　□をアセトンに加
   え＊１％（Ｗ／Ｖ）の金属塩溶液中に多孔性直合体フィ
   ルム担体を置き前処理し； 上記金属堪溶成から５分後に上記担体を除き、上記担体
   をアセトンで洗浄し； 上記担体を６０分間Ｎ−″ココー１，８−ジアミノプロ
   パンをクロロホルムに溶８％　シｆｃ　１　’Ａ　（Ｗ
   ／Ｖ　）ジアミン溶液中に沈入させる第°１浸漬段階；
   □上記ジアミン溶液から上記担体を除き上記担体をイン
   プロパツールで湿らせ：および 上記担体を４時間以上０．８％（Ｖ／Ｖ　）のカタラー
   ゼ水溶液中に沈入させる第２浸漬段階；からなる多孔性
   乗合体フィルム担体上にカタラーゼを固定化する方法。 ２４、Ｎ−ココ−１，８−ジアミノプロパンをクロロホ
   ルムに溶解した１チ（ｗｉｖ）ジアミン溶液中に１０分
   間多孔性ポリマー扮末担体を沈入する第１浸漬段階： 上記ジアミン溶液から上記担体を除き上記担体を湿らせ
   ：３よぴ 上記担体を４時間以上脱イオン水に溶解した２、５％（
   Ｖ／Ｖ）グルコースオキシダーゼおよび０．５％（Ｖ／
   Ｖ）カタラーゼの布１８緩商溶欣中に沈入する第２の浸
   貢段１留； からなる多孔性ポリマー粉末担体上にグルコースオキシ
   ダーゼ２よぴカタラーゼを固定化する方法。