JPS6012999A - ス−パ−オキサイド基ならびにス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ活性の測定法 - Google Patents
ス−パ−オキサイド基ならびにス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ活性の測定法Info
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- JPS6012999A JPS6012999A JP12285483A JP12285483A JPS6012999A JP S6012999 A JPS6012999 A JP S6012999A JP 12285483 A JP12285483 A JP 12285483A JP 12285483 A JP12285483 A JP 12285483A JP S6012999 A JPS6012999 A JP S6012999A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は合成化合物、細菌類、血清、血球、動植物の
組織及びそれ等よりの抽出物中のスーパーオキサイド基
（０’ｉ）ならびにスーパーオキサイドジスムクーゼ（
ＳＯＤ）活性を測定する方法およびその測定剤に関する
ものである。
組織及びそれ等よりの抽出物中のスーパーオキサイド基
（０’ｉ）ならびにスーパーオキサイドジスムクーゼ（
ＳＯＤ）活性を測定する方法およびその測定剤に関する
ものである。
生体は自衛の一手段として、まだ生理的機能を行うため
、活性酸素と総称されるスーパーオキサイド基（０丁）
とそれから派生して産生されろ過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）
、ヒドロキシラジカル（拳ＯＨ）、−重項酸素（１０□
）、ハイポクロライド（ＯＣｆ）等を用いている。これ
等は白血球表面等で産生されたり、キサンチンオキシダ
ーゼ（ＸＯＤ ）等の酵素反応により供給され殺菌作用
等を示す。しかし活性酸素は同時に炎症、自己免疫疾患
、白内障、糖尿症、動脈硬化症、発癌、制癌作用にも関
係するとされている。
、活性酸素と総称されるスーパーオキサイド基（０丁）
とそれから派生して産生されろ過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）
、ヒドロキシラジカル（拳ＯＨ）、−重項酸素（１０□
）、ハイポクロライド（ＯＣｆ）等を用いている。これ
等は白血球表面等で産生されたり、キサンチンオキシダ
ーゼ（ＸＯＤ ）等の酵素反応により供給され殺菌作用
等を示す。しかし活性酸素は同時に炎症、自己免疫疾患
、白内障、糖尿症、動脈硬化症、発癌、制癌作用にも関
係するとされている。
活性酸素中でもＯｌは特に重要で、その局所での産生用
は次式の反応を行なう酵素スーパーオキサイドジスムタ
ーゼ（ＳＯＤ）により調節されている。
は次式の反応を行なう酵素スーパーオキサイドジスムタ
ーゼ（ＳＯＤ）により調節されている。
２０ ＋ ２Ｈ＋−０２十Ｈ２０□（不均化反応）牛の
赤血球から抽出精製しだＳＯＤを動物まだは人に注射す
ると炎症を抑えるとか、まだベーヂエット病患者の末梢
血中の白血球のＯン産生能は上昇していると言われてお
り、ダウン氏病患者の赤血球中のＳＯＤ活性は約５０％
上昇しているとも言われている。
赤血球から抽出精製しだＳＯＤを動物まだは人に注射す
ると炎症を抑えるとか、まだベーヂエット病患者の末梢
血中の白血球のＯン産生能は上昇していると言われてお
り、ダウン氏病患者の赤血球中のＳＯＤ活性は約５０％
上昇しているとも言われている。
この様な背景より今日種々の疾病の診断、治療指針を得
るため０１産生能やＳＯＤ活性の簡便な測定法および測
定剤の出現が要望されている。このうち測定剤について
は、キット化されたものが存在しないため、測定が非常
に煩雑なものとなっているので、キット化されたものが
強く要望されている。
るため０１産生能やＳＯＤ活性の簡便な測定法および測
定剤の出現が要望されている。このうち測定剤について
は、キット化されたものが存在しないため、測定が非常
に煩雑なものとなっているので、キット化されたものが
強く要望されている。
本願発明者等は、この要望に答えるべくｏＨ及びＳＯＤ
活性測定の簡便役方法および測定剤の開発を目的とし鋭
意研究の結果、多数試料を簡便な操作で、しかも安価に
特異性高く測定する、改良亜硝酸生成法を確立し、本願
発明を完成した。
活性測定の簡便役方法および測定剤の開発を目的とし鋭
意研究の結果、多数試料を簡便な操作で、しかも安価に
特異性高く測定する、改良亜硝酸生成法を確立し、本願
発明を完成した。
従来の抗体を用いる免疫的ＳＯＤ測定法は感度が高く、
混雑物があっても測定できる利点があるか、ＳＯＤ活性
を持たないＳＯＤの前駆体やＳＯＤの分解物をも測定に
かけてしまうという欠点があった。生体でのＳＯＤの役
目はまさにその酵素としての活性に意味がある事を考え
ると、この抗体との反応による方法には明らかに問題が
ある。捷だ代表的なＳＯＤ活性測定法であるチトクロー
ムＣ法では混雑タンパクによる測定障害がみとめられる
という欠点がある。
混雑物があっても測定できる利点があるか、ＳＯＤ活性
を持たないＳＯＤの前駆体やＳＯＤの分解物をも測定に
かけてしまうという欠点があった。生体でのＳＯＤの役
目はまさにその酵素としての活性に意味がある事を考え
ると、この抗体との反応による方法には明らかに問題が
ある。捷だ代表的なＳＯＤ活性測定法であるチトクロー
ムＣ法では混雑タンパクによる測定障害がみとめられる
という欠点がある。
本願発り」は、従来法のこのような欠点を解消すべくな
されたものであり、この０１及びＳＯＤ活性の簡便な測
定法の基本となった亜硝酸生成法の原理［（アーカイプ
ス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィズ
イクス； Ｙ、 Ｋｏｎａ、 Ａｒｃｈ。
されたものであり、この０１及びＳＯＤ活性の簡便な測
定法の基本となった亜硝酸生成法の原理［（アーカイプ
ス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィズ
イクス； Ｙ、 Ｋｏｎａ、 Ａｒｃｈ。
Ｂｉｏｃｂｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、、 １８６ （１
）、 １８９−１９５（１９７８）） および（アナリ
ティカル・バイオケミストリー； Ｅｌｓｔｎｅｒ ｅ
ｔ ａｌ、 Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。
）、 １８９−１９５（１９７８）） および（アナリ
ティカル・バイオケミストリー； Ｅｌｓｔｎｅｒ ｅ
ｔ ａｌ、 Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。
７０、６１６−６２０ （１９７６））］ はヒポキサ
ンチン（ＨＸ）とキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）で
酵素的ＫＯ２を産生させ、この０１がヒドロキシルアミ
ンを酸化して生じるＮＯｌを足囲する方法である。
ンチン（ＨＸ）とキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）で
酵素的ＫＯ２を産生させ、この０１がヒドロキシルアミ
ンを酸化して生じるＮＯｌを足囲する方法である。
ＮＯｄの定計法としては、ＮＯｌと発色剤（スルファニ
ル酸及びα−ナフチルアミン）を酢酸またはリン酸中で
反応させ生じたアゾ化合物の吸光度を測定するものであ
る。
ル酸及びα−ナフチルアミン）を酢酸またはリン酸中で
反応させ生じたアゾ化合物の吸光度を測定するものであ
る。
本願発明者等は、この上記の２つの方法を組み合せた次
の様な方法を基本方法とＬ２て設定した。
の様な方法を基本方法とＬ２て設定した。
図１
この方法は、最終物であるアゾ化合物の吸光度を測定す
るこ吉によって０１及びＳＯＤ活性を測定するものであ
る。
るこ吉によって０１及びＳＯＤ活性を測定するものであ
る。
本願発明者等は、この上記図１の方法を基本としてさら
に次の様な改良を加えて本願発明を完成した。
に次の様な改良を加えて本願発明を完成した。
発色剤として使用されているα−ナフチルアミンは発癌
性が疑われ、測定に使用することは好ましくないため、
種々の検討を加えた。
性が疑われ、測定に使用することは好ましくないため、
種々の検討を加えた。
その結果、安全なＮ−１−ナフチルエチレンジアミン捷
たはその塩類およびＮ、Ｎ−ジメチル−α−ナフチルア
ミンに代え得る事が解った。
たはその塩類およびＮ、Ｎ−ジメチル−α−ナフチルア
ミンに代え得る事が解った。
Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミンの塩類としては例え
ば塩酸塩、臭化水素酸塩等の酸付加塩が挙げられる。
ば塩酸塩、臭化水素酸塩等の酸付加塩が挙げられる。
さらに基質として使用されているヒドロキシルアミンは
突然変異性を有するので、これに変わるものを検討した
結果ヒドロキシルアミン−〇−スルフォン酸捷たはその
塩類が代替化合物となることがわかった。この化合物は
、価格の点から見てもヒドロキシルアミンよりもすぐれ
ているものである。
突然変異性を有するので、これに変わるものを検討した
結果ヒドロキシルアミン−〇−スルフォン酸捷たはその
塩類が代替化合物となることがわかった。この化合物は
、価格の点から見てもヒドロキシルアミンよりもすぐれ
ているものである。
最後に、キット化された測定剤としては、液体の運搬を
さけ、全て凍結乾燥できるように、発色剤に加える酢酸
の代替物を検問した結果、固型酸を使用できることがわ
かった。
さけ、全て凍結乾燥できるように、発色剤に加える酢酸
の代替物を検問した結果、固型酸を使用できることがわ
かった。
適当な固型酸としては、クエン酸、ジグリコール酸、蓚
酸、ＤＨ酒石酸が挙げられる。最も好捷しい固型酸はク
エン酸である。
酸、ＤＨ酒石酸が挙げられる。最も好捷しい固型酸はク
エン酸である。
以上の種々の検討により確立された本願発明の改良亜硝
酸生成法による測定法の概略は次の通りである。
酸生成法による測定法の概略は次の通りである。
Ｏ１
図２
×基質：ヒドロキシルアミンー〇−スルフォン酸Ａ ：
Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン又はＮ、Ｎ−ジメチ
ル−α−ナフチルアミンこの方法は、アゾ化合物の吸光
度より、０す及びＳＯＤ活性を測定するものである。
Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン又はＮ、Ｎ−ジメチ
ル−α−ナフチルアミンこの方法は、アゾ化合物の吸光
度より、０す及びＳＯＤ活性を測定するものである。
高等動物には２種類のＳＯＤ、すなわち主として細胞質
に存在するＣｕ 、 Ｚｎ −ＳＯＤと、主としてミト
コンドリアに存在するＭｎ −８ＯＤ があるが、たと
えば癌組織で低下するのはＭｎ −ＳＯＤ のみである
という報告がある。この様な点を考えると両ＳＯＤ活性
を分別測定する事も診断上重要である。実験室レベルで
は１ｍＭのＫＣＮでＣｕ 、 Ｚｎ −５ＯＤのみが活
性を消失するので、これを測定時に添加して区別してい
るが、キット化測定剤の中にこの様な毒物を加えるのに
一好寸しくないので次の様な検討を加えた。
に存在するＣｕ 、 Ｚｎ −ＳＯＤと、主としてミト
コンドリアに存在するＭｎ −８ＯＤ があるが、たと
えば癌組織で低下するのはＭｎ −ＳＯＤ のみである
という報告がある。この様な点を考えると両ＳＯＤ活性
を分別測定する事も診断上重要である。実験室レベルで
は１ｍＭのＫＣＮでＣｕ 、 Ｚｎ −５ＯＤのみが活
性を消失するので、これを測定時に添加して区別してい
るが、キット化測定剤の中にこの様な毒物を加えるのに
一好寸しくないので次の様な検討を加えた。
Ｃｕ 、 Ｚｎ −−ＳＯＤとＭｎ −ＳＯＤを区別す
る方法として、ＫＣＮに代るものとして硫酸ドテシルナ
トリウム（ＳＤＳ）を用いるものが報告されている（ア
ナリティカル・バイオケミストリー； Ｂ 、 Ｌ 、
Ｇｅ１ｌｅｒｅｔ ａｌ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、、１２８．８６−９２（１９８３））。
る方法として、ＫＣＮに代るものとして硫酸ドテシルナ
トリウム（ＳＤＳ）を用いるものが報告されている（ア
ナリティカル・バイオケミストリー； Ｂ 、 Ｌ 、
Ｇｅ１ｌｅｒｅｔ ａｌ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、、１２８．８６−９２（１９８３））。
すなわち２％ＳＤＳと３７℃ ３０分間保温すると、Ｍ
ｎ−５ＯＤ活性は完全に消失するがＣｕ、Ｚｎ−５ＯＤ
活性は変化しないと報告されている。しかしながらこの
様な高濃度のＳＤＳはＳＯＤ活性測定に障害をもたらす
ので３ＭＫＣｌで沈澱させ遠心除去して置く必要がある
。この沈澱の分離がよくない事および遠心操作等の手間
をさけるため種々の条件の検剖の結果、ＳＤＳ濃度０．
００１−０．０１チで１２時間以上３７℃で保温した結
果Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ菌よりのＭｎ
−５ＯＤ（和光紬薬社製）シ は完全失活したが、人赤血３＄ｃｕ、Ｚｎ−５ＯＤ （
※グマ社製）は７０時間保温しても活性を保っていた。
ｎ−５ＯＤ活性は完全に消失するがＣｕ、Ｚｎ−５ＯＤ
活性は変化しないと報告されている。しかしながらこの
様な高濃度のＳＤＳはＳＯＤ活性測定に障害をもたらす
ので３ＭＫＣｌで沈澱させ遠心除去して置く必要がある
。この沈澱の分離がよくない事および遠心操作等の手間
をさけるため種々の条件の検剖の結果、ＳＤＳ濃度０．
００１−０．０１チで１２時間以上３７℃で保温した結
果Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ菌よりのＭｎ
−５ＯＤ（和光紬薬社製）シ は完全失活したが、人赤血３＄ｃｕ、Ｚｎ−５ＯＤ （
※グマ社製）は７０時間保温しても活性を保っていた。
上記条件の適用により、本願発明の方法において測定障
害なくＭｎ−５ＯＤのみを選択的に消失させＣｕ、Ｚｎ
−８ＯＤ活性のみを測定できる事も判明した。
害なくＭｎ−５ＯＤのみを選択的に消失させＣｕ、Ｚｎ
−８ＯＤ活性のみを測定できる事も判明した。
過酸化水素を分解するカフラーゼ、血清中にあすＳＯＤ
様作用を示すとされるセルロプラスミン、ヒドロキシ基
除去剤のＤ−マニトール、尿酸、抗酸化剤のアスコルビ
ン酸等は生体試料中に含まれているｍけ少なく、本願の
確立された改良亜硝酸生成法によるＳＯＤ活性、ｏｉの
測定に障害を与えない。
様作用を示すとされるセルロプラスミン、ヒドロキシ基
除去剤のＤ−マニトール、尿酸、抗酸化剤のアスコルビ
ン酸等は生体試料中に含まれているｍけ少なく、本願の
確立された改良亜硝酸生成法によるＳＯＤ活性、ｏｉの
測定に障害を与えない。
上記の本願発明の方法を基本として、測定剤の作成方法
の１例を以下の通り説明する。
の１例を以下の通り説明する。
［ＮＯ，−発生剤管（Ａ）］：
ヒドロキジルアミンー〇−スルフォン酸またはその塩類
、ヒボキサンチン、キサンチンオキシダーゼの３種の試
薬をＮｏ１発生源とし、さらに好ましくけエチレンジア
ミン四酢酸壷二ナトｖ’：ｙム塩を試料中の夕刊の重金
属をとりのぞくために加えた方が好捷しい。
、ヒボキサンチン、キサンチンオキシダーゼの３種の試
薬をＮｏ１発生源とし、さらに好ましくけエチレンジア
ミン四酢酸壷二ナトｖ’：ｙム塩を試料中の夕刊の重金
属をとりのぞくために加えた方が好捷しい。
以」二の４種の試薬をそれぞれＭ、衝液に溶解し、容器
に４種のうちいずれかの１種の試薬を加え、凍結させる
。十分凍結した事を確かめてから、次の試薬を同様にし
て加え、こうして４種の試薬が互いに液体として接触し
ない様にして凍結させてから凍結乾燥にかけて栓とシー
ルをする。各試薬を別々に容器に分注する代シにヒドロ
キシルアミン−〇−スルフォン酸またはその塩類を含む
緩衝液のみ、ま／＋：はキサンチンオキシダーゼを含む
緩衝液のみを加え凍結させ、他の３つの試薬を混合した
ものを加えて凍結する、あるいはヒドロキシルアミン−
Ｏ−スルフォン酸またはその塩類とキサンチンオキシダ
ーゼを混合した緩衝液を加え凍結して、他の２つの試薬
を混合したものを加えて凍結させてから最後に凍結乾燥
することも可能である。この場合両者の中ｒＩＩＪＫ水
、生理食塩水等で隔ｒｌｉｆ用凍結層を設けるのが好ま
し８０以上の他にもＮ丙の産生が生じないように工夫し
て加え、凍結乾燥して作成すればよい。
に４種のうちいずれかの１種の試薬を加え、凍結させる
。十分凍結した事を確かめてから、次の試薬を同様にし
て加え、こうして４種の試薬が互いに液体として接触し
ない様にして凍結させてから凍結乾燥にかけて栓とシー
ルをする。各試薬を別々に容器に分注する代シにヒドロ
キシルアミン−〇−スルフォン酸またはその塩類を含む
緩衝液のみ、ま／＋：はキサンチンオキシダーゼを含む
緩衝液のみを加え凍結させ、他の３つの試薬を混合した
ものを加えて凍結する、あるいはヒドロキシルアミン−
Ｏ−スルフォン酸またはその塩類とキサンチンオキシダ
ーゼを混合した緩衝液を加え凍結して、他の２つの試薬
を混合したものを加えて凍結させてから最後に凍結乾燥
することも可能である。この場合両者の中ｒＩＩＪＫ水
、生理食塩水等で隔ｒｌｉｆ用凍結層を設けるのが好ま
し８０以上の他にもＮ丙の産生が生じないように工夫し
て加え、凍結乾燥して作成すればよい。
緩衝液のｐＨは８．２付近が最適である。
「アゾ化合物産生網管」：
スルファニル酸またはその塩類、Ｎ−ＩＬナフチルエチ
レンジアミンまたはその塩類（捷だはＮ。
レンジアミンまたはその塩類（捷だはＮ。
Ｎ−ジメチル−α−ナフチルアミン）及び固型酸の水溶
液を容器に加えその１Ｌ丑たは凍結乾燥する。
液を容器に加えその１Ｌ丑たは凍結乾燥する。
ｒＳＤＳ管」・
緩衝液又は水に溶解した０、 ００１〜０．０１％硫酸
ドテシルナトリウム（ＳＤＳ）をその捷ま、または凍結
乾燥する。
ドテシルナトリウム（ＳＤＳ）をその捷ま、または凍結
乾燥する。
ｒ ＮＯ：ｉ発生剤管（Ｂ）Ｊ：
ヒドロキシルアミンー〇−スルフォン酸ｔＪｖはその塩
類の水溶液、さらに好ましくは試料中の夕方ｊの重金属
をとりのぞくだめにエチレンジアミン四酢酸・二ナトリ
ウム塩の水溶液及びｐＨ調節のため緩衝液を別々又はあ
らかじめ混合して加えてそのまま、また／′ｉ凍結乾燥
する。
類の水溶液、さらに好ましくは試料中の夕方ｊの重金属
をとりのぞくだめにエチレンジアミン四酢酸・二ナトリ
ウム塩の水溶液及びｐＨ調節のため緩衝液を別々又はあ
らかじめ混合して加えてそのまま、また／′ｉ凍結乾燥
する。
緩衝液のｐＨは７．４伺近が最適である。
以上の測定剤の作成方法はこれらに限定されることなく
、本願発明によって確立された測定方法の原理に応じて
どのようにでも作成できる。
、本願発明によって確立された測定方法の原理に応じて
どのようにでも作成できる。
例えば「アゾ化合物産生網管」の作成に関して、発色剤
に加える酸として酢酸やリン酸を使用して作成する１１
もできるし、ｒ ＮＯ：；発生剤管（５）」に関して、
４種の試薬を１本の管に加えて作成するがわりに２木の
管に分注して作成することもできる（例えば、１つの管
にはヒドロキシルアミン−〇−スルフォン酸捷たはその
塩類を含む緩衝液およびヒポキサンチンを含む緩衝液を
加え、別の管にはキサンチンオキシダーゼを含む緩衝液
およびエチレンジアミン四酢酸・二ナトリウム塩を含む
緩衝液を加えて、それぞれ液体の４４．ｔたは凍結乾燥
する）。
に加える酸として酢酸やリン酸を使用して作成する１１
もできるし、ｒ ＮＯ：；発生剤管（５）」に関して、
４種の試薬を１本の管に加えて作成するがわりに２木の
管に分注して作成することもできる（例えば、１つの管
にはヒドロキシルアミン−〇−スルフォン酸捷たはその
塩類を含む緩衝液およびヒポキサンチンを含む緩衝液を
加え、別の管にはキサンチンオキシダーゼを含む緩衝液
およびエチレンジアミン四酢酸・二ナトリウム塩を含む
緩衝液を加えて、それぞれ液体の４４．ｔたは凍結乾燥
する）。
以下に測定法の１例を示す。
０８ＯＤ活性の測定：
ＳＯＤ活性測定用試料（例えば、血清等の希薄水溶液）
をｒ ＮＯｉ発生剤管（５）」に注入し反応させ（反応
は３７°Ｃで約３０分程度）、これに「アゾ化合物産生
網管」に水を加えて溶解させたものを加え約２０分〜６
時間後に吸光度を測定する。
をｒ ＮＯｉ発生剤管（５）」に注入し反応させ（反応
は３７°Ｃで約３０分程度）、これに「アゾ化合物産生
網管」に水を加えて溶解させたものを加え約２０分〜６
時間後に吸光度を測定する。
Ｃｕ、Ｚｎ−５ＯＤ活性とＭｎ−５ＯＤ活性を区別しだ
い時は、前もってＳＯＤ活性測定用試料を「ＳＤＳ管」
に加えて処理（３７°Ｃで約２０時間）し、Ｍｎ−３Ｏ
Ｄ活性を失活させた後測定する。
い時は、前もってＳＯＤ活性測定用試料を「ＳＤＳ管」
に加えて処理（３７°Ｃで約２０時間）し、Ｍｎ−３Ｏ
Ｄ活性を失活させた後測定する。
００ゴの測定
０フ測定用試料をｒＮｏフ発生剤管（Ｂ）」に加え、反
応させ（３７°Ｃで約１０分間）、以下ＳＯＤ活性の測
定と同様に行なう。
応させ（３７°Ｃで約１０分間）、以下ＳＯＤ活性の測
定と同様に行なう。
以下実施例に基つきこの発明を説明する。
実施例１
＋１） Ｎ四発生剤管（Ａ）（１検体分用ＳＯＤ活性測
定用反応試薬凍結乾燥品入り試験管）の作製：８０ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４及び６０ｍＭはう砂で作成したｐＨ８，２
の緩衝液に溶解して以下４種の溶液を作る。すなわちヒ
ドロキシルアミン−〇−スルフォン酸溶液（２ｍｆｌ／
ｍｅ ） （Ｎｏ、 １ ）、ヒポキサンチンＩｃｅ
（２ｍＭ ） （Ｎｏ、 ２ ）、エチレンジアミン四
酢酸・二ナトリウム塩溶液（１０”Ｍ ）＋３）および
キサンチンオキシダーゼ溶液（２，５ｘ１ｏ”単位／＋
＋＋ｆ’）（陽４）を用意する。
定用反応試薬凍結乾燥品入り試験管）の作製：８０ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４及び６０ｍＭはう砂で作成したｐＨ８，２
の緩衝液に溶解して以下４種の溶液を作る。すなわちヒ
ドロキシルアミン−〇−スルフォン酸溶液（２ｍｆｌ／
ｍｅ ） （Ｎｏ、 １ ）、ヒポキサンチンＩｃｅ
（２ｍＭ ） （Ｎｏ、 ２ ）、エチレンジアミン四
酢酸・二ナトリウム塩溶液（１０”Ｍ ）＋３）および
キサンチンオキシダーゼ溶液（２，５ｘ１ｏ”単位／＋
＋＋ｆ’）（陽４）を用意する。
粉砕ドライアイスを用いて５ ｍｅ褐色ガラス製試験管
を十分冷却しておき、捷ず陽１の溶液（０，１ｍｅ ）
を試験管の底に入れ、十分凍結した事を確かめてから、
Ｎｏ、 ２の溶液（０，１ｍｅ ）を加える。以下同様
にｌ！１１．３の溶液（０，１ｍｅ ）、最後に階４の
溶液（０，１ｍｅ）を加える。こうして４種の試薬は全
て０、１ ｍｅずつ互いに液体として接触しない様に凍
結させてから約１５時間凍結乾燥にかけて粉末状となっ
た所で栓とシールをする。
を十分冷却しておき、捷ず陽１の溶液（０，１ｍｅ ）
を試験管の底に入れ、十分凍結した事を確かめてから、
Ｎｏ、 ２の溶液（０，１ｍｅ ）を加える。以下同様
にｌ！１１．３の溶液（０，１ｍｅ ）、最後に階４の
溶液（０，１ｍｅ）を加える。こうして４種の試薬は全
て０、１ ｍｅずつ互いに液体として接触しない様に凍
結させてから約１５時間凍結乾燥にかけて粉末状となっ
た所で栓とシールをする。
（２） アゾ化合物産生網管（１０検休分用発色試薬凍
結乾燥品入り管）の作製： ３０ ｍｅ褐色ガラス製試験管に９ｍｇ／ｍｅスルファ
ニル酸水溶液（１ｍｅ）、１００ ｐＹ／ｍｅ Ｎ −
１−ナフチルエチレンジアミン・２塩酸塩水Ｓ液（１，
５ｍｅ ）、４００ ｍｇ／ｍｅクエン酸水溶・液（１
ｍｆりを混合後加え、実施例１−（１）と同様に凍結乾
燥して密栓シールする。
結乾燥品入り管）の作製： ３０ ｍｅ褐色ガラス製試験管に９ｍｇ／ｍｅスルファ
ニル酸水溶液（１ｍｅ）、１００ ｐＹ／ｍｅ Ｎ −
１−ナフチルエチレンジアミン・２塩酸塩水Ｓ液（１，
５ｍｅ ）、４００ ｍｇ／ｍｅクエン酸水溶・液（１
ｍｆりを混合後加え、実施例１−（１）と同様に凍結乾
燥して密栓シールする。
＋３ｊ ＳＤＳ管（１検体分Ｍｎ−５ＯＤ失活用ＳＤＳ
凍結乾燥品入り試験管）の作製： ６ｍｅ試験管に水に溶解した０、Ｏ１％硫酸ドデシルナ
トリクム（４ｄ）を加え、実施例１−（１１と同様に凍
結乾燥し密栓シールする。
凍結乾燥品入り試験管）の作製： ６ｍｅ試験管に水に溶解した０、Ｏ１％硫酸ドデシルナ
トリクム（４ｄ）を加え、実施例１−（１１と同様に凍
結乾燥し密栓シールする。
＋４） ＮＯｉ発生剤管（Ｂ）（１検休分スーパーオキ
サイド測定用反応試薬凍結乾燥品入り試験管）の作製： ２■／ｍｅヒドロキシルアミンー〇−スルフォン酸水溶
液（０，１ｍｌり、１０ Ｍエチレンジアミン四酢酸・
ニナ斗すウム塩水溶液（０，１ｍｌ？）及び２５０ ｍ
Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，４（０，５ｍｅ
）の混合液を５ｍｅ褐色ガラス製試験管に加えて、実施
例１−（１）と同様に凍結乾燥し密栓シールする。
サイド測定用反応試薬凍結乾燥品入り試験管）の作製： ２■／ｍｅヒドロキシルアミンー〇−スルフォン酸水溶
液（０，１ｍｌり、１０ Ｍエチレンジアミン四酢酸・
ニナ斗すウム塩水溶液（０，１ｍｌ？）及び２５０ ｍ
Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，４（０，５ｍｅ
）の混合液を５ｍｅ褐色ガラス製試験管に加えて、実施
例１−（１）と同様に凍結乾燥し密栓シールする。
以上の＋１ｊ〜（４）の４種の管を以下の実施例に使用
する。
する。
実施例２
人血清中の総ＳＯＤ活性の測定：
人末梢血をヘパリンを用いて採取し、直ちに遠心により
赤血球を除去する。上清の血清を水で色種に希薄して各
々１ ｍｅをＮＯ１発生剤管囚に加え、３７°Ｃで３０
分間保温して室温で収り出す。アゾ化合物産生網管に水
２０ｍｅを加えて溶解し、Ｚｍｅずつ反応後のＮＯ１発
生剤管（５）に加える。室温で２０分間放置してから５
４０ｎｍ での吸光度を見て表１の結果を得た。
赤血球を除去する。上清の血清を水で色種に希薄して各
々１ ｍｅをＮＯ１発生剤管囚に加え、３７°Ｃで３０
分間保温して室温で収り出す。アゾ化合物産生網管に水
２０ｍｅを加えて溶解し、Ｚｍｅずつ反応後のＮＯ１発
生剤管（５）に加える。室温で２０分間放置してから５
４０ｎｍ での吸光度を見て表１の結果を得た。
一嚢」工
人血清中の総ＳＯＤ活性（各２０例）
実施例３
人血清中のＣｕ、Ｚｎ−５ＯＤの測定：実施例２の正常
人血清のうち５検休についてそれぞれ２つの希薄液を用
意し、ＳＤＳ管に１ ｍｅを加え、３７°Ｃ２０時間静
置したものをＮｏフ発生剤管（５）に加え実施例２０時
と同様の操作でＳＯＤによる阻害率を児たのが表２であ
る。これはＣｕ、Ｚｎ−５ＯＤ活性である。
人血清のうち５検休についてそれぞれ２つの希薄液を用
意し、ＳＤＳ管に１ ｍｅを加え、３７°Ｃ２０時間静
置したものをＮｏフ発生剤管（５）に加え実施例２０時
と同様の操作でＳＯＤによる阻害率を児たのが表２であ
る。これはＣｕ、Ｚｎ−５ＯＤ活性である。
表２
人血清中のＣｕ、Ｚｎ−５ＯＤ活性（各５例）実施例４
正常ラット肝臓の総ＳＯＤ活性測定ニ
スプラーグ・ダクレー系うット雄、体重１８０〜２００
ｙのもの５匹を断頭層殺後、生理食塩水を門脈より注入
して肝臓内残留血液を流し出す。
ｙのもの５匹を断頭層殺後、生理食塩水を門脈より注入
して肝臓内残留血液を流し出す。
この肝臓の一定量を秤爾して取り、ハサミできざみ、１
０倍量の生理食塩水を加えて、ガラス及びテフロンホモ
ジナイザーでホモジネートをつくる。
０倍量の生理食塩水を加えて、ガラス及びテフロンホモ
ジナイザーでホモジネートをつくる。
低温、２５００回転１０分間で得られる上澄液を３０分
超遠心（１４８，０００ｙ）Ｋかけて得られた上澄を種
々に希薄して１ｍｅをＮＯ７発生剤管（３）に加え、実
施例２に従いＳＯＤ活性をめたのが表３である。
超遠心（１４８，０００ｙ）Ｋかけて得られた上澄を種
々に希薄して１ｍｅをＮＯ７発生剤管（３）に加え、実
施例２に従いＳＯＤ活性をめたのが表３である。
表３
ラット肝臓の総ＳＯＤ活性（各５例）
実施例５
モルモット腹腔溶出液細胞のスーパーオキサイド産生の
測定： ハートレー系モルモットＬ （１４２５０−３００２に
２５ ｒｎｅのパラフィン油を腹腔内に注射し、４白目
に生理食塩水を腹腔内に注入して流し出す。
測定： ハートレー系モルモットＬ （１４２５０−３００２に
２５ ｒｎｅのパラフィン油を腹腔内に注射し、４白目
に生理食塩水を腹腔内に注入して流し出す。
油を分離後、低温で２，５００回転、２０分遠心して沈
澱した細胞は約９０％マクロファージてあった。これを
培養用ハンクス液で希薄して検体とＬだ。腹腔液中に赤
血球混入の多いものは除外して５匹分についてスーパー
オキサイド産生能を測定した。
澱した細胞は約９０％マクロファージてあった。これを
培養用ハンクス液で希薄して検体とＬだ。腹腔液中に赤
血球混入の多いものは除外して５匹分についてスーパー
オキサイド産生能を測定した。
１ ｍｅの細胞液をＮＯ１発生剤管（Ｂ）に加え、反応
を開始し３７°Ｃで１０分間保温後、実施例２と同様に
発色させ、５４０ｎｍ の吸光度を見たのが表５である
。
を開始し３７°Ｃで１０分間保温後、実施例２と同様に
発色させ、５４０ｎｍ の吸光度を見たのが表５である
。
表５
手続補正書（方式）
１、事件の表示
昭和５８年特許願第１２２８５４号
２、発明の名称
スーパーオキサイド基ならひにスーパーオキサイドジヌ
ムターゼ活性の測定＝ ６、補正音する者 特許出願人 大阪市東区道修町４丁目６番地 （５２４）藤沢薬品工業株式会社 ヘ ツ ５、補正命令の日付 昭和５８年１０月６日 （発送日 昭和５８年１０月２５日） ６、補正の対象 明細書の「発明の詳＋Ｉ’ｌＩＩな説明」の植入 補正
の内容 （１）明細書第６頁下から第４行および同第７頁第１行
の「図１」を「工程１」に訂正し１す。
ムターゼ活性の測定＝ ６、補正音する者 特許出願人 大阪市東区道修町４丁目６番地 （５２４）藤沢薬品工業株式会社 ヘ ツ ５、補正命令の日付 昭和５８年１０月６日 （発送日 昭和５８年１０月２５日） ６、補正の対象 明細書の「発明の詳＋Ｉ’ｌＩＩな説明」の植入 補正
の内容 （１）明細書第６頁下から第４行および同第７頁第１行
の「図１」を「工程１」に訂正し１す。
（２）同第８頁最下行の「図２」を「工程２」に訂正し
了す。
了す。
以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 スーパーオキサイドジスムターゼによるスーパー
オキサイド基の変化を、スーパーオキサイド基とヒドロ
キシルアミン−〇−スルフォン酸またはその塩類とを反
応させて得られるＮＯｌを定量することにより測定する
ことを特徴とするスーパーオキサイドジスムターゼ活性
の測定法。 ２、Ｎｏ；の定量において、固型酸の存在下にＮ−１−
ナフチルエチレンジアミンまたはその塩類捷たはＮ、Ｎ
−ジメチル−α−ナフチルアミン、およびスルファニル
酸またはその塩類とＮＯｌとを反応させて生じるアゾ化
合物の吸光度を測定することを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載のスーパーオキサイドジスムターゼ活性の
測定法。 ３、 ヒドロキシルアミン−〇−スルフォン酸マたはそ
の塩類よりなるＮＯ７発生剤。 ４、 ヒポキサンチン、キサンチンオキシダーゼおよび
ヒドロキシルアミン−〇−スルフォン酸またはその塩類
よりなる特許請求の範囲第３項記載のＮＯ１発生剤。 ５、固型酸よりなるアゾ化合物産生剤。 ６、固型酸、スルファニル酸捷たはその塩類およびＮ−
１−ナフチルエチレンジアミンまたはその塩類またはＮ
、Ｎ−ジメチル−α−ナフチルアミンよりなる特許請求
の範囲第５項記載のアゾ化合物産生剤。 ７、 ヒポキサンチン、キサンチンオキシダーゼ、およ
びヒドロキシルアミン−〇−スルフォン酸捷たはその塩
類よりなるＮＯ１発生剤と固型酸、スルファニル酸また
はその塩類、およびＮ−１−ナフチルエチレンジアミン
またはその塩類またはＮ、Ｎ−ジメチル−α−ナフチル
アミンよりなるアゾ化合物産生剤との組合せよりなるス
ーパーオキサイドジスムターゼ活性測定剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12285483A JPS6012999A (ja) | 1983-07-05 | 1983-07-05 | ス−パ−オキサイド基ならびにス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ活性の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12285483A JPS6012999A (ja) | 1983-07-05 | 1983-07-05 | ス−パ−オキサイド基ならびにス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ活性の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6012999A true JPS6012999A (ja) | 1985-01-23 |
Family
ID=14846283
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12285483A Pending JPS6012999A (ja) | 1983-07-05 | 1983-07-05 | ス−パ−オキサイド基ならびにス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ活性の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6012999A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0901009A3 (en) * | 1997-08-29 | 1999-04-14 | Nippon Telegraph and Telephone Corporation | Nitrogen dioxide gas sensing method, nitrogen dioxide gas sensing element, and nitrogen dioxide gas sensor using the same |
-
1983
- 1983-07-05 JP JP12285483A patent/JPS6012999A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0901009A3 (en) * | 1997-08-29 | 1999-04-14 | Nippon Telegraph and Telephone Corporation | Nitrogen dioxide gas sensing method, nitrogen dioxide gas sensing element, and nitrogen dioxide gas sensor using the same |
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