JPS601132A - 胎盤蛋白質およびその取得法 - Google Patents
胎盤蛋白質およびその取得法Info
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- JPS601132A JPS601132A JP59077640A JP7764084A JPS601132A JP S601132 A JPS601132 A JP S601132A JP 59077640 A JP59077640 A JP 59077640A JP 7764084 A JP7764084 A JP 7764084A JP S601132 A JPS601132 A JP S601132A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/5757—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncofoetal proteins
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は膜と会合された胎盤蛋白質（以下「ＭＰｌ」と
称する）ならびにその取得法に関する。
称する）ならびにその取得法に関する。
ＭＰｌはＭＰ、の検出および測定に使用されうる抗血清
の調製に使用されうる。さらにＭＰｌに対する抗体ばＭ
Ｐｌを産生する腫瘍の放射線免疫学的局限化および免疫
治療的処置に使用されうる。
の調製に使用されうる。さらにＭＰｌに対する抗体ばＭ
Ｐｌを産生する腫瘍の放射線免疫学的局限化および免疫
治療的処置に使用されうる。
本発明は下記ａ）〜ｇ）特徴すなわち
ａ） Ｃ２およびβ１グロブリンの範囲内にある電気泳
動移動度、 ｂ）等電点４．７５±０．１５、 Ｃ）沈降係数５２０Ｗ６．６５±０．１５Ｂ。
動移動度、 ｂ）等電点４．７５±０．１５、 Ｃ）沈降係数５２０Ｗ６．６５±０．１５Ｂ。
ｄ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有ポリアクリ
ルアミドゲルにおいて測定された分子量１８０．０００
±２０，０００（ここでＭＰｊの分子は、分子量９０，
０００±１０，０００を有し且つ非共有的に一緒に保持
されているみかけ上回−の準単位（サブユニットンから
構成されてぃ−る）、θ）吸光率Ｐｉ二（２８０ｎｍ
） β２：ｌ：０．４、ｆ）炭水化物割合９６±２．５
％（マンノース２．２±０．５％、ガラクトース１．７
±０．４％、７コース０．４±０．２％、Ｎ−アセチル
−グルコサミン３．２±０．８％、Ｎ−アセチル−ノイ
ラミン酸２．１±０．６％〕および ｇ）次記アミノ酸組成すなわち システィン １．６９ ２．５１ メチオニン １．９５ ０．７３ トリプトフアン １．５２ １．４０ アスパラギン酸 １１．２６ ０．６３スレオニン ５
．２１ ０．５４ セリン Ｚ６１５．６７ グルタミン酸 ９．７６ ０．６５ プロリン ５．６６ ６．８７ グリシｙ ７．７６ ０．５５ アラニン Ｂ、９６ ０．７１ バリン ６．６４ ０．２１ イソロイシン ４．０５ １．７５ ０イシン ７．９２ （１１８ チロシン ３．４６ １．０２ フエニンアラニン ３．７１ ０．９５ヒスチジン ２
．４５ ０．２９ リジン ４．８４ ０．２９ アルキニン ５．５２ １０．８９ を有する蛋白質ＭＰｊに関する。
ルアミドゲルにおいて測定された分子量１８０．０００
±２０，０００（ここでＭＰｊの分子は、分子量９０，
０００±１０，０００を有し且つ非共有的に一緒に保持
されているみかけ上回−の準単位（サブユニットンから
構成されてぃ−る）、θ）吸光率Ｐｉ二（２８０ｎｍ
） β２：ｌ：０．４、ｆ）炭水化物割合９６±２．５
％（マンノース２．２±０．５％、ガラクトース１．７
±０．４％、７コース０．４±０．２％、Ｎ−アセチル
−グルコサミン３．２±０．８％、Ｎ−アセチル−ノイ
ラミン酸２．１±０．６％〕および ｇ）次記アミノ酸組成すなわち システィン １．６９ ２．５１ メチオニン １．９５ ０．７３ トリプトフアン １．５２ １．４０ アスパラギン酸 １１．２６ ０．６３スレオニン ５
．２１ ０．５４ セリン Ｚ６１５．６７ グルタミン酸 ９．７６ ０．６５ プロリン ５．６６ ６．８７ グリシｙ ７．７６ ０．５５ アラニン Ｂ、９６ ０．７１ バリン ６．６４ ０．２１ イソロイシン ４．０５ １．７５ ０イシン ７．９２ （１１８ チロシン ３．４６ １．０２ フエニンアラニン ３．７１ ０．９５ヒスチジン ２
．４５ ０．２９ リジン ４．８４ ０．２９ アルキニン ５．５２ １０．８９ を有する蛋白質ＭＰｊに関する。
組織蛋白質の特徴的指標を説明するために以下に詳細に
述べる。
述べる。
電気泳動移動度はベックマン・インスッルメント（Ｂｅ
ｃｋｍａｎ工ｎｓ ｔｒｕｍｅｎｔｓ ）社製のミクロ
ゾーン（Ｍｉｃｒｏｚｏｎｅ） Ｒ’２００型装置を用
いアセチルセルロース箔（Ｓａｒｔｏｒｉｕａ社製品ン
上ｐＨ８，６のジエチルバルビッール酸ナトリウム緩衝
液を使用して測定された。
ｃｋｍａｎ工ｎｓ ｔｒｕｍｅｎｔｓ ）社製のミクロ
ゾーン（Ｍｉｃｒｏｚｏｎｅ） Ｒ’２００型装置を用
いアセチルセルロース箔（Ｓａｒｔｏｒｉｕａ社製品ン
上ｐＨ８，６のジエチルバルビッール酸ナトリウム緩衝
液を使用して測定された。
等電点はエル・ケー・ビー（ＬＫＢ）社製のカラムＣ４
４０ｔｎｌ）を用いて測定された。アムフォリン（Ａｍ
ｐｈｏｌｉｎ■）混合物は４．０〜６．０のｐＨ範囲を
有していた。
４０ｔｎｌ）を用いて測定された。アムフォリン（Ａｍ
ｐｈｏｌｉｎ■）混合物は４．０〜６．０のｐＨ範囲を
有していた。
沈降係数はベックマン社製の分析用超遠心器〔スビンコ
（ｓｐｉｎｃｏ ）装置Ｅ型〕中においてダブルセクタ
ーセル中６０，０００ ｒｐｍにてＵＶスキャンナー技
術を用いて２８０ ｎｍで測定された。溶媒としては０
．２モル／ｌのＮａＣ１を含有するｐＨ６，８の０．０
５モル／を燐酸塩緩衝液が用いられた。蛋白質濃度は光
学温度約３に調整された。沈降係数は２０℃の水に基い
て換算された。
（ｓｐｉｎｃｏ ）装置Ｅ型〕中においてダブルセクタ
ーセル中６０，０００ ｒｐｍにてＵＶスキャンナー技
術を用いて２８０ ｎｍで測定された。溶媒としては０
．２モル／ｌのＮａＣ１を含有するｐＨ６，８の０．０
５モル／を燐酸塩緩衝液が用いられた。蛋白質濃度は光
学温度約３に調整された。沈降係数は２０℃の水に基い
て換算された。
８Ｄ８を含有するポリアクリルアミドゲル中における分
子量の測定は０．１ｒ／１００−のドデシル硫酸す）
ＩＪウム（ＳＤＳ ）を含有するＺ５または１０ｒ／１
００ｔｎｔのポリアクリルアミド（ＦＡＡ ）を有する
ゲルが使用された。未修正の分子量を測定するには水ま
たは稀（０，０１モル／ｌ）ト’）ス緩衝液中に溶解さ
せたＭＰｌを用いる。準単位（サブユニット）の分子量
を測定するにはその物質を適用前に１ｆ／１００−のＢ
ＤＢ溶液中６０℃で１０分間加熱した。比較物質として
トランスフェリン、ヒトアルブミンおよびその集合物が
用いられた。
子量の測定は０．１ｒ／１００−のドデシル硫酸す）
ＩＪウム（ＳＤＳ ）を含有するＺ５または１０ｒ／１
００ｔｎｔのポリアクリルアミド（ＦＡＡ ）を有する
ゲルが使用された。未修正の分子量を測定するには水ま
たは稀（０，０１モル／ｌ）ト’）ス緩衝液中に溶解さ
せたＭＰｌを用いる。準単位（サブユニット）の分子量
を測定するにはその物質を適用前に１ｆ／１００−のＢ
ＤＢ溶液中６０℃で１０分間加熱した。比較物質として
トランスフェリン、ヒトアルブミンおよびその集合物が
用いられた。
吸光率の測定には物質１＃ｖを蒸留水中に溶解させて１
−の溶液とした。
−の溶液とした。
炭水化物は下記のようにして測定された。すなわち配糖
体結合を加水分解後に遊離された中性糖をボレート複合
体として陰イオン交換体カラ人で分離し［ｒＡｎａｌ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 」第２７巻第５６７頁（１９６９
年）参照〕、溶出液中にビシンコニン酸第１ ｆｌｉ；
ｌ試薬を混合することにより着色させ〔（Ａｎａｌ。
体結合を加水分解後に遊離された中性糖をボレート複合
体として陰イオン交換体カラ人で分離し［ｒＡｎａｌ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 」第２７巻第５６７頁（１９６９
年）参照〕、溶出液中にビシンコニン酸第１ ｆｌｉ；
ｌ試薬を混合することにより着色させ〔（Ａｎａｌ。
Ｂｉｏａｈｅｍ、 Ｊ第５６巻第４４０頁（１９７３年
〕参照〕そして内部標準としてラムノースを使用して定
量的に測定した。アミノ糖はニンヒドリンとのその反応
により検出されそして測定された。ノイラミン酸含量は
ウォレン（ＷａｒｒｅｎＪ氏による方法〔「Ｍｅｔｈｏ
ｄｏ−１ｎ Ｅｎｚｙｍｏ１ｏｇ７Ｊ第■巻第４６３〜
４６５頁（１９６３年〕参照〕を用いて測定された。
〕参照〕そして内部標準としてラムノースを使用して定
量的に測定した。アミノ糖はニンヒドリンとのその反応
により検出されそして測定された。ノイラミン酸含量は
ウォレン（ＷａｒｒｅｎＪ氏による方法〔「Ｍｅｔｈｏ
ｄｏ−１ｎ Ｅｎｚｙｍｏ１ｏｇ７Ｊ第■巻第４６３〜
４６５頁（１９６３年〕参照〕を用いて測定された。
アミノ酸分析はニス・ムーブ（Ｓ １Ｍｏｏｒｅ ）氏
等のｒ Ａｎａｌ 、 Ｃｈｅｍ 、 Ｊ第３０巻第１
１８５頁（１９５８年）に記載された方法に従い、ベッ
クマン社の液体クロマトグラフィー用マルチクローム（
Ｍｕｌｔｉｃｈｒｏｍ）Ｂ装置を使用して実施された。
等のｒ Ａｎａｌ 、 Ｃｈｅｍ 、 Ｊ第３０巻第１
１８５頁（１９５８年）に記載された方法に従い、ベッ
クマン社の液体クロマトグラフィー用マルチクローム（
Ｍｕｌｔｉｃｈｒｏｍ）Ｂ装置を使用して実施された。
シスチンは蛋白質を過蟻酸を用いて酸化し［ｒ Ａｎａ
ｌ、Ｃｈｅｍ 、 Ｊ第５０巻第１１８５頁（１９５８
年）参照〕そして次にり四マドグラフィー（［、Ｔ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 Ｊ第２３８巻第２３５頁（１９６
５年）参照］した後システィン酸として測定された。ト
リプトファン含量はエッチ・エーデルホフ（Ｈ，Ｅｄｅ
ｌｈｏｃｈ）氏のｒ Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙＪ第
６巻第１９４８頁（１９６７年）記載の方法により直接
測光測定された。
ｌ、Ｃｈｅｍ 、 Ｊ第５０巻第１１８５頁（１９５８
年）参照〕そして次にり四マドグラフィー（［、Ｔ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 Ｊ第２３８巻第２３５頁（１９６
５年）参照］した後システィン酸として測定された。ト
リプトファン含量はエッチ・エーデルホフ（Ｈ，Ｅｄｅ
ｌｈｏｃｈ）氏のｒ Ｂｉｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙＪ第
６巻第１９４８頁（１９６７年）記載の方法により直接
測光測定された。
本発明はさらに、
（１）分娩に際して得られるような成熟した人間の胎盤
を粉砕し、生理塩溶液を用いてすべての可溶性成分が除
去されるまで洗いそしてかくしテ９９ ｒ）ｔｔ だ組
織’ｉＱ 留１１１ｔ”ｌ ’ｆ １１．５−５ Ｆ
、／ １ｎ ｎ −Ｆｒ Ｕｐビイオン洗浄剤を含有す
る溶液好ましくは２ゴ／ＩＤ０ｍｇのポリエチレングリ
コール−ｐ−イソオクチルフェニルエーテルを含有する
溶液を用いて抽出し、上澄み液を分離し、水または緩衝
溶液で透析しそして濃縮し、 （２）得られた溶液中に含有される可溶化された胎盤の
組織抗原を免疫吸着によりさらに富化させ、そして （３）免疫吸着後に抗原が富化された溶液をゲルｐ過に
より分離しそして蛋白質ＭＰ１を純粋な形態で取得する ことを特徴とする膜と連合した胎盤蛋白質ＭＰ１の取得
法にも関する。
を粉砕し、生理塩溶液を用いてすべての可溶性成分が除
去されるまで洗いそしてかくしテ９９ ｒ）ｔｔ だ組
織’ｉＱ 留１１１ｔ”ｌ ’ｆ １１．５−５ Ｆ
、／ １ｎ ｎ −Ｆｒ Ｕｐビイオン洗浄剤を含有す
る溶液好ましくは２ゴ／ＩＤ０ｍｇのポリエチレングリ
コール−ｐ−イソオクチルフェニルエーテルを含有する
溶液を用いて抽出し、上澄み液を分離し、水または緩衝
溶液で透析しそして濃縮し、 （２）得られた溶液中に含有される可溶化された胎盤の
組織抗原を免疫吸着によりさらに富化させ、そして （３）免疫吸着後に抗原が富化された溶液をゲルｐ過に
より分離しそして蛋白質ＭＰ１を純粋な形態で取得する ことを特徴とする膜と連合した胎盤蛋白質ＭＰ１の取得
法にも関する。
例えば分離操作からのフラクション中においてＭＰｌを
検出および測定するには所定のパラメーターと並んで免
疫化学的方法も役立てられ５る。何故ならＭＰｌは抗原
性質を有するからであする。動物にこの蛋白質を用いて
免疫賦与すると・特異的な抗体が形成される。
検出および測定するには所定のパラメーターと並んで免
疫化学的方法も役立てられ５る。何故ならＭＰｌは抗原
性質を有するからであする。動物にこの蛋白質を用いて
免疫賦与すると・特異的な抗体が形成される。
ＭＰＩの取得法において使用される抗体はポリエチレン
グリコール−ｐ−インオクチルフェニルエーテルを用い
て可溶化した蛋白フラクションで家兎に免疫賦与するこ
とにより得られる。
グリコール−ｐ−インオクチルフェニルエーテルを用い
て可溶化した蛋白フラクションで家兎に免疫賦与するこ
とにより得られる。
本発明の方法により得られた精製されたＭＰｌを用い既
知方法で動物に免疫賦与することによ鳴 り単一特異性抗血清が調製されうる。
知方法で動物に免疫賦与することによ鳴 り単一特異性抗血清が調製されうる。
かかる抗血清は一方ではＭＰｌの免疫学的検出に、そし
てもう一方ではＭＰｌの富化および単離に使用されうる
免疫吸着剤の調製に役立てられ５る。
てもう一方ではＭＰｌの富化および単離に使用されうる
免疫吸着剤の調製に役立てられ５る。
第１ａ図はＭＰｌと家兎の特異的な抗血清との免疫学的
反応を寒天含有ゲル中の電界で分離後に示す。
反応を寒天含有ゲル中の電界で分離後に示す。
第１ｂ図はこれと比較してヒト血清（Ｈ８）に対する家
兎の抗血清とのその免疫反応により目で見うるようにな
された血清蛋白質の分離を示す。
兎の抗血清とのその免疫反応により目で見うるようにな
された血清蛋白質の分離を示す。
λ４Ｐ１を免疫学的に検出する炉はオウヒターロニイ（
Ｏｕｃｈｔｅｚ４ｏｎｙ ）によるゲル拡散法〔シュル
ツエ５ｃｈｕｌｔｚｅおよびＨｅｒｅｍａｎｓ両氏編ｒ
Ｍｏ’ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｕｍａ
ｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｊ第１巻第１３４頁参照〕また
は必要な場合は放射線免疫検定または酵素免疫検定のよ
うな一層感度の良い方法も用いられうる。
Ｏｕｃｈｔｅｚ４ｏｎｙ ）によるゲル拡散法〔シュル
ツエ５ｃｈｕｌｔｚｅおよびＨｅｒｅｍａｎｓ両氏編ｒ
Ｍｏ’ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｕｍａ
ｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｊ第１巻第１３４頁参照〕また
は必要な場合は放射線免疫検定または酵素免疫検定のよ
うな一層感度の良い方法も用いられうる。
ＭＰｌの検出および測定は診断上重要である。
ＭＰｌは胎盤「ｑ′Ｊｆ異的」蛋白質であると考えられ
る。血清中におけるかかる蛋白質の濃度は一般に妊娠が
進行すると共に上昇する。それゆえこれらは妊娠監視の
ためのノ々ラメ−ターとじて使用されうる。しかしなが
ら−、方では胎盤特異的蛋白質はまた腫瘍を有する患者
において血清中かまたはｍｔａ組織中にしばしば検出さ
れうる。
る。血清中におけるかかる蛋白質の濃度は一般に妊娠が
進行すると共に上昇する。それゆえこれらは妊娠監視の
ためのノ々ラメ−ターとじて使用されうる。しかしなが
ら−、方では胎盤特異的蛋白質はまた腫瘍を有する患者
において血清中かまたはｍｔａ組織中にしばしば検出さ
れうる。
それゆえこれらはかかる患者において疾患進行の監視ま
たは治療の制御のための目安として使用されうる。
たは治療の制御のための目安として使用されうる。
ＭＰＩはまた１４Ｐｌの検出および測定に役立てられう
る抗血清の調製にも使用されうる。
る抗血清の調製にも使用されうる。
一方ではＭＰｌに対する抗体はＭＰｊを産生ずる腫瘍の
放射線免疫学的局限化および免疫治療的処置に使用され
うる。
放射線免疫学的局限化および免疫治療的処置に使用され
うる。
下記の例により本発明をさらに説明する。
例 １
１．１ 胎盤の粉砕および洗浄
膜と連合した蛋白質ＭＰ１を単離するために分娩に際し
て得られるような成熟した人間の胎盤を使用した。この
胎盤をはじめ一２０℃に冷凍させ、冷凍された状態で切
断混合機（カッター〕を用いて粉砕しそして使用までこ
の形態で一２０℃で貯蔵した。次に生理食塩溶液で洗浄
することによりすべての可溶性組織蛋白質を除去した。
て得られるような成熟した人間の胎盤を使用した。この
胎盤をはじめ一２０℃に冷凍させ、冷凍された状態で切
断混合機（カッター〕を用いて粉砕しそして使用までこ
の形態で一２０℃で貯蔵した。次に生理食塩溶液で洗浄
することによりすべての可溶性組織蛋白質を除去した。
そのためには粉砕された胎盤組織５００ｆに食塩溶液７
００−を加え、短時間均質化させ、次に４℃で数時ｍ月
姿拌しそして終りに遠心分離した。
００−を加え、短時間均質化させ、次に４℃で数時ｍ月
姿拌しそして終りに遠心分離した。
上澄み液を捨て、残留物を新たに食塩溶液７００ｍｅと
数時間指押しそして再び遠心分離した。この洗浄４！ｖ
！作を合Ｇ１６回反復した。この方法で胎盤組織から溶
性成分を実質的に除去した。
数時間指押しそして再び遠心分離した。この洗浄４！ｖ
！作を合Ｇ１６回反復した。この方法で胎盤組織から溶
性成分を実質的に除去した。
１．２トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ■）Ｘ−１００を用いる
胎盤組織の抽出 組織残留物を水１０〇−中のポリエチレングリ：ｆｆ
−ルー ｐ −インオクチルフェニルエーテル〔トリト
ｙｘ−１００３２−の溶液各７００ｍｇずつを用いて３
回抽出し、その際４℃でそれぞれ２゜時間攪拌しそして
次に遠心分離除去した。この抽出液をはじめ水そして次
に１そル／ｌのＮａＣｔおよび１２／ｌのナトリウムア
ジドを含有する０、１モ＋／ ｔ（１） ） リス−Ｈ
Ｃｔ緩衝液（ｐＨａｏ）（緩衝溶液■）で透析した。透
析物を限外ｒ過器〔アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）社製品〕
上ＰＭ −１０膜を使用してそれぞれ約２００ｍｅまで
濃縮した。胎盤組織５００２の残留物からの抽出物は平
均して合計２２■のＭＰｌを含有していた（フラクショ
ンＡ）。
胎盤組織の抽出 組織残留物を水１０〇−中のポリエチレングリ：ｆｆ
−ルー ｐ −インオクチルフェニルエーテル〔トリト
ｙｘ−１００３２−の溶液各７００ｍｇずつを用いて３
回抽出し、その際４℃でそれぞれ２゜時間攪拌しそして
次に遠心分離除去した。この抽出液をはじめ水そして次
に１そル／ｌのＮａＣｔおよび１２／ｌのナトリウムア
ジドを含有する０、１モ＋／ ｔ（１） ） リス−Ｈ
Ｃｔ緩衝液（ｐＨａｏ）（緩衝溶液■）で透析した。透
析物を限外ｒ過器〔アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）社製品〕
上ＰＭ −１０膜を使用してそれぞれ約２００ｍｅまで
濃縮した。胎盤組織５００２の残留物からの抽出物は平
均して合計２２■のＭＰｌを含有していた（フラクショ
ンＡ）。
例２ 免疫吸着によるＭＰｌの富化
２．１ 免疫西着剤の調製
家兎を可溶化された胎盤蛋白質（フラクションＡ）を用
いて免疫賦与することにより多価抗血清を調製した。こ
のものはＭＰｉに対する抗体もそしてまたトリトンＸ−
１００で可溶化された他の組織抗原に対する抗体をも含
有した。かかる抗血清プール３５０ゴをａ０２モル／ｌ
の燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）で透析しそして免疫グロ
ブリンを分離するために同じ緩衝液を用いＤＥＡＥセル
ロースでクロマトグラフ処理した。通過液（蛋白質５．
６５ｙ）中の免疫グロブリンフラクションをブロムシア
ン４５．６２を用いて活性化した球形の特別に精製した
アガロース［Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製品、セファロース
（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ■））３６３ｒと反応させそしＣ
」−４体に共有結合させた。この方法はアキセン（Ａｘ
ｅｎ ）代地により［ＮａｔｕｒｅＪ第２１４巻第１３
０２頁（１９６７年）に記載されている。この方法で調
製された免疫吸着剤を用いてＭＰ、を他の可溶化された
抗原と共に胎盤フラクションＡからさらに富化できた。
いて免疫賦与することにより多価抗血清を調製した。こ
のものはＭＰｉに対する抗体もそしてまたトリトンＸ−
１００で可溶化された他の組織抗原に対する抗体をも含
有した。かかる抗血清プール３５０ゴをａ０２モル／ｌ
の燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）で透析しそして免疫グロ
ブリンを分離するために同じ緩衝液を用いＤＥＡＥセル
ロースでクロマトグラフ処理した。通過液（蛋白質５．
６５ｙ）中の免疫グロブリンフラクションをブロムシア
ン４５．６２を用いて活性化した球形の特別に精製した
アガロース［Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製品、セファロース
（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ■））３６３ｒと反応させそしＣ
」−４体に共有結合させた。この方法はアキセン（Ａｘ
ｅｎ ）代地により［ＮａｔｕｒｅＪ第２１４巻第１３
０２頁（１９６７年）に記載されている。この方法で調
製された免疫吸着剤を用いてＭＰ、を他の可溶化された
抗原と共に胎盤フラクションＡからさらに富化できた。
２．２ 免疫吸着の実施
免疫吸着剤を緩衝溶液■に懸濁させ、クロマトグラフィ
ー用カラム（５，０Ｘ２０σ）に充填しそして緩衝溶液
■で洗った。次に７ラクシヨンＡをカラムに適用すると
その際ＭＰｊおよび他の可溶化された抗原が免疫吸着的
に結合された。次にこのカラムを緩衝液■で充分に洗浄
した。続いて吸着された蛋白質を６モル／ｌの尿素溶液
約６００−を用いてカラムから溶離させた。ＭＰｊを含
有する溶出液を緩衝溶液■で透析しそして限外沢過器を
用いて約２０ｍ７！まで濃縮した。１吸着当りの収量は
ＭＰｊ約５〜１０りであった。カラム中の吸着剤を蛋白
質の溶離後直ちに緩衝溶液■を用いて再び中和しそして
充分に洗浄した。
ー用カラム（５，０Ｘ２０σ）に充填しそして緩衝溶液
■で洗った。次に７ラクシヨンＡをカラムに適用すると
その際ＭＰｊおよび他の可溶化された抗原が免疫吸着的
に結合された。次にこのカラムを緩衝液■で充分に洗浄
した。続いて吸着された蛋白質を６モル／ｌの尿素溶液
約６００−を用いてカラムから溶離させた。ＭＰｊを含
有する溶出液を緩衝溶液■で透析しそして限外沢過器を
用いて約２０ｍ７！まで濃縮した。１吸着当りの収量は
ＭＰｊ約５〜１０りであった。カラム中の吸着剤を蛋白
質の溶離後直ちに緩衝溶液■を用いて再び中和しそして
充分に洗浄した。
これは可溶化された抗原の免疫吸着的結合にあらためて
使用される。
使用される。
３、ゲル濾過によるＭＰＩの単離
他の免疫吸着的に結合した抗原からのＭＰｉの分離はア
クリルアミドアガロースＡｃＡ −３４（′ＩＪＪ３社
製品）でのゲル濾過により実施された。このためには免
疫吸着により得られた７ラクシヨン１０個を合し、６０
−まで濃縮しそして緩衝溶液Ｂを使用してＡｃＡ −３
４カラム（５ｘ１１０ｃｒｎ）でクロマトグラフ処理し
た。その際ＭＰｊは大抵より高い分子量（２００，００
０以上）を有しそしてそれゆえＭＰｊより速かにカラム
を移動するが、またははるかに小さい分子量を有してお
りそしてＭＰｌの後にはじめてカラムから溶離される他
の可溶化された膜抗原から明瞭に分離された。ＭＰｌの
主要量を含有しておりそして他の抗原を含有しないフラ
クションを合し、水で透析しそして凍結乾燥した。ＭＰ
ｊの収量は約１５ ｒｑであった。
クリルアミドアガロースＡｃＡ −３４（′ＩＪＪ３社
製品）でのゲル濾過により実施された。このためには免
疫吸着により得られた７ラクシヨン１０個を合し、６０
−まで濃縮しそして緩衝溶液Ｂを使用してＡｃＡ −３
４カラム（５ｘ１１０ｃｒｎ）でクロマトグラフ処理し
た。その際ＭＰｊは大抵より高い分子量（２００，００
０以上）を有しそしてそれゆえＭＰｊより速かにカラム
を移動するが、またははるかに小さい分子量を有してお
りそしてＭＰｌの後にはじめてカラムから溶離される他
の可溶化された膜抗原から明瞭に分離された。ＭＰｌの
主要量を含有しておりそして他の抗原を含有しないフラ
クションを合し、水で透析しそして凍結乾燥した。ＭＰ
ｊの収量は約１５ ｒｑであった。
第１ａ図はＭＰｊと家兎の特異的な抗血清との免疫学的
反応を寒天含有ゲル中の電界での分離後に示す。 第１ｂ図はこれと比較してヒト血清（Ｈｓ）に対する家
兎の抗血清とのその免疫反応により視認しうるようにな
された血清蛋白質の分離を示す。 特許出、顆人 ベーリングヴエルケ・アクチェンゲゼル
シャフト
反応を寒天含有ゲル中の電界での分離後に示す。 第１ｂ図はこれと比較してヒト血清（Ｈｓ）に対する家
兎の抗血清とのその免疫反応により視認しうるようにな
された血清蛋白質の分離を示す。 特許出、顆人 ベーリングヴエルケ・アクチェンゲゼル
シャフト
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）下記ａ）〜ｇ）すなわち ａ）α２およびβ１グロブリンの範囲内にある電気泳動
移動度、 ｂ）等電点４．７５±０．１５、 Ｃ）沈降係数Ｓ９ｏｗ６−６ｓ±０．１５８゜ｄ） ド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有ポリアクリルアミ
ドゲルにおいて測定された分子量１８０，０００±２０
，０００（ここで蛋白質ＭＰｊの分子は分子量９ｆｌ、
０００±１０，０００を有しそして非共有的に一緒に保
持されているみかけ上回−の準単位（サブユニット）か
ら構成されている〕、 ｅ）吸光率＜（２８０ｎｍ ） ａ２土０．４、ｆ）炭
水化物割合９６±２．５％（マンノース２．２±１５気
ガンクトース１．７±Ｑ、４嘔、フコース０．４±ａ２
％、Ｎ−７セチルーグルコサミン＆２±（Ｌ８％、Ｎ−
アセチル−ノイラミン酸２．１±ａ６嗟〕、および ｇ）次のアミノ酸組成すなわち システィン １．６９ ２．５１ メチオニン １．９５ ０．７３ トリプトフアン １．５２ １．４０ アスノ４ラギン酸 １１．２６ α６３スレオニン ５
．２１ ０．５４ セリン ７．６１ ５．６７ グルタミン酸 ９．７６ ０．６５ プロリン ５．６６ ６．８７ グリシン ７．７６ ０．５５ アラニン ＆９６ ０．７１ バリ：／ ６．６４ ０．２１ インロイシン ４．０５ １．７５ ロイシン ７．９２ ０．１８ チロシン ６．４６ １．０２ フエニンアラニン ３．７１ ０．９５ヒスチジン ２
．４３ ０．２９ リジン ４．８４ ０．２９ アルギニン ５．５２ １０．８９ を特徴とする、蛋白質（ＭＰｌ）。 ２）下記ａ）〜ｇ）すなわち ａ）α２およびβ１グロブリンの範囲内にある電気泳動
移動度、 ｂ）等電点４．７５±０，１５、 Ｃ）沈降係数８２０．Ｗ ６．６５±０．１５８゜ｄ）
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有ポリアクリル
アミドゲルで測定された分子量１８０．０００±２０，
０００（ここで蛋白質（ＭＰｌ）の分子は分子［９０，
０００±１０，０００を有しそして非共有に一緒に保持
されているみかけ上向−の準単位（ザブユニット）から
構成されている〕、 ｅ）吸光率Ｅｉ二（２８０ｎｍ ） ８．２±０．４、
ｆ）炭水化物割合９６±２．５％（マンノース２．２±
０．５％、ガラクトース１．７±０，４係、フコース０
．４±０，２％、Ｎ−アセチル−グルコサミン６．２±
０．８％、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸２．１±０．６
％）、および ｇ）次のアミノ酸組成すなわち システィン １．＋Ｓ９ ２．５１ メチオニン １．９５ ０．７３ トリプトフアン １．５２ １．４０ アスパラギン酸 １１．２６ ０．６３スレオニン ５
，２１ ０．５４ セリン ７．６１ ５．６７ グルタミン酸 ９．７６ ０．６５ プロリン ５．６６ ６．８７ グリシン ７．７６ ０．５５ アラニン β９６ ０．７１ バリン ６．６４ ０．２１ イソロイシン ４．０５ １．７５ ０イシン ７．９２ ０．１８ チロシン ３．４６ １．０２ フエニンアラニン ３．７１ ０．９５ヒスチジン ２
．４５ ０．２９ リジン ４．８４ ０．２９ アルギニン ５．５２ １０．８９ を有する蛋白質ＭＰｉを取得するに当り、（１）分娩に
際して得られるような成熟した人間の胎盤を粉砕し、生
理塩溶液を用いてすべての司溶性成分が除去されるまで
洗いそしてかくして得られた組織残留物を０．５〜５９
／１００−の非イオン系洗浄剤を含有する溶液好ましく
は２ｔｄ／１００ｍのポリエチレン ′りＩＪコール−
ｐ−インオクチルフェニルエーテルを含有する溶液を用
いて抽出し、上澄み液を分離し、水または緩衝溶液で透
析しそして濃縮し、 （２）得られた溶液中に含有される可溶化された胎盤の
組織抗原を免疫吸着によりさらに富化させ、そして （３）免疫吸着後に抗原が富化された溶液をゲル濾過に
より分離しそして蛋白質ＭＰ１を純粋な形態で取得する ことを特徴とする方法。 ３） ＭＰｊに対する抗体の調製、ＭＰｌの検出および
測定、ならびにＭＰｌを産生ずる腫瘍の放射線免疫学的
局限化および免疫治療的処置への前記特許請求の範囲第
１項記載の蛋白質の使用０
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE33142939 | 1983-04-20 | ||
| DE19833314293 DE3314293A1 (de) | 1983-04-20 | 1983-04-20 | Membran-assoziiertes plazentaprotein (mp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS601132A true JPS601132A (ja) | 1985-01-07 |
Family
ID=6196864
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59077640A Pending JPS601132A (ja) | 1983-04-20 | 1984-04-19 | 胎盤蛋白質およびその取得法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0125514A2 (ja) |
| JP (1) | JPS601132A (ja) |
| AU (1) | AU2711184A (ja) |
| DE (1) | DE3314293A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4755460A (en) * | 1984-07-06 | 1988-07-05 | The Regents Of The Univ. Of Minnesota | Bovine antigen glycoprotein, related antibody, and use in detection of pregnancy in cattle |
-
1983
- 1983-04-20 DE DE19833314293 patent/DE3314293A1/de not_active Withdrawn
-
1984
- 1984-04-14 EP EP84104244A patent/EP0125514A2/de not_active Withdrawn
- 1984-04-19 AU AU27111/84A patent/AU2711184A/en not_active Abandoned
- 1984-04-19 JP JP59077640A patent/JPS601132A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0125514A2 (de) | 1984-11-21 |
| AU2711184A (en) | 1984-10-25 |
| DE3314293A1 (de) | 1984-10-25 |
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