JPS60146831A - モラクセラ・ボビス・バクテリン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、獣医用のワクチン、特に、モラクセラ・ボビ
ス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｂｏｖｉｓ　）バクテリアに
関する。

発明の背景 モラクセラ・ニスビイ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｓｐ、　
）　は、ナイセリア科（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａｃｅａｅ　
）に属する。これらは全くの好気性の、グラム陰性の、
対をなす太い桿状または短い鎖状であり、オキシターゼ
（＋）かつカタラーゼ（刊である。これらは呻乳動物に
おいて病因性であり、時には、流行性結膜炎と称される
結膜炎をひきおこす。

ビジエステルベルドはアメリカン・ジャーナル・オブ・
オフタモロジー、７２巻、１号〔Ｂｉｊｅｓｔｅｒｖｅ
ｌｄ、　Ａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｏｐｈｔｈａｍｏｌｏｇｙ
　７２（１）＝１８１〜１８４（１９７１））で、ヒト
の臨床的感染症より単離された２つの種、即ちモラクセ
ラ・リフエフアン：ｒ−７７，（Ｍ、　／（ｉｑｕｅｆ
ａｃｉｅｎｓ　）および新規を炭水化物分解種が、異な
る型式および量のプロテアーゼを生産すると報告してい
る。

モラクセラ・ボビスは、時として、ウソ流行性結膜炎と
称される伝染性ウソ角結膜炎（ＩＢＫ）の病因物質であ
る。バプテイスタはプリティッノユ・ヘテリナリー・ジ
ャーナル１３５号（Ｂａｐｔｉｓｔａ。

Ｂｒ、　Ｖｅｔ、　Ｊ、　１３５　：　２２５〜２４２
　（１９７９）　）で、ＩＢＫの発生、症状、感染、治
療および管理について記載している。

フランクらはジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロ
バイオロジー、１３巻、２号（Ｆｒａｎｋ　ａｎｄＧｅ
ｒｂｅｒ、　Ｊ、ＣＩｉｎｏＭｉｃｒＣｌｌｎｏ、　１
３　（２）　：　２ｊ９〜２７１　（１９８１））で、
モラクセラ・ボビスがＩＢＫを発現あるいは強化させる
ことのできる組織損傷酵素を産生ずると報告している。

パフらはカナディアン・ジャーナル・オブ・コンパラテ
イブ・メジ７２３７巻（Ｐｕｇｂ　ｅｔ　ａｌ　、。

Ｃａｎａｄ、Ｊ、ＣｏｍｐｏＭｅｄ、　３７　：　７０
〜７８（１９７３）　〕て、生モラクセラ・ボビス・ワ
クチンの反応原性におけるモラクセラ・ボビス・トキシ
ンについての役割について報告している。

ヘンソンらはコーネル・ベテリナリー５１巻〔１１ｅｎ
ｓｏｎ　ａｎｄ　Ｇｒｕｍｂｌｅｓ、　Ｃｏｒｎｅｌｌ
　Ｖｅｔ、５１：２６７〜２８４（１９６１））　で、
モラクセラ・ボビスによる溶血性トキシンおよび皮膚壊
死トキシンの産生を報告している。

発明の概要 本発明は、モラクセラ・ボビスにより産生されるタンパ
ク分解酵素がＩＢＫ予防の免疫予防剤として用いること
かできるという新たｆＳ知見に基く。

さらに詳細には、本発明の一態様は重大な副作用なしに
モラクセラ・ボビスに対する免疫を惹起させることがで
きるワクチン用量のモラクセラ・ボビス・プロテアーゼ
からなるワクチンである。

本発明のもう１つ別の態様は、タンパク質分解活性を有
する成分を含む、ワクチン用量のモラクセラ・ボビス・
バクテリアからなる、重大な副作用なしにモラクセラ・
ボビスに対する免疫を惹起させることのできるワクチン
である。

発明の詳細 な説明のワクチンを調製するのに有用ｆＳモラクセラ・
ボビス株は、ＩＢＫの臨床患者より単離することができ
るか、入手可能ｆＪ供給源から得ることができる。入手
可能な供給源としては、例えは、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクンヨン（Ａ＋ｎｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ
ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏ
ｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ、　Ｕ、Ｓ　、、Ａ、　）が含まれ、
ここに、モラクセラ・ボビス株を寄託番号、第１０９０
０号、第１７９４７号、第１７９４８号６ごて寄託しで
ある。該細菌は、たいていの通常の細菌培養培地上で増
殖する。しかし、本発明のワクチンを調製するためには
、ワクチン中にモラクセラ・ボビスのプロテアーゼが存
在することが不可欠であるため、該細菌は、それがモラ
クセラ・ボビス・プロテアーゼを産生ずるような培地中
にて増殖させる。

以下の第１表に、種々のバクテリン懸濁液のプロテアー
ゼ活性と、ビルラット・モラクセラ・ボビスの実験攻撃
に対するランおよびマウスの防御との関係を示してワク
チン中にモラクセラ・ボビス・プロテアーゼが存在する
ことか不＝ｆ欠であることを説明する。

バクテリンのプロテアーゼ活性は、０．５％オートクレ
ーブ処理脱脂乳を含有するトリブチカーゼ・大豆寒天平
板中で測定した。１０μ４　つつのバクテリンを３ｍ肩
の液ダメ（ｗｅｌｌ）に添加した。２４時間後、まず、
乳タンパク質分解域の９倍の投影図を描き、次に該タン
パク質分解領域をプラニ・メータで測定することにより
、分解域の測定を行なった。プラニ・メータで測定した
面積を、プロテアーゼ活性単位とした。相対プロテアー
ゼ活性（ＲＰＡ）は、つきのように定義される。

バクテリンの相対的効力はつぎのようにして判定した。

バクテリンを、０．１５　Ｍ　ＮａＣ１中、５倍に希釈
する。マウス（体重１６〜２０ｇ）に、２１日間隔で２
度、腹腔内投与（ＩＰ）により適度す希釈液０．５　ｄ
を接種する。最も低濃度の希釈液がワクチン接種したマ
ウスの５０％を防御するように選択した範囲で少なくと
も３つの５倍希釈のバクテリンを調製する。マウスに、
第２回目の接種７日後、５〜５０　ＬＤｓｏのビルシン
ト・モラクセラ・ボビスを含有する液０．５　ｄを投与
（ＩＰ）Ｌ、攻撃する。各試験希釈液についての全生存
ラットを攻撃の３日後に記録する。バクテリンの５０％
防御希釈終末値（ＰＤ５゜）をリードとミュンチの方法
〔アメリカン・ジャーナル・オブ・ハイジーン２７巻（
Ｒｅｅｄ　ａｎｄ　Ｍｕｅｎｃｈ、　Ａｍｅｒ、Ｊ、　
Ｈｙｇｉｅｎｅ　２７　：９３〜４９７（１９３８））
）で測定する。バクテリンの相対的効力（ＲＰ）は、対
照バクテリンのＰ　Ｄｓ　。

に対する該バクテリンのＰ　ＤｓｏＯ比である。本明細
書において用いた対照バクテリンは、モラクセラ・ボビ
スＮｅｂ−９株であり、以下の第２表の培地４にて約３
３℃で約９．５時間増殖させたものであり、詳細は以下
に記載する。

モラクセラ・ボビス・プロテアーゼの産生け、強化培地
で増殖させた場合に最大となる。例として、第２表に増
殖培地組成のモラクセラ・ボビスのプロテアーゼ産生に
及ぼす影響を示す。これらの結果および第３表に示す他
の実験結果から、プロテアーゼ産生を誘起するような基
質を増殖培地に添加することにより、プロテアーゼ産生
が高められることがわかる。かかる基質の例としては、
特に限定するものではないが、カゼインまたはカゼイン
ｍ　化物、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸または組
織統合性に寄与する他の組織構成成分、酵母エキス、ビ
ーフ・インヒユージョンおよびトリプトンが挙けられる
。他のこのような基質は、ｆｆ１ｌ記のよう【こ、かか
る基質の存在下で菌体を増殖させてタンパク質分解活性
をテストすることにより容易に確認できる。ヒアルロン
酸およびコンドロイチン硫酸および他の因子は、組織統
合性を保持するための細胞を結合する役割をする。つま
り、モラクセラ・ボビス・プロテアーゼの作用は、かか
る細胞結合にむけられると考えられる。

この結果は、プロテアーゼ産生が、特に、ミルク・スト
ック（Ｍｉ）ｋ　５ｔｏｃｋ　）のようなカゼイン源（
あるいはＮ−ＺアミンＡのようｆＳカゼイン消化物）を
増殖培地に添加することにより高められることを示して
いる。（例えば、第２表の培地１および５、ならひに第
３表の培地７および８を対比）第２表 ＲＰＭＩ−１６４０は、グランド・アイランド・ノくイ
オロジカＪＬｔ−カンパニー　（Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａ
ｎｄ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、　Ｇｒａ
ｒｓｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）　の製
品である。これは、以下の成分ＣＭｆ／ｌ）を含有する
。

Ｃａ（ＮＯ３）２”４Ｈ２０（１００）Ｌ−メチｙｌ−
’−’−７（１５）ＫＣｌ　（４００）　Ｌ−フェニル
アラニン（１５）ＭｇＳ０４　（４８８４）　Ｌ−プロ
リン（２０）ＮａＣ４’　（６０００）　Ｌ−セリ：／
　（３０）Ｎａ　２　ＨＰ　０４　（８００）　ＬＦレ
オニン（２０）グルコース（２００）　Ｌ−１−リプト
ファン（５）グルタチオン（還元）（１）Ｌ−チロノン
（２８，９４、ナトリウム塩）Ｌ−アルギニン（遊離塩
基）（２００）Ｌ−バリン（２０）Ｌ−アスパラギン（
５０）　ビオチン（０，２０）Ｌ−アスパラギン酸（２
０）　Ｄ−パントテン酸カルシウム（０，２５）Ｌ　−
ｙｙ、チ：／　（６５，１５，２ＨＣｇ）：ＩＩＪ　ン
Ｃｅ（３）Ｌ−グルタミン酸（２０）　葉酸（１）Ｌ−
グルタミン（ａｏｏ）　ｉ−イノシトール（３５）グリ
シン（１ｏ）　ニコチンアミド（１）Ｌ−ヒスチジン（
遊離塩基）（１５）　ｐ−アミノ安息香酸（１）Ｌ−ヒ
ドロキシプロリン（２０）　ピリドキノン塩酸塩（１）
Ｌ−インロイシン（アロＪｔｉｌＩ）（５０）　リボフ
ラビン（０，２０）Ｌ−ロイシン（メト、遊離）（５０
）　チアミン（１）Ｌ−リンン塩酸塩（４０）　ビタ（
ンＢ　１２　（０，００５）ＢＭＥアールズ・パウダー
（Ｅａｒｌｅｓ　Ｐｏｗｄｅｒ　）は、グランド・アイ
ランド・バイオロジカル・カンパニーの製品である。こ
れは、以下の成“分Ｃ１”９／ｌ）を含有している。

ＣａＣＡ’２　（２００）　Ｌ−７エ＝ノｂ７う＝７（
１６５０）Ｋ’４（４００）　Ｌ−トレオ：−ン（２４
）ＭｇＳＯ４（無水）（９７，６７）　Ｌ−１−リプト
ファン（４）ＮａＣｌ（６８００）　Ｌ−チロシン（２
６）Ｎａ）１２１’０４Ｈ２０（１４０）　Ｌ−バリン
（２３，５０）グルコース（１，０００）　ビオチン（
１）フェノール・レッド（１０）　Ｄ−パントテン酸カ
ルシウム（１）Ｌ−アルキニン塩酸塩（２１）コリン塩
酸（１）Ｌ−ンスーｙ−ン・２ｎｃ／（（１５−６５）
　葉酸（１）Ｌ−グルタミン（２９２）　ｉ−イノシト
ール（２）Ｌ−ヒスチジン（８）　ニコチンアミド（１
）Ｌ−インロイシン（２６）　ピリドキサール塩酸塩（
１）Ｌ−ロイシン塩酸塩（３６，４７）　リボフラビン
（０，１０）Ｌ−ロイシン（２６）　チアミン塩酸塩（
１）Ｌ−メチオニン（７，５） ユーゴン・ブロス（Ｅｕｇｏｎ　Ｂｒｏｔｈ　）は、ビ
ー・ビー・エル・ミクロバイオロジー・システムズ（Ｂ
ＢＬ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　、
　Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｃ、　Ｍａｒｙ　−Ｉａｎｄ
　）の製品である。これは、以下の成分＜　ｍｙｉβ）
を含有する。

トリブチカーゼ・ペプトン（１５）　亜硫酸ナトリウム
（０，２）フイトン・ペプトン（５）　Ｌ−シスチン（
０，７）ＮａＣｌ（４）　デキストロース（５，５）Ｎ
−Ｚアミ７　Ａ　（Ｎ−Ｚ　Ａｍ１ｎｅ　Ａ　）は、ン
エフィールドープロダクツ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ　Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ、　Ｎｏｒ−ｗｉｃｈ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ　）　より市販のカゼイン消化物である。

第２表の培地５を、本明細書においては、［バクテリン
培地（ｂａｃｔｅｒｉｎ　ｍｅｄｉｕｎｔ　）　ｌとよ
ぷ。これは、本発明のバクテリンおよびプロテアーゼの
産生に関して好ましい培地である。

同様の実験結果を、第３表に示す。

第３表 プレート・カウント・ブロス（Ｐｌａｃｅ　Ｃｏｕｎｔ
Ｂｒｏｔｈ　）はディフコ・ラボラトリーズ（１）ｉ［
ｃ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、　Ｄｅｔｒｏｉｔ　、　
Ｍｉｃｂｉｇａｎ　）の製品である。

これは、水１１につき５ｇの酵母エキス、１０ｇのトリ
プトンおよび２ｇのデキストロースを含有する。

ミュラー・ヒントンｅブロス（Ｍｕｅｌｌｅｒ−出ｎｔ
ｏｎＢｒｏｔｈ　）はミュラーらがプロン−ディンゲス
・オブ・ザ・ソサイエテイ・フォー・エクスペリメンタ
ル・バイオロジー・アンド・メジ７７４８巻〔Ｍｕｅｌ
ｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ　、、　Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅ
ｘｐ、Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄり準：３３０（１９４１）〕
　に記載している。これは、水ＩＥにつき３００９のビ
ーフ・インフュージョン、１７゜５ｇのアゾディカーゼ
・ペプトンおよび１．５ｇのデンプンを含有する。

ＭＩＥ培地は、以下の成分（ｍｙ／ｅ＞を含有する。

Ｌ−シスチン（２００）　セリン（１００）チロシン（
２００）　ウラツル（１００）ロイシン（３００）　ヒ
ポキサンチン（２０）アルギニン（３４０）　イノ７ン
（２０００）グＩＪ７：／（３００）　Ｋ２ＨＰＯ４（
二水塩）（３４８０）リンノ（５）ＫＨ２ＰＯ４（無水
物）　（２７２０）メチオニン（１００）　酵母エキス
（１００００）バクト・サブルメントＢ　（Ｂａｃｔｏ
　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　Ｂ　）はディフコ・ラボラト
リーズの製品であって、補足培地にて用いる強化成分で
ある。これは、新鮮な酵母の補助発育因子からなる。こ
れは、またグルタミン補酵素（Ｖ因子）、カルボキシラ
ーゼおよび他の発育因子も含有する。

プロテアーゼ産生は増殖期間にも依存する。以下の第４
表に、バクテリン培地中にて、培養期間の長さを変えて
培養したモラクセラ・ボビス株の相対的プロテアーゼ産
生を示す。

プロテアーゼ産生はまた、用いたモラクセラ・ボビス株
によっても変化しつる。例えば、実質的に同等な増殖条
件下にて、ＮＥＩＳ−９株は、２２１７タンパク質分解
単位を産生じ、ＦＬＡ−６４株は１８４６タンパク質分
解単位を産生じ、ＡＴＣＣ１０９００株は９００　タン
パク質分解単位を産生じた。

モラクセラ・ボビスに対するワクチンは、プロテアーゼ
から調製することかでき、好ましくは、培地から単離さ
れる。しかし、より好ましくは、前記の如く、プロテア
ーゼ産生を促進する条件下にて培養したモラクセラ・ボ
ビスの死菌からｆＳるバクテリンの形で該プロテアーゼ
を投与する。このようなバクテリンは、好ましくは、少
なくとも、該プロテアーゼに対して、免疫応答を惹起さ
せる。

即ち、抗体の産生を刺激するのに充分なプロテアーゼを
含有する。

典型的には、モラクセラ・ボビスの保存植株を、前記の
ようにして、バクテリン培地に接種する。

培養菌を３０〜３５℃、好ましくは、３３℃にて、８〜
２４時間、通気しながらインキュベートする。

充分増殖させた後、培養菌を、例えば、１〜５悌（ｖｏ
ｌ　／ｖｏｌ　）　の接種物を用いて新しい培地に移す
。

この、最終濃度で０．０１％のジヒドロストレプトマイ
シンを含有する第２次種継代を３０〜３５℃、好ましく
は、３３℃にて、通気をしながら培養する。

産生培養菌は、例えば１〜５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）
の第２次種継代接種物のような活発に増殖する菌体と共
に培地をインキュベートすることにより調製することが
できる。このような培養菌は高い酸素含有量、好ましく
は、少なくとも８０％の溶存酸素竜を維持するように、
通気する。ｐＨは、中性〜僅かに塩基性に保つ。例えば
、５　Ｎ　Ｎａ０Ｈｆｊどの塩基を添加してｐＨ７，３
にする。培養菌を、３０〜３５℃、好ましくは、３３℃
番ごて、少なくとも２時間、好ましくは、４〜２４時間
、５９０　ｎｍにおける吸収が、少なくとも２．０吸光
単位、好ましくは、少ｆ、Ｅくとも４．０吸光単位にな
るまで、インキュベートする。

菌体濃度を測定し、純度を確認した後に、通気を停止し
、攪拌を減速し、温度を３０℃以下、好ましくは、約２
５℃に降下させる。次いで、例えばホルムアルデヒドま
たはグルタルアルデヒドなどのような公知の不活化剤を
添加することにより、該培養菌を不活化する。好ましい
不活化剤は、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）であって
、その最終濃度は、ＢＰＬが迅速に効果を発揮すること
か判明しているので、１　：　１２００（０，００８３
％）である。

不活化は、完了するまで、通常約２〜１０時間続ける。

不活化した培養菌は、使用するまで４℃にて保存する。

保存剤、例えば、最終濃度か１　：　１０，０００の１
０％メルチオレート等を添加する。バクテリンに、　Ａ
ｆｉ（ＯＨ）３またはカーポポール等の公知のアジュバ
ントを加える。好ましいアジュバントは０、５１１９　
／　ｗｅのＱｕｉｌ　Ａ　である。ＱｕｉｌＡはサポニ
ンである〔ダルスガード、アクタ・ベテリナリー・スカ
ンジナビ力、補遺５９　（Ｄａｌｓｇａａｒｄ、　Ａｃ
ｔａＶｅｔｅｒｉｎ、　５ｃａｎｄ、　５ｕｐｐ　６９
　：　１〜４０（１９７８）参照〕。

バクテリンは、５９０ｎｍで２０吸光単位より少ｆＳり
ならないように、好ましくは、５９０ｎｍで４．０吸光
単位とｆＪるように、要すれば、食塩水等で希釈するこ
とにより、標準化する。このような投与単位形態は、前
記のように、０．４またはそれ以上の相対効力（ＲＰ）
にほぼ相当する。

別法として、菌体を、不活化前または夜に培地から除去
することができ、プロテアーゼを含有する組上澄液を、
免疫防御剤として用いることもできる。しかし、この別
法において、好ましくは、プロテアーゼは、クロマトグ
ラフィーｆｌどの標準的タンパク質精製法により精製し
、この精製したプロテアーゼを、免役防御剤として用い
るのがよい。このプロテアーゼにアジュバントを加え、
相対効力０．４から１．０以上、好ましくは、１．０以
上の単位形態で投与する。

本発明のワクチンは、好ましくは、２罰づつの投与量を
２度、３週間の間隔をあけて、ウソの首部に皮下投与す
る。実験動物の大きさおよびワクチンの相対効力などに
応じて、投与量をより高く、またはより低く変化させた
り、他の投与経路および投与スケジュールを用いてもよ
い。例えは、１〜３ｍｌの投与量を、筋肉内投与または
眼の周囲に皮下投与することができる。

ウシの、１次免疫付与を４週令て開始し、その３週間後
に、ブースター投与をする。毎年、再ワクチン接種する
ことが推奨される。

実施例 以下の実施例により、本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１ マスター保存植株および攻撃培養菌 モラクセラ・ボビスをＩＢＫのウシから単離する。

単離物を、０．５％ヒツジ赤血球（ＲＢＣ）を含有する
トリブチカーゼ・ソイ・アカ−上で２度継代する。第２
回継代、即ちマスター保存植株をＮｅｂ　−９株と命名
し、これをバクテリン培地で増殖させ、凍結乾燥させて
４℃にて保存するか、あるいは冷凍して一７０℃にて保
存する。Ｎｅｂ−９株は、米国特許法およびブダペスト
条約に従って、アメリカンタイプ・カルチャー・コレク
ション（７ＩｕｎｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｐｅｏｌｉａ、　１ｌｌ
ｉｎｏｉｓ　）に、寄託番号第、３９５０３号で寄託し
である。

該マスター保存植株は、以下の特徴を有するグラム陰性
菌の純粋培養菌であることが確認された：自己凝集性、
β−溶血性、オキシダーゼ（刊、ゼラチン（刊、カゼイ
ナーゼ（ト）、ストレプトマイシン耐性、マツコンキー
寒天培地上で増殖せず、クエン酸（−）、硝酸（−）お
よびフェニルアラニン（−）。

標準的攻撃培養菌を、Ｎｅｂ−９株および他のＩＢＫの
ウソから単離した異種攻撃株、Ｎｅｂ−’１株を０．５
％ヒツジＲＢＣ含有のトリブチカーゼ・ソイ・アガー平
板上で増殖させて調製する。平板を３３℃にて２４時間
、次いで室温にて４時間、インキュベートする。次に増
殖株を滅菌綿スワブでとりたし、１　ｍｌのトリブチカ
ーゼ・ソイ・ブロス中に懸濁させる。これを、標準攻撃
植株として、−７０℃にて凍結させる。ウシを攻撃する
１日前に、該標準培養菌を解凍する。１５０＋ｌのバク
テリン培地にその１　ｍ／を添加し、３３℃にて１８時
間、次いで室温にて５時間増殖させる。該攻撃株の病原
性を、５〜６週令のウソの眼を異ｆＪつだ濃度のモラク
セラ・ボビスで感染させて評価する。

モラクセラ・ボビスの濃度は５９　Ｑ　ｎｍにおける光
学密度により測定する。各ウシの両眼の第三眼瞼下に０
．５　ｍｌのモラクセラ・ボビス培養菌を、針のないツ
ベルクリン注射筒を用いて接種する。ウシをモラクセラ
・ボビスのＮｅｂ−１株またはＮｅｂ−９株いずれかで
攻撃する。ウソの眼を２週間、毎日、ＩＢＫの痕跡があ
るか否か検査し、さらに２週間、定期的に検査する。

疾患の程度は、以下のようにして調へる。評点０は、観
察期間中、眼は正常ｆＳ外観を保持していたことを示す
。観察期間中の何時でも眼から涙か出た場合は、１とす
る。評点２は、涙に加えて、眼がはれあがった（結膜炎
）ことを示し、評点３は、観察期間中、結膜炎（ＩＢＫ
）に加えて、角膜炎が明らかであることを示す。結果を
第５表に示す。

実施例２ バクテリン／プロテアーゼワクチンの調製モラクセラ・
ボビスＮｅｂ−９株の第２種継代をバクテリン培地中で
３３℃にて２４時間、５９０ｎｍで４．３吸光単位とな
るまで増殖させる。溶存酸素は、通気および攪拌により
、約８０％以上に保持する。５ＮＮａＯＨを添加してｐ
ｉ−１７，３ｉこ維持する。β−プロピオラクトンの１
／１２００（０，０８３％）希釈液で不活化する前に、
培養液を一定撹拌下、２０℃以下に冷却し、空気および
排気口を閉鎖しておく。

不活化の前、培地中の生存細菌数は１ＩＲ１当り４×ｌ
Ｏ９個コロニー形成単位である。

不活化をこ続いて、メルチオレート溶液を加えて、最終
濃度を１／１０，０００とし、ＱｕｉｌＡを加えて最終
濃度を０．５η／　ｍｌにする。相対プロテアーゼ活性
（ＲＰＡ）は０，９４てあった。

実施例３ バクテリン／プロテアーゼ・ワクチンの効能テスト ４頭の、３〜４週令の雑種ウシに実施例２に記載のバク
テリンを接種する。３〜４週令の雑種の・ウシ３頭には
接種をしない。ワクチンは、首部に皮下投与する。ワク
チン接種を受けたウシは全て２１日間隔て２回バクテリ
ンを投与されている。

ワクチン接種前、第１同棲種の２１日後および第２同棲
種の７日夜ｌこ、血清テストのための血清を採取する。

全てのウソをビルシント・モラクセラ・ボビスで攻撃す
る。

第６表は、モラクセラ・ボビス・バクテリンの接種を受
けた全てのウソでは、接種後２８日まで（第２同棲種の
７日後まで）に、血清凝集抗体が発生することを示して
いる。ウシの眼を、２週間毎日ＩＢＫの痕跡があるかど
うか検査し、ついで定期的にさらに２週間検査する。Ｒ
Ｐか１．ｌＯおよびＲＰＡが０．９４のバクテリンはワ
クチン接種したウシの７５％（３／４　）をＩＢＫに対
して防御した。接種を受けなかったウソ全て（３／３）
において、ＩＢＫが発生した。

第６表 バクテリア／プロテアーゼ効能テスト 血清凝集力価および攻撃の結果 １評点 〇−正常状態の眼、感染はみられない ｌ−涙が出る状態 ２−涙に加えて眼がはれた状態 ３　＝　Ｉ　ＢＫ 実施例４ プロテアーゼ・ワクチンの調製 ＲＰＭＩ−１６４０，２％Ｎ−Ｚ７ミ：／Ａおよび０．
２％炭酸水素ナトリウム中で、２１日間、３３℃にて、
５９　Ｑ　ｎ＋ｎでの吸収が７．０吸光単位になるまで
増殖させたモラクセラ・ボビスＮｅｂ−９株の第２種継
代の上清を７０倍に濃縮し、バイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇ
ｅｌ　）　ｐ−２００（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　）を充填した
１５ｉ＋Ｉｘ９４（ｌｌ１ｍカラム上で分画する。これ
により、タンパク質分解活性を有し、実質的に、他のモ
ラクセラ・ボビス抗原を有さない培養成分を部分曲に分
離する。溶出緩衝液は、０．０２　Ｍ　）　ＩＪ　ｙ、
、０．０２８　Ｍ　ＮａＣｆｆおよび０．０２％Ｎ　ａ
Ｎ３でｐｉ−Ｉ　８．Ｑである。プロテアーゼ活性を有
するフラクションを合して濃縮する。培養液上清からの
最終濃縮係数は２５倍である。相対プロテアーゼ活性は
１０てあつブこ。

この部分精製プロテアーゼを含有するフラクションをた
め、ＱｕｉｌＡと合し、Ｑｕｉｔ　Ａの最終濃度が５０
μＱ／ｍｌとなるようにする。

実施例５ プロテアーゼ・ワクチンのマウスに対する効能テスト 実施例４に記載のプロテアーゼ・ワクチン調製物および
対照バクテリンを、ｌ　ｍｅにつき５０μｇノＱｕｉｌ
　Ａを含有する０、　１５　Ｍ　ＮａＣｊ’中５倍に希
釈する。マウス（１６〜２０ｇ）に、２１日間隔で、１
／１０．１１５０または１／２５０のいずれかのワクチ
ンまたはバクテリン希釈液をＱ、　５　ｍｌ、腹腔内投
与する。マウスを７日後に感染性モラクセラ・ボビスＮ
ｅｂ　−１株（３１，２ｔ−Ｄｓ　ｏ　）で攻撃する。

攻撃の３日後に、各試験希釈液について、生存数を記録
スル。プロテアーゼ・ワクチン調製物のＰ　Ｄ５０値は
１／４３．７てあった。対照バクテリンのＰ　Ｄ５゜値
は１／１７７．２であった。これらの結果より、モラク
セラ・ボビスの他の抗原成分より分離されたプロテアー
ゼ抗原は、マウスを、モラクセラ・ボビスの攻撃より防
御することがわかる。他の抗原成分から分離されたプロ
テアーゼ抗原は種々の家畜についても、モラクセラ・ボ
ビス感染に対する防御の助けとなる。このことはモラク
セラ・ボビス・バクテリンのＲＰ、ＲＰＡと、その家畜
をモラクセラ・ボビス感染より防御する効果との間には
、直接的な関係があるという事実に基づいている。

しかし、バクテリンは、プロテアーゼ抗原単独よりも、
より効果的である。

以上、本発明の好ましい態様について記載したが、それ
らの変形例も全て本発明範囲のものである。

特許出願人　ノルデン・ラボラドリース・インコーポレ
イテッ、ド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）重大な副作用なしに、モラクセラ・ボビス（Ｍｏ
   ｒａｘｅｌｌａ　ｂｏｖｉｓ　）　ニ対する免疫性を誘
   起させることのできる、ワクチン用量のモラクセラ・ボ
   ビス・プロテアーゼからなることを特徴とするワクチン
   。 （２）実質的に他のモラクセラ・ボビス抗原を含まない
   ｔ７ｉＪ記第（１）項のワクチン。 （３）プロテアーゼ産生を誘起する基質および他の栄養
   源を含有する培地中で増殖させたモラクセラ・ボビスの
   培養液から得た上清を濃縮したフ？クンヨンからなる前
   記第（１）項のワクチン。 （４）プロテアーゼ産生を誘起する基質が、カゼインま
   たはカゼイン消化物、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫
   酸または組織統合性に寄与する他の組織構成成分、酵母
   エキス、ビーフ・インフュージョンあるいはトリプトン
   である前記第（３）項のワクチン。 （５）プロテアーゼ産生を誘起する基質が、カゼインま
   たはカゼイン消化物である前記第（３）項のワクチン。 （６）モラクセラ・ボビス培養液を、３０〜３５°Ｃに
   て、通気しながら、中性〜僅かにアルカリ性のｐＩｆ、
   ５９　Ｑ　ｎｍでの吸光が少なくとも２．０吸光単位に
   なるまで増殖させる前記第（３）項のワクチン。 （７）モラクセラ・ボビス培養液を５９０　ｎｍでの吸
   光が、少なくとも４，０吸光単位になるまで増殖させる
   前記第（６）項のワクチン。 （３）モラクセラ・ボビスがＮｅｂ−９株である前記第
   （６）項のワクチン。 （９）培地が２％Ｎ−ＺアミンＡおよび０．２％炭酸水
   素ナトリウムを含有するＲＰＭＩ　１６４０である前記
   第（３）項のワクチン。 四重大な副作用を起こさずにモラクセラ・ボビスに対す
   る免疫性を誘起させることのできる、タンパク質分解活
   性を有する成分を含有するワクチン用量のモラクセラ・
   ボビス・バクテリンからなるワクチン。 ０υバクテリン中のプロテアーゼ量が、プロテアーゼに
   対する免疫応答を刺激するのに充分な量である前記第（
   １０項のワクチン。 ０４バクテリンが、プロテアーゼの産生を誘起する基質
   および他の栄養源を含有する培地中で増殖させたモラク
   セラ・ボビスの不活化した培養液である前記第四項のワ
   クチン。 ０４プロテアーゼ産生を誘起する基質が、カゼインまだ
   はカゼイン消化物、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸
   または組織統合性に寄与する他の組織構成成分、酵母エ
   キス、ビーフ・インフュージョンあるいはトリプトンで
   ある前記第０４項のワクチン。 ａ＜プロテアーゼ産生を誘起する基質かカゼインまたは
   カゼイン消化物である前記第（２）項のワクチン αυモラクセラ・ボビスの培養液を、３０〜３５℃にて
   、通気をしｆ、ｆから、中性〜僅力肩こアルカリ性条件
   で、５９　Ｑ　ｎｍでの吸光が少なくとも２．０吸光単
   位になるまで増殖させる前記第０４項のワクチン。 ＯＱモラクセラ・ボビスの培養液を５９０　ｎｍでの吸
   光が少なくとも４．０吸光単位になるまで増殖させる前
   記第００項のワクチン。 ａηモラクセラ・ボビスが、Ｎｅｂ−９株である前記第
   ００項のワクチン。 ａ榎β−プロピオラクトンを最終濃度か１：１２００と
   なるように添加することにより不活化し、アジュバント
   としてＱｕｉｌ　Ａを、その最終濃度が０，５〜／　ｔ
   ｎｅとなるように加えた、２％Ｎ−ＺアミンＡおよび０
   ．２％炭酸水素ナトリウムを含有するＲＰＭ　１１６４
   ０中のモラクセラ・ボビス培養液からｆＳる前記第α０
   項のワクチン。 ０９哺乳動物にワクチン量のモラクセラ・ボビス・プロ
   テアーゼを投与することからなることを特徴とする、重
   大な副作用なしくこモラクセラ・ボビスによる感染に対
   して哺乳動物を防御する方法。 翰プロテアーゼが実質的に他のモラクセラ・ボビス抗原
   を含まない前記第０９項の方法。 Ｑυプロテアーゼ産生を誘起する基質および他の栄養源
   を含有する培地中で増殖させたモラクセラ・ボビスの培
   養液の上清の濃縮したフラクションとしてプロテアーゼ
   を投与する前記第０９項の方法。 ゆプロテアーゼ産生を誘起する基質が、カゼインまたは
   カゼイン消化物、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸ま
   たは組織統合性に寄与する他の組織構成成分、酵母エキ
   ス、ビーフ・インフュージョンあるいはトリプトンであ
   る前記第Ｑυ項の方法。 脅プロテアーゼ産生を誘起゛する基質が、カゼインまた
   はカゼイン消化物である前記第０９項の方法。 （至）モラクセラ・ボビスの培養液を、３０〜３５℃に
   て、通気をしながら、中性〜僅かにアルカリ性のｐｉ−
   １で、５９００ｍでの吸光が少なくとも２．０吸光単位
   になるまで増殖させる前記第０９項の方法。 （ハ）モラクセラ・ボビスの培養液を５９０　ｎｍでの
   吸光か少ｆＳくとも４．０になるまで増殖させる前記第
   （至）項の方法。 （至）プロテアーゼが、モラクセラ・ボビスＮｅｂ　−
   ９株により産生される前記第（至）項の方法。 （イ）培地が２％Ｎ−ＺアミンＡおよび０．２％炭酸水
   素ナトリウムを含有するＲＰＭＩ　１６４０　である前
   記第（７）項の方法。 （至）プロテアーゼをモラクセラ・ボビス・バクテリン
   として投与する前記第［１項の方法。 翰バクテリン中に存在するプロテアーゼ量がプロテアー
   ゼに対する免疫応答を刺激するのに充分である前記第弼
   項の方法。 （７）バクテリンが、プロテアーゼの産生を誘起する基
   質および他の栄養源を含有する培地中で増殖させたモラ
   クセラポビスの不活化した培養液である前記第弼項の方
   法。 ６υプロテアーゼ産生を誘起する基質が、カゼインまた
   はカゼイン消化物、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸
   または組織統合性に寄与する他の組織構成成分、酵母エ
   キス、ビーフ・インフュージョンあるいはトリプトンで
   ある前記第一項の方法。 に）プロテアーゼ産生を誘起する基質が、カゼインまた
   はカゼイン消化物である前記第（至）項の方法。 （至）モラクセラ・ボビス培養液を、３０〜３５℃にて
   通気をしながら、中性〜僅かにアルカリ性で、５９　Ｑ
   　ｎｍての吸光単位が、少なくとも２．０吸光単位にな
   るまで増殖する前記第（至）項の方法。 Ｃ縛モラクセラ・ボビス培養液を、５９００ｍでの吸光
   が少なくとも４．０吸光単位になるまで増殖する前記第
   （ハ）項の方法。 曽バクテリンが、モラクセラ・ボビスＮｅｂ−９株の不
   活化した培養液である前記第（ハ）項の方法。 （至）β−プロピオラクトンを、最終濃度か１　二１２
   ００となるように添加することにより不活化し、アジュ
   バントとしてＱｕｉｌＡの最終濃度が０，５〜／　ｍｅ
   となるように、Ｑｕｉｌ　Ａを加えた２％Ｎ−Ｚアミン
   Ａおよび０．２％炭酸水素ナトリウムを含有するＲＰＭ
   Ｉ　１６４０　中モラクセラ・ボビスト３＃Ｉ／の単位
   投与量を、ウソの首部に皮下投与する１）ｌ記載に）項
   の方法。