JPS6012576B2 - サイモポイエチンの免疫検定 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、サィモポイェチン（比のｍｏｐｏｉｅｔｉｎ
）の免疫検定に関する。

サイモポイェチンは胸腺のポリベプチド・ホルモンで、
これは前胸腺細胞の胸腺細胞への分化をうながし、又神
経筋肉伝達に二次的効果を有するものである。

サイモポイェチン１と０と命名した牛のサィモポィェチ
ンの一つの型が分離されており、免疫学的に交差反応性
であることが示されている。（サィモポィェチンは現在
元の名前のサイミン（ｔｈｙｍｉｎ）よりも多く用いら
れている。）ジー・ゴールドスタイン，ネイチヤ−（Ｇ
．奴ｌｄ−ｓｐｉｎ，ｎａｔｍｅ），２４７，１１（１
９７４）を参照のこと。サィモポイェチンは、Ｔ細胞分
化への効果や神経筋肉伝達への効果を用いてバイオアツ
セイにより検出できるが、これらアツセィは複雑で、時
間を取り、又標準化がむつかしい。

更に、免疫検定とは異なり、特に放射免疫検定とは異な
り、バイオアッセィは容易に自動化できず、又それ故経
済的方法で多数のサンプルの振り分けを行う臨床研究室
やその他の診断的施設では日常的に採用することができ
なかった。好ましい免疫検定は、血数や血清のような生
物学的液体サンプルにおける該ホルモンの約０．１ｎｇ
／の‘までの感度を有する。

それ故「 サィモポィェチンの高濃度（重症性筋無力症
）や低濃度（老化，免疫欠如又は免疫学的中介疾病，癌
，栄養失調，感染症など）を示す疾病状態に対する診断
的テストとしてこの当該検定を採用することができる■
サィモポイェチンの一つの型は免疫検定法では識別で
きない。この当該検定のための抗体を調製するのに用い
られる抗原はそれ自体知られている方法でサィモポィェ
チンと免疫原担体物質とを結合させることにより容易に
得られる。

このような結合は、好ましくは、適当な二官能性結合基
を用いることにより得られる。この目的に好ましい二官
能性結合基はグルタルアルデヒドの如きＣ２−７ ジア
ルカナルである。こ）に用いられているように“免疫原
担体物質（ｊｍｍｕｎｏｇｅｎｌｃｃａｍｅてｍａｔｅ
ｒｉａｌゾという語は、宿主の動物における免疫原的反
応を独立的に引出す性質を持ちＬ又サィモポィェチンと
結合し得る物質を含むことを意味している。

適当な担体物質としては例えば、蛋白質；ポリリジンや
アミノ酸の共重合体のようなポリベプチド類のような天
然又は合成の重合化合物：ポリサッカラィドなどを含む
。特に好ましい担体物質は蛋白質とポリベプチドで、殊
に蛋白質がそうである。本発明の抗原の調製に用いられ
る蛋白質物質の確認は臨界的なものではない。

本発明の実施において有用な適切な蛋白質の例には、隅
乳類の血清蛋白質がある。例えば、人間のガンマ。グロ
プリン，人間の血清アルブミン，牛の血清アルブミン，
ミチル化した牛の血清アルブミン，ウサギの血清アルプ
ミン，牛のガンマ。グロブリン，及び馬のガンマ・グロ
ブリンがある。他の適当な蛋白質についてはこの技術に
堪能な人には示唆されよう。結果として得られる抗原が
用いられるであろう動物宿王とは縁のない蛋白質を用い
ることは一般に好ましいことではあるが、必須のことで
はない。サィモポィヱチンと免疫原担体物質とのカップ
リングは、この技術において既知の方法で行うことがで
きる。

好ましい方法としては等価結合や、例えば静電気的な物
理的結合がある。それ故、例えばカップリングが等価結
合が得られるように行われる場合には、例えばグルタル
アルデヒドのような二官能性結合基を、ェス．アブラミ
ーズ・ィミユノケミストリイ（Ｓ．Ａｖｒａｍｅａｓ，
ｌｍｍ肌ｏ−ｃｈｅｍｉｓｏｙ），６，４３（１９６９
）に述べてある条件下で用いてもよい。二官能性結合基
の使用がサィモポィェチンと免疫原担体物質との等価結
合を得るのに好ましい方法である一方、結合のための他
の方法も利用し得る。

このような方法の一つで、“サイエンス”（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ），１４巻１３４４〜１３４６ページ（１９６乎王
６月１２日発行）に述べてあるカーボジィミド法を用い
てもよい。この論文に述べてあるように、カルポキシ酸
とアミンを含む多くの型の官能器を含む物質を結合する
のにカーボジイミドを用いることができる。この別法に
おいて、カップリングが進行して「“サイエンス”のこ
の論文に述べてある方法でアミド結合を通じてサイモポ
ィェチンは蛋白質とカップリングすることにより等価結
合が形成される。シアネート類を用いての等価結合のも
つ一つの方法も用い得ることが１９７必宅１月２９日付
の米国特許地．３．７８８，９４８にでている。この担
体とサイモポィェチンとの結合は又物理的手段によって
も得られる。例えば、静電気結合でもこの技術に裏既陳
した人々に既知の手段を用いて行う。この方法は担体と
サィモポィェチンとのＺ錨化合物の形成により進行し、
“メソッド・ィン・イミユノロジイ・アンド・イミユノ
ケミストリ イ ”（ Ｍｅ仇ｏｄｓ ｌｎ ｌｍｍ皿
ｏｌｏ劉 ａ肘ｌｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔひ）カーチ
ス・エイ・ウイリアムス（ＣｍｔｉｓＡＷｉｌｌｉａｍ
ｓ）線，第１巻，アカデＺミツク・プレス（Ａｃａｄｅ
ｍｉｃＰｒｅｓｓ）（１９６７）に述べてあるように行
われる。他の方法は、１９７必王１２月ｌｏ日付の米国
特許Ｎｏ．３，８鼠 鱗７に述べてある。もちろん、こ
の技術に裏糊陳した人々に知られて２いる他の方法も又
、サィモポィェチンと笹体とを結合するのに用いられる
ものと理解されるものとする。

本発明の抗原を用いて宿主動物にこの抗原を既知の方法
により好ましくはフ。

インド補助液を用いて注射することにより、宿主の中に
サイモポィェチンに特別の抗体を生ぜしめる。一定期間
注射をくり返すことにより、よりよい力価が得られる。
この目的に通した宿主動物にはウサギ，馬，ヤギ，モル
モット，ラツト，牛，ヒツジなどの縄乳類がある。結果
として得られる抗血清は、上述の如くサィモポィェチン
又はそれから作られた抗原のいずれかと選択的に結合す
る抗体を含んでいるであろう。本発明により作られたサ
ィモポィェチンに特定の抗体はサイモボイェチンについ
ての免疫検定の試薬として有用である。

好ましい実施形態では、０．１Ｍ硫酸塩−綾衡生理食塩
水府６．５中の５％牛のガンマ・グロブリンのような適
当な緩衛液で希釈した抗血清を標準又はテストサンプル
及び放射能標識サイモポイェチンの既知量のいずれも、
歌℃緩衡液中に溶解したものと混合する。テストサンプ
ル中に存在するサィモポィェチンの量を次いで種々の方
法で測定する。

第一の方法では、上記の成分を混合し、その混合物を室
温に数時間放置した後、抗体一抗原複合体を冷たい３０
％ポリエチレン・グリコールを用いて沈澱せしめた。遠
心分離後、上ずみ液を吸引し、沈澱物中の放射能を調べ
た。このサンプル中のサィモポィヱチン含有量を次いで
それ自体既知の方法で標準曲線に認められる放射能レベ
ルと比較して決定することができる。適当な標準曲線は
、既知量のサィモポィェチンを標識サィモポィェチンと
サィモポィェチンに特定の抗体の一定量と混合し、各既
知量に対する結合の度合いを測定して作ることができる
。抗原一抗体複合体を除去するための分離法では二種類
用いることができる。

このような二種類の方法は事実、検定についての感渡が
よりよいために、上記のポリエチレン・グリコール法よ
りも好ましい。このような方法の一つでは、二重抗体法
を用いている。

上記の三成分による検定反応用混合物の培養後、最初の
検定用抗体に対して他の噸乳類より得た抗体を加え、こ
れら成分を混合し、次いで室温に５〜１２０分間放置後
、この混合物を遠沈する。上ずみ液を吸引後、沈澱物に
ついて放射能を測定し、サンプル中のサィモポィェチン
濃度を上記標準曲線より決定する。もう一つの方法では
抗体−抗原複合体の分離を助けるためにデキストラン被
覆チャコールを用いる。

この方法では「デキストラン被覆チャコールを培養後に
検定用反応系に加える。約４℃の低温０を用いる。約３
０分間約４℃に放置後、混合物を遠沈し、上ずみ液を吸
引する。沈澱物について放射能を測定し、この方法では
この放射能は“非結合”サィモポイヱチンを表わす。本
検定システムの好ましい実施形態では、タ皮℃穣衡系に
用いられた生理食塩水を山ＭＫＣＩに置きかえる。

この代替により、付随する感度の低減ないこ検定中にお
ける非特異性結合が減る。本発明の免疫検定で使用する
のに適した標識サィモポィェチンには、ラジオアイソト
ープで標識０をつけたサィモポィェチン、殊にトリチウ
ム（３Ｈ），炭素１４（１４Ｃ），沃素１２５（１あ１
），又は沃素１３１（１３１１）で標識づけたものが含
まれる。本発明による他の免疫実施態用として、例えば
発色団，蟹光団，酵素，赤血球，ラテックス粒又は電子
目転共鳴群のような他のユニークで検出可能な標識で標
識づけたサィモポイェチンを用いてもよい。最も好まし
い放射標識サィモポィェチンはめ５１サイモボイエチン
である。サイモポイヱチンへの凶５１標識の導入は、こ
の技術で既知の方法、例えばクロルアミンーＴ法を用い
たり、更に好ましくはバイオケム。ジェイ。（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍＪ．）ｉ３３９５２９，（１９７３）に述べてあ
るボルトン−ハンター（敗ｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ）試
薬（１２５１沃素化ピーハィドロキシフエニイールプロ
ピオニツク．アシツド（Ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙ
ｌｐｒｏｐｌｏｍｃａｃｉｄ）， エヌーハイドロキシ
サクシニマイド．エステル（Ｎ−ｈｙｄｒｏ奴ｓＭｃｉ
ｎｉｍｉｄｅｅｓｔｅｒ）を用いることにより行うこと
ができる。これが好ましいのはサイモポィェチンのチロ
シル成分を直接沃素化すると免疫活性がいくらか失われ
るためである。しかしながら「ボルトンＧハンター試薬
は遊離ァミノ基と縮合するので〜それは免疫決定チロシ
ル部分に影響を与えない。その他の上記標識付きサイモ
ポィヱチンはこの技術に熟練の人々に既知の手段により
作製される。

例えば、酵素標識サィモポィェチンは１９７２年４月４
日付米国特許Ｎｏ．３９ ６５４，０９０に記載のよう
にして作製される。又〜 １９７仏王１２月１０日付の
米国特許船．３，８５３，９８７は標識用の例えば蟹光
化合物とラテックス系のようなトレーサー物質を用いる
方法について述べている。従って「標識のこれら方法は
先行技術中に完全に述べられている。それ故、本発明の
標識付きサィモボィェチンは、ラジオアベソトープで標
識されたものも〜上記の他の３物質により標識付けられ
たサィモポィェチンと同機に含まれている。本発明の免
疫検定は「種々の対照ポリベプチドでテスドをし「抗体
−標識抗原複合体の移動のないことを認めることにより
、サイモポイェチンに３特異であることが示された。

特に、組織中に広く広がっている物質であるュービクィ
チン（肋ｉｑｕｉｔｊｎ）や牛の胸腺より抽出されたヒ
ストン（ｈｉｓｔｏｎｅ）類との交差反応はなかった。

サィモポィェチンの残港２９−４１に基づく合成トリデ
カベプ多チドはサィモポィェチンの生物学的活性を有す
るものであるが、これは交差反応しなかった。明らかに
「この区域には〜抗血清中の抗サィモポィェチン抗体に
より認められる抗原性部位を再構成するのに必要な残澄
及びノ又は第三構造もない。本発明を以下の例により更
に説明する。実施例 １ 抗原及び抗体の調整 ゴールドスタイン・ネイチヤ−（Ｃ℃ｌｄｓにｉｎ，Ｎ
ａｔｍｅ）２４７；１１（１９７４）が記載の如くサイ
モポィェチンを分離した。

免疫のためにそれを「 ァブラミイズ・イミユノケミス
トリイ（Ａｖｒａｍｅａｓ；ｌｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓ
ｔ沙）６，４３（１９６９）の方法によ０りカップリン
グ剤としてのグルタルアルデヒドと共に、同量の馬のガ
ンマ−‘グロブリンとカップリングさせた。結果として
得た抗原を次いでサィモポィェチン抗体の調製に用いた
。三匹の雌のサン・ジュアン（ＳａｎＪ船ｎ）ゥサタギ
の各々にｔフロィンド完全補助薬中に懸濁したサイモポ
イェチン４００ムダをいくつかの場所に注射して免疫を
作った。

免疫は２週間の間隔で４回くりかえし、これら動物を最
後の注射後１週間で出血致死させた。実施例 ２ サイモポィェチンの放射能標識付け ａ クロルアミン−Ｔ法 サィモポィェチンを更に「 ０．２の酢酸アンモニウム
中ｐＨ４．５に平衝させ「 直線勾配で０．９Ｍ，ＰＨ
４。

５にした力ルボキシメチルーセフアデツクス（ＣＭ−Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ）（０．６×３０肌カラム）で精製した
。

サィモポィヱチンはボィド量のすぐ後に現われ、これら
分画は親液性化しＬセフアデツクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ
）Ｇ−２５で脱塩した。ポリアクリルアミド。ゲルの電
気決動ｐＨ４．３とｐＨ８．９により純品とした。極〈
純度の高いサィモポィェチン０．０１の９を「バンタ−
，アンド。

グリーンウッド・ネイチヤ〜（日肌ｔｅｒａｎｄ餌ｅｅ
ｎｗｏｏｄＦ Ｎａｔｍｅ）？ １９４，４９５（１９
６２）のクｏルァミン法により狐Ｃｉ担体遊離１氏１で
放射能標議し、０．０９の燐酸塩ｐＨ７。５中のセフア
デツクスＧ一２５（０．６×３０仇カラム）上で未反応
放射ヌクラィドから脇１サィモポィェチンを分離した。

カラムは燐酸塩緩衡液中でも０。２５％ゼラチンで前洗
練した。

各分画から取ったサンプル１仏その放射能を自動ガンマ
一分光計で測定し〜ボィド量に相当する分画を０．１似
づつの段階をもつ分量に分け、一２０午０に貯蔵し、３
週間以内に使用する。ｂ ボルトンーハンター法 ベンゼン中に溶解した２ミリキュリ−の１２５１沃素化
ピーハィドロキシフェニィルプロピオニツクアシツド・
エヌーハイドロキシサクシニミド，エステル（ｐ‐ｈｙ
＆ｏ刈ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐＩｏｎにａｃｉｄＮ‐ｈｙ
ｄｒｏ刈ｓＭｃｉｎｉｍｉｄｅｅｓｔｅて）（ボルトン
ーハンタ‐試薬ご１５０にｉノｍｍｏｌｅ）を用いて、
ボルトン・アンド・ハンター，バイオケミ・ジエイ，（
ＢｏｌりｎａｎｄＨｕｎｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ．）１３３，５２９（１９７３）記述の方法により４
℃でサィモポィェチンを沃素化した。ボルトンーハンタ
ー試薬を蒸気フードの中でガラスびんの口の上を窒素流
を通して乾燥させＬサィモポィェチン１０ムク（０．１
Ｍ棚酸ナトリウム中０．５ｍ９／似；ｐ 日８．５）を
加え、４５分間４℃に保った。０．１Ｍ棚酸ナトリウム
中の０。

２Ｍグリシン半ミリリッターｐＨ８．５を更に加えて未
共役結合の試薬と反応させた。

１８分後に脇１サイモポイェチンを上記（ａ）に述べた
方法により共役の他の標識生成物より分離した。

クロールアミン−Ｔ法により放射性沃素化されたサィモ
ポィェチンのわずか５％が過剰の抗体の存在下に結合し
、この結合は１０‐３以上の希釈では少くなった。

それに反しボルトンーハンター法で放射性沃素化したサ
ィモポィェチンの４５％が過剰の抗体の存在下に結合し
た。この結合は又、１０‐３以上の抗体希釈で減少した
。実施例 ３ａ 放射性免疫検定ーポリェチレングリコ
ール分離１２×７５側のプラスチック製チューブの中で
培養を三通り行った。

０．０１Ｍ燐酸塩緩衡０．１８ＭＮａＣＩ中（Ｂは緩衝
液）５％牛のガンマーグロブリンで希釈した抗血清０．
５の‘に０．２の‘のサンプルと、０．３の【の１環１
−サイモポイエチン（ミ５０，００比ｐｍ，ＢＧＧ緩衡
液中）を加えた。

血清サンプルを検定する時には、ｐＨ８．０の０．１Ｍ
重炭酸アンモニウム中Ｇ−５０セフアデックスでの分子
節クロマトグラフィにより作製する。除外量（Ｖｏ）後
の分画と算入量（Ｖｉ）の最初のものはプールしておき
、凍結乾燥し、その粉末はサイモポィェチン用に緩衡液
中で採取する。

この調製は分子量がサィモポイヱチンよりも大きい分子
や小さい分子をこの検定から除外するのに役立つ。検定
用チューブは渦巻ミキサーで燈拝し、室温で２時間放置
した。

次いで冷たい３０％ポリエチレン・グリコール半ミリリ
ッターを渦巻ミキサーで燈拝した各チューブに加え、３
０分間冷却遠心分離機で２，００比ｐｍで途淡した。上
ずみ液を吸引し、沈澱物中の放射能を自動ガンマ‐分光
器で測定した。沈澱しだ２５１サィモポィェチン（％）
はａ−ｃ（ｂ−ｃ）×１００の式により計算する。こ）
でａ＝抗体で沈澱したｃｐｍ，ｂ；加えたｃｐｍ総量，
ｃ＝正常なウサギ血清又は抗体と過剰の非標識サィモポ
ィェチン（これらは通常全ｃｐｍの約１０％）で非特異
的に沈澱するｃｐｍ。結合阻害の標準曲線のために、結
合したサイモポイェチンは１０‐１における抗体と結合
した最大サィモポイェチンのパーセンテージとして計算
した。１三３０００の抗体希釈液を結合阻害の標準曲線
のために使用した。

ｂ 放射性免疫検定一二重抗体分離法 上記（ａ）の方法は』ＭＫＣＩＢ的機衡液を用いる時以
外はくり返した。

そして２時間の培養期間後、全体で０．１泌のャギの抗
ウサギ抗体及び０．０２の土の正常ウサギを加え、この
成分を渦巻ミキサーで混合し、得た混合物を室温で５分
間放置し「次いで遠沈した。上ずみ液を吸引し、沈澱物
はａに述べたようにして放射能を測定した。ｃ 放射性
免疫検定−デキストラン被覆チャコール分離法デキスト
ラン被覆チャコールは同量の（ｉｌか舷ＣＩと牛のガン
マーグロブリンを含む燐酸塩緩衝液１００肌‘当り５夕
のＮｏｒｉｔＡチャコール，（ｉｉ）ＩＭＫＣＩ及び牛
のガンマーグロブリンを含む燐酸塩緩衡液１００泌当り
０．５夕のデキストラン１１０を混合して作る。

全体で０．５柵【のデキストラン被覆チャコールを上記
（ｂ）のようにして２時間培養した後に検定チューブに
４℃加え、その混合物を４℃で３０分間放置する。

これらチューブを遠沈し、その上ずみ液を吸引した。べ
レットについて放射能を測定し、それはこの検定では“
非結合”サイモポイエチンを示すものである。抗原−抗
体複合体のポリエチレン・グリコ−ル分離法を採用した
検定での非標識サィモポィェチンのための結合阻害標準
曲線は、跡ｇノの‘以上のサィモポィェチン濃度に対す
る感腹を示した。

１０〜１，００仇ｇ／の【の濃度では、インシュリン，
アルフアーバンガロトキシン（ａｌｐｈａ− ｂｕｎｇ
ａｒｏｔｏｘｉｎ）， ユ ー ビ クイ チ ン（ｕ
ｂｉｑｕｉｔｉｎ），ヒストン（ｈｉｓｔｏ肥）及びサ
イモポィェチンの合成トリデカベプチド成分（残澄２９
−４１）を含む対照ポリベプチドーこより有意の移動の
起ることはなかった。

抗原−抗体複合物の二重抗体及びデキストラン被覆チャ
コール分離法を用いた検定における非標識サィモポィェ
チンについての結合阻害曲線は、いずれも０．１増サィ
モポィヱチン／似のサィモポィェチン濃度までの感度を
示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ サイモポイエチン及び免疫原担体物質と結合してい
   るサイモポイエチンより実質的になる抗原に特異性を有
   する抗体と共に試料中のサイモポイエチンの免疫検定に
   使用する標識付きサイモポイエチンであって、該サイモ
   ポイエチン特異性抗体は上記抗原を宿主動物に接種し、
   その血清を該宿主動物より回収することにより作成され
   るものでありかつ該標識付きサイモポイエチンの標識が
   トリチウム，炭素＾１＾４，沃素＾１＾３＾１，沃素＾
   １＾２＾５，発色団，螢光団，酵素，赤血球，ラテツク
   ス粒，及び電子スピン共振群よりなる群より選ばれたも
   のであることを特徴とする標識付きサイモポイエチン。 ２ 標識が＾１＾２＾５Ｉである特許請求の範囲第１項
   による標識付きサイモポイエチン。３ サンプル中のサ
   イモポイエチンの検定の方法であって、この方法は該サ
   ンプルを標識付きサイモポイエチンの既知量と該サイモ
   ポイエチンと選択的に結合する抗体とに混ぜ、生じた抗
   体−抗原複合物を上ずみ液から分離し、該複合物中の該
   標識付きサイモポイエチンの結合度を測定し、該結合度
   を、既知量のサイモポイエチンを一定量の該標識付きサ
   イモポイエチンと該抗体とを混合しサイモポイエチンの
   各既知量に対する結合度を測定して得た標準曲線と比較
   して、該サンプル中に存在するサイモポイエチンの量を
   決定する方法。 ４ 放射性免疫検定が用いられ、かつ放射性標識付きサ
   イモポイエチンが用いられる特許請求の範囲第３項の方
   法。 ５ 抗体−抗原複合物を３０％ポリエチレン・グリコー
   ルの助けにより溶液より分離する特許請求の範囲第４項
   の方法。 ６ 抗体−抗原複合物を、サイモポイエチン抗体がそこ
   から引出されてきた宿主動物の血清に対する抗体を用い
   る二重抗体方の助けにより溶液より分離する特許請求の
   範囲第４項の方法。 ７ 抗体−抗原複合物を溶液よりデキストラン被覆チヤ
   コール法により分離し、この場合沈澱物の放射能は非結
   合サイモポイエチンを表わすものである特許請求の範囲
   第４項の方法。 ８ 該放射性標識付きサイモポイエチンが＾１＾２＾５
   Ｉサイモポイエチンである特許請求の範囲第４項の方法
   。 ９ 検定するサンプルが血漿又は血清サンプルである特
   許請求の範囲第４項の方法。