JPS60152947A - 尿酸と無機リンの連続定量法 - Google Patents
尿酸と無機リンの連続定量法Info
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- JPS60152947A JPS60152947A JP59008794A JP879484A JPS60152947A JP S60152947 A JPS60152947 A JP S60152947A JP 59008794 A JP59008794 A JP 59008794A JP 879484 A JP879484 A JP 879484A JP S60152947 A JPS60152947 A JP S60152947A
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- inorganic phosphorus
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の属する分野〕
この発明は、水浴性酵素と固定化酵素膜を用いて被検液
中の尿酸と無機リン濃度をポーラログラ〔従来技術とそ
の問題点〕 臨床検査分野における尿酸の定量は、体内の生成先進（
痛風など）と腎からの排泄異常などの指標として重要視
されている。さらζこ尿酸は代謝異常性扶患との関連で
興味がもたれでいる。才だ、臨床検査分野における無機
リンの定量は、主として骨および鉱質代細動態を知るう
えに必要である〇さらに環境計測分野では水質の富栄養
化の指標として重要な測定項目である。
中の尿酸と無機リン濃度をポーラログラ〔従来技術とそ
の問題点〕 臨床検査分野における尿酸の定量は、体内の生成先進（
痛風など）と腎からの排泄異常などの指標として重要視
されている。さらζこ尿酸は代謝異常性扶患との関連で
興味がもたれでいる。才だ、臨床検査分野における無機
リンの定量は、主として骨および鉱質代細動態を知るう
えに必要である〇さらに環境計測分野では水質の富栄養
化の指標として重要な測定項目である。
この種の尿酸と無機リンの定量法は、一般に正確、簡便
かつ迅速であることが要請され、特に血液の場合は、遠
心分離操作を必要としない全血のままの測定が強く望ま
れている。
かつ迅速であることが要請され、特に血液の場合は、遠
心分離操作を必要としない全血のままの測定が強く望ま
れている。
酵素１Ｌ極を用いた尿酸と無機リンの同一反応セル内で
の連続定量法は特に知られていない。
の連続定量法は特に知られていない。
尿酸の定量法は、大別して還元法と酵素法の二種類に分
類できる。還元法の代表的なものは、リンタングステン
酸を還元して青色の色素を比色定量する方法である。酵
素法の場合には、尿酸を尿酸分解酵素ウレアーゼ（ＥＣ
Ｉ、７，３．３）で分解し、紫外部の吸光度の差から尿
酸濃度をめる方法と、ウリカーゼを作用させたときに生
成する過酸化水素を比色が可能な他の還元酵素と共役さ
せ、可視部で簡便に定量する方法が知られている。
類できる。還元法の代表的なものは、リンタングステン
酸を還元して青色の色素を比色定量する方法である。酵
素法の場合には、尿酸を尿酸分解酵素ウレアーゼ（ＥＣ
Ｉ、７，３．３）で分解し、紫外部の吸光度の差から尿
酸濃度をめる方法と、ウリカーゼを作用させたときに生
成する過酸化水素を比色が可能な他の還元酵素と共役さ
せ、可視部で簡便に定量する方法が知られている。
これらの方法は、尿酸類似化合物ζこよって正誤差が生
じたり、試料中に共存するアスコルビン酸やグルタチオ
ンなどにより負誤差が生じるといった欠点がある。さら
には体液などの着色試料をそのまま使用することができ
ず、測定に要する時間が長いといった欠点がある。
じたり、試料中に共存するアスコルビン酸やグルタチオ
ンなどにより負誤差が生じるといった欠点がある。さら
には体液などの着色試料をそのまま使用することができ
ず、測定に要する時間が長いといった欠点がある。
近年、これらの欠点を除去する方法として固定化酵素を
用いる酵素電極法が知られてきた。
用いる酵素電極法が知られてきた。
Ｕｐｄｉｋｅら（Ｎａｔｕｒｅ、 ２１４．８８６（１
９６７）］こより酵素電極の概念が報告されていらい尿
酸への適用も行なわれているが、尿酸と無機リンを連続
して足鉛、する方法は知られていない。
９６７）］こより酵素電極の概念が報告されていらい尿
酸への適用も行なわれているが、尿酸と無機リンを連続
して足鉛、する方法は知られていない。
無機リン定量法としてはＦｉｓｋｅ−８ｕｂｂａ Ｒｏ
ｗ法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、６６、３７５（１９２
５））による還元発色法が一般的であるが、この方法に
は呈色の安定性や感度などに難点がある。近年、これら
の影響を軽減した酵素（プリンヌクレオシドホスフオリ
ラーゼ。
ｗ法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、６６、３７５（１９２
５））による還元発色法が一般的であるが、この方法に
は呈色の安定性や感度などに難点がある。近年、これら
の影響を軽減した酵素（プリンヌクレオシドホスフオリ
ラーゼ。
キサンチンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ）を用
いた比色法が用いられる様になったが、１）使用する三
つの酵素を使い捨てにするため経済的でない、２）体液
のような着色試料をそのまま使うことができない、３）
測定に要する時間が長いといった問題点がある。基質イ
ノシンと酵素ブリンヌクレオシドホスフオリラーゼと酵
素キサンチンオキシダーゼを用い、無機リンの存在下で
生成するＨ２Ｏ２を、直接Ｈ７０２選択透過性膜で被覆
した過酸化水素電極でアンペロメ） ＩＪラック定量し
、試料中の無４１１Ｊン濃度を分析する方法も報告され
ている（両生検査、３２（３）、３４２（１９８３））
。
いた比色法が用いられる様になったが、１）使用する三
つの酵素を使い捨てにするため経済的でない、２）体液
のような着色試料をそのまま使うことができない、３）
測定に要する時間が長いといった問題点がある。基質イ
ノシンと酵素ブリンヌクレオシドホスフオリラーゼと酵
素キサンチンオキシダーゼを用い、無機リンの存在下で
生成するＨ２Ｏ２を、直接Ｈ７０２選択透過性膜で被覆
した過酸化水素電極でアンペロメ） ＩＪラック定量し
、試料中の無４１１Ｊン濃度を分析する方法も報告され
ている（両生検査、３２（３）、３４２（１９８３））
。
この方法は、比色法と比較すると、着色試料の分析がで
きる、測定時間を短縮することができるといった特長を
有するが、１）測定時間は５分を必要とする、２）低濃
度の無機リン測定では、生成するＨ２Ｏ２が少ないため
検出系は高精度で安定した特性が要求される、３）Ｈ２
０２選択透過膜にセルロースアセテート膜を用いている
ため、全血試料を長期にわたって測定するとめすまりを
おこす可ｆｉＦ性が高いといった解決すべき問題点があ
る。
きる、測定時間を短縮することができるといった特長を
有するが、１）測定時間は５分を必要とする、２）低濃
度の無機リン測定では、生成するＨ２Ｏ２が少ないため
検出系は高精度で安定した特性が要求される、３）Ｈ２
０２選択透過膜にセルロースアセテート膜を用いている
ため、全血試料を長期にわたって測定するとめすまりを
おこす可ｆｉＦ性が高いといった解決すべき問題点があ
る。
この発明は上述の欠点を除去して、迅速、簡便かつ高い
選択性を有し、全血および着色試料の測定ができる酵素
′電極を用いた尿酸と無機リンの連続分析法を提供する
ことを目的とする。
選択性を有し、全血および着色試料の測定ができる酵素
′電極を用いた尿酸と無機リンの連続分析法を提供する
ことを目的とする。
試料を緩衝溶液で満たされた反応セル内に注入し、まず
試料中に含まれる尿酸を酸素電極で検出し、次に無機リ
ン測定用混合試薬を注入し、無機リンをイノシンと共存
した状態で酵素プリンヌクレオシドホスフオリラーゼ（
ＰＮＰ、ＥＣ２，４゜２．１）と反応させ、まずヒポキ
サンチンとリボース−１−リン酸に変換し、次に生成し
たヒポキサンチンを０２存在下で酵素キサンチンオキシ
ダーゼ（ＸＯＤ、ＥＣＩ、２，３．２）により尿酸と過
酸化水素に変換し、前記反応セル内に設置された固定化
ウリカーゼ膜を被へした過酸化水素電極で生成した尿酸
および過酸化水素をポーラログラフ法により検出し、予
め作成した検量線から無機リン濃度を定量することによ
り達成される。無機リン濃度は、前記反応の際に消費さ
れる酸素と生成する尿酸を反応セル内に設置された固定
化ウリカーゼ膜を被覆した酸素電極を用いて検出するこ
とにより定量することもできる。
試料中に含まれる尿酸を酸素電極で検出し、次に無機リ
ン測定用混合試薬を注入し、無機リンをイノシンと共存
した状態で酵素プリンヌクレオシドホスフオリラーゼ（
ＰＮＰ、ＥＣ２，４゜２．１）と反応させ、まずヒポキ
サンチンとリボース−１−リン酸に変換し、次に生成し
たヒポキサンチンを０２存在下で酵素キサンチンオキシ
ダーゼ（ＸＯＤ、ＥＣＩ、２，３．２）により尿酸と過
酸化水素に変換し、前記反応セル内に設置された固定化
ウリカーゼ膜を被へした過酸化水素電極で生成した尿酸
および過酸化水素をポーラログラフ法により検出し、予
め作成した検量線から無機リン濃度を定量することによ
り達成される。無機リン濃度は、前記反応の際に消費さ
れる酸素と生成する尿酸を反応セル内に設置された固定
化ウリカーゼ膜を被覆した酸素電極を用いて検出するこ
とにより定量することもできる。
この発明による尿酸と無機リンの連続定量法は、以下の
測定原理ζこ基づくものである。
測定原理ζこ基づくものである。
尿酸の検出は次の固定化ウリカーゼ膜内で進行する反応
により生成するＨ２Ｏ２又は消費される０２をポーラロ
グラフ法で測定し行なわれる。
により生成するＨ２Ｏ２又は消費される０２をポーラロ
グラフ法で測定し行なわれる。
尿酸＋０２＋Ｈ２０朋箇コ旦り刃ノた写１アラントイン
＋Ｈ２Ｏ２＋ＣＯ２（１）尿酸を定量したのち、以下の
反応を利用して無機リンを定量する。無機リンは、ｐＨ
７，３５＋７）緩衝溶液中では大部分ＨＰＯ４として存
在し、基質イノシンの共存下でブリンヌクレオシドホス
フオリラーゼにより次の反応が進行する。
＋Ｈ２Ｏ２＋ＣＯ２（１）尿酸を定量したのち、以下の
反応を利用して無機リンを定量する。無機リンは、ｐＨ
７，３５＋７）緩衝溶液中では大部分ＨＰＯ４として存
在し、基質イノシンの共存下でブリンヌクレオシドホス
フオリラーゼにより次の反応が進行する。
イノンン＋ｎｐｏニー−ヒポキサンチン＋リポースー１
−リン酸 （２）ヒポキサンチンはキサンチンオキシダ
ーゼにより次式により尿酸と過酸化水素に変換される。
−リン酸 （２）ヒポキサンチンはキサンチンオキシダ
ーゼにより次式により尿酸と過酸化水素に変換される。
ヒポキサンチン＋２０２ ＋ ２ Ｈ２０−一→尿酸＋
Ｈ２Ｏ２（３）本発明は生成する尿酸とＨ２Ｏ２又は生
成する尿酸と消費される０２をポーラログラフ的に検出
し、一定時間後の反応電流の変化量から間接点に無機リ
ン碇度を定量するものである。
Ｈ２Ｏ２（３）本発明は生成する尿酸とＨ２Ｏ２又は生
成する尿酸と消費される０２をポーラログラフ的に検出
し、一定時間後の反応電流の変化量から間接点に無機リ
ン碇度を定量するものである。
ここで特長的なことは、尿酸の定量を行った後の無機リ
ンの定量において生成する尿酸と過酸化水素あるいは生
成する尿酸と消費される酸素を、固定化ウリカーゼ膜を
被覆した過酸化水素電極あるいは酸素電極を用いて、（
３）式に従って生成する過酸化水素あるいは消費される
酸素を検出するのみでなく、同時に生成する尿酸を選択
性に優れた固定化ウリカーゼ膜−電極法により検出して
いることである。
ンの定量において生成する尿酸と過酸化水素あるいは生
成する尿酸と消費される酸素を、固定化ウリカーゼ膜を
被覆した過酸化水素電極あるいは酸素電極を用いて、（
３）式に従って生成する過酸化水素あるいは消費される
酸素を検出するのみでなく、同時に生成する尿酸を選択
性に優れた固定化ウリカーゼ膜−電極法により検出して
いることである。
本発明は固定化酵素膜を使用することにより、尿酸と無
機リンを連続して測定できるようにしたのみならず、無
機リン濃度の測定においても尿酸の検出を可能としたた
め、無ｔａ ＩＪンの定播感ルよの上昇をもたらし、か
つ同定化ウリカーゼ膜は共存物質の影響を受けにくく、
さらに血球、タンパクなどの汚染物質から電極および酵
素層を保肢するため、妨害物質の影響を受けずに長期に
わたって安定した出力が得られるとの考え方に基づいて
いる。
機リンを連続して測定できるようにしたのみならず、無
機リン濃度の測定においても尿酸の検出を可能としたた
め、無ｔａ ＩＪンの定播感ルよの上昇をもたらし、か
つ同定化ウリカーゼ膜は共存物質の影響を受けにくく、
さらに血球、タンパクなどの汚染物質から電極および酵
素層を保肢するため、妨害物質の影響を受けずに長期に
わたって安定した出力が得られるとの考え方に基づいて
いる。
第１図に尿酸と無機リンの検出部の構成を示す。
ここで１０は過酸化水素電極、１２はそのリード線、１
４は温度補償用サーミスタ、１６はそのリード線、１８
は反応セル、２ｏは緩衝溶液で満たされた反応セル室を
それぞれ示す。２２は試料および試薬溶液の注入口、２
４は反応セル室内攪拌用のダイヤフラム、２６はステン
レスパイプをそれぞれ示す。反応セル室２ｏは一定の容
積（０，４ｍ１）を有し、図示されていない手段によっ
て一定温度（２７〜３７°Ｃ）に保持されている。
４は温度補償用サーミスタ、１６はそのリード線、１８
は反応セル、２ｏは緩衝溶液で満たされた反応セル室を
それぞれ示す。２２は試料および試薬溶液の注入口、２
４は反応セル室内攪拌用のダイヤフラム、２６はステン
レスパイプをそれぞれ示す。反応セル室２ｏは一定の容
積（０，４ｍ１）を有し、図示されていない手段によっ
て一定温度（２７〜３７°Ｃ）に保持されている。
次に本発明に使用する固定化ウリカーゼ膜で被酸された
過酸化水素電極の例を第２図に示す。ここで３０は白金
極、３４は電極であり、３２はこれら両電極間の絶縁層
である。才た３６はＯＩＪソング持用ガイド、３８はｏ
リング、４ｏはウリカーゼの固定化酵素膜であり、白金
極３ｏと電極３４の表面に密着されている。ここで白金
極３ｏには電極３４に対して＋０．６〜０．８ Ｖの範
囲の一定電圧を印加しておく。一方、第２図で示した過
酸化水素電極１０は、白金極３０に電極３４に対して−
０，６〜０．８■の範囲の一定電圧を印加することで、
酸素′（５）極としても使用することができる。
過酸化水素電極の例を第２図に示す。ここで３０は白金
極、３４は電極であり、３２はこれら両電極間の絶縁層
である。才た３６はＯＩＪソング持用ガイド、３８はｏ
リング、４ｏはウリカーゼの固定化酵素膜であり、白金
極３ｏと電極３４の表面に密着されている。ここで白金
極３ｏには電極３４に対して＋０．６〜０．８ Ｖの範
囲の一定電圧を印加しておく。一方、第２図で示した過
酸化水素電極１０は、白金極３０に電極３４に対して−
０，６〜０．８■の範囲の一定電圧を印加することで、
酸素′（５）極としても使用することができる。
さらに第３図に尿酸と無機リンの検出装置の例を示す。
ここで５２は第１図に示した検出部であり、そこへ緩衝
液５０が液送ポンプ５４により給送される。５６は廃液
溜めである。電極をポーラログラフ装置５８に接続し、
さらに出力記録部６゜に接続する。
液５０が液送ポンプ５４により給送される。５６は廃液
溜めである。電極をポーラログラフ装置５８に接続し、
さらに出力記録部６゜に接続する。
゛ 第１〜３図を参照して本発明の方法の実施例を説明
すれば次の通りである。
すれば次の通りである。
実施例１゜
過酸化水素電極１０に固定化ウリカーゼ膜４゜を装着し
て用いた。緩衝液５ｏとして０．１Ｍトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７，３５）を用いた。無機リン定量段階で使用する基
質であるイノシンは、３．８８ ｍＭ、ＰＮＰは１．３
８ｕｎｉｔ／ｒｒ］７．％Ｘ ＯＤは１３．８ｕｎｉ
ｔ／ｒｎｌの濃度になるように三独試薬を混合して調製
した。溶解液Ｌｔ ０． Ｉ Ｍ トＩＪス緩衝液（ｐ
Ｈ７，３５）を用いた。ここでイノシン、ＰＮＰおよυ
ＸＯＤは市販されている試薬を用いることができる。
て用いた。緩衝液５ｏとして０．１Ｍトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７，３５）を用いた。無機リン定量段階で使用する基
質であるイノシンは、３．８８ ｍＭ、ＰＮＰは１．３
８ｕｎｉｔ／ｒｒ］７．％Ｘ ＯＤは１３．８ｕｎｉ
ｔ／ｒｎｌの濃度になるように三独試薬を混合して調製
した。溶解液Ｌｔ ０． Ｉ Ｍ トＩＪス緩衝液（ｐ
Ｈ７，３５）を用いた。ここでイノシン、ＰＮＰおよυ
ＸＯＤは市販されている試薬を用いることができる。
試料を注入口２２から反応セル室２０円に注入すると、
シリコンダイヤフラム２４により攪拌され、反応セル室
２０内で緩衝液により均一に士、１１釈される。かくし
て、試料中の尿酸は固定化ウリカーゼ膜４０と接触して
かつ酸化されてＨ２Ｏ，を発生し、これにより過酸化水
素電極１０の電流値は上昇して暫時定常状態に達する。
シリコンダイヤフラム２４により攪拌され、反応セル室
２０内で緩衝液により均一に士、１１釈される。かくし
て、試料中の尿酸は固定化ウリカーゼ膜４０と接触して
かつ酸化されてＨ２Ｏ，を発生し、これにより過酸化水
素電極１０の電流値は上昇して暫時定常状態に達する。
この時の′動；流増加分はｔ酸ｔｉ’、に比例するので
、その定量ができる。
、その定量ができる。
次に）−９１定娘度のイノシン、ＰＮ’ＰおよびＸＯＤ
から成る混合試薬溶液を注入口２２から注入すると、試
料中の無機リンが注入されたイノシン１、ＰＮＰおよび
ＸＯＤと反応し、反応セル室２０内に尿酸とＨ２Ｏ２を
発生し、固定化ウリカーゼ膜を被覆した過酸化水素電極
１０の電流値が再び増加する。一定時間後の増加世また
は増加率ζこより、無ｔｆｌ ＩＪン′ａ屁を定量する
ことができる。定量後は緩衝液５０により反応セル室２
０内を洗浄し、その廃液は液送ポンプ５４により廃液溜
め５６に送られる。洗浄により電流値が試料注入前の値
に戻ったら、再び新たに試料と混合試薬を逐次注入する
ことができ、かくして反覆連続測定を行うことができる
。試料および試薬の注入は、自動サンプラーを取り付け
れば自動曲に行うことも可能である。
から成る混合試薬溶液を注入口２２から注入すると、試
料中の無機リンが注入されたイノシン１、ＰＮＰおよび
ＸＯＤと反応し、反応セル室２０内に尿酸とＨ２Ｏ２を
発生し、固定化ウリカーゼ膜を被覆した過酸化水素電極
１０の電流値が再び増加する。一定時間後の増加世また
は増加率ζこより、無ｔｆｌ ＩＪン′ａ屁を定量する
ことができる。定量後は緩衝液５０により反応セル室２
０内を洗浄し、その廃液は液送ポンプ５４により廃液溜
め５６に送られる。洗浄により電流値が試料注入前の値
に戻ったら、再び新たに試料と混合試薬を逐次注入する
ことができ、かくして反覆連続測定を行うことができる
。試料および試薬の注入は、自動サンプラーを取り付け
れば自動曲に行うことも可能である。
実施例２
実施例１．により実際に尿酸と無機リンを同一反応セル
室内で連続して定量した場合の電流変化を第４図に示す
。尿酸８．２ｍ ｇ ／ｃ１ ｌ と無機リン４．７ｍ
ｇ ／ ｄ ｌを含む試料を２０μｌ注入すると（時
点１００）、電極電流値は急激に上昇し、約１５秒後に
定常状態に達した。３０秒後にイノシン、ＰＮＰおよび
ＸＯＤから成る混合試薬を２０μｌ注入すると（時点１
０２）、約１５秒後から反応電流の増加が再び観測され
、２０秒後（時点１０４）から直線的増加を示した。試
薬を注入してから３分波ζこ反応セル室２０内を緩衝液
５０で洗浄し始め（時点１０６）、３０秒後に電流は試
料注入前の値に戻った。
室内で連続して定量した場合の電流変化を第４図に示す
。尿酸８．２ｍ ｇ ／ｃ１ ｌ と無機リン４．７ｍ
ｇ ／ ｄ ｌを含む試料を２０μｌ注入すると（時
点１００）、電極電流値は急激に上昇し、約１５秒後に
定常状態に達した。３０秒後にイノシン、ＰＮＰおよび
ＸＯＤから成る混合試薬を２０μｌ注入すると（時点１
０２）、約１５秒後から反応電流の増加が再び観測され
、２０秒後（時点１０４）から直線的増加を示した。試
薬を注入してから３分波ζこ反応セル室２０内を緩衝液
５０で洗浄し始め（時点１０６）、３０秒後に電流は試
料注入前の値に戻った。
尿酸および無機リン標準液で予め検量線を作成するか或
いは装置を較正しておけば、第４図のΔ１１から尿酸を
、またΔ１２から無機リンをそれぞれ定量し、表示させ
ることができる。
いは装置を較正しておけば、第４図のΔ１１から尿酸を
、またΔ１２から無機リンをそれぞれ定量し、表示させ
ることができる。
上記方法により作成した尿酸の検量線を第５図に、無機
リンの検量線を第６図にそれぞれ示す。
リンの検量線を第６図にそれぞれ示す。
無機リン濃度２．５ ｍｇ／ｄ １以上では直線関係か
ら逸脱するが、１０ｍｇ／ｄ７まで再現性のよい濃度依
存性を示した。
ら逸脱するが、１０ｍｇ／ｄ７まで再現性のよい濃度依
存性を示した。
実施例３゜
実施例２で示した無機リンを定量する際の計測時間（時
点１０４〜１０６）を、４０秒、１分４０秒、２分４０
秒にそれぞれ設定し、無機リン濃度５ｍｇ／ｄｌの溶液
を用いて１０回の連続測定を行い、同時再現性を検討し
た。得られたＣ、Ｖ、値はそれぞれ２３５チ、１．４７
係、１．２６係と良好な結果であり、計測時間が４０秒
でも十分な精度が得られることがわかる。このことから
、試料注入後２〜３分間で尿酸と無機リン濃度の連続分
析が行なえることは明らかである。
点１０４〜１０６）を、４０秒、１分４０秒、２分４０
秒にそれぞれ設定し、無機リン濃度５ｍｇ／ｄｌの溶液
を用いて１０回の連続測定を行い、同時再現性を検討し
た。得られたＣ、Ｖ、値はそれぞれ２３５チ、１．４７
係、１．２６係と良好な結果であり、計測時間が４０秒
でも十分な精度が得られることがわかる。このことから
、試料注入後２〜３分間で尿酸と無機リン濃度の連続分
析が行なえることは明らかである。
実施例４
さらに全血試料を用いて連続１００回の測定を試みたが
、固定化ウリカーゼ膜の汚染に基づく出力の低下は認め
られず、“長期使用に耐え得ることがわかった。
、固定化ウリカーゼ膜の汚染に基づく出力の低下は認め
られず、“長期使用に耐え得ることがわかった。
実施例５゜
無機リン測定に及ぼす固定化ウリカーゼ膜の効果を検討
するためｌこ、実施例２に従い過酸化水素電極１０に固
定化ウリ、カーゼ膜４０を装着して測定した場合と、過
酸化水素電極１０に膜厚６μのアセチルセルロース膜を
装着して測定した場合の反応電流を測定した。標準過酸
′化水素水溶液（１２０ｐｐｍ）を用い、電極活性と膜
厚補正を行なった。得られる反応電流を比較し、固定化
ウリカーゼ膜を用いることによりアセチルセルロース膜
で得られる反応電流の２倍の値が得られ、生成した尿酸
とＨ２Ｏ２を測定していることにより精度の向上が図れ
ることがわかった。
するためｌこ、実施例２に従い過酸化水素電極１０に固
定化ウリ、カーゼ膜４０を装着して測定した場合と、過
酸化水素電極１０に膜厚６μのアセチルセルロース膜を
装着して測定した場合の反応電流を測定した。標準過酸
′化水素水溶液（１２０ｐｐｍ）を用い、電極活性と膜
厚補正を行なった。得られる反応電流を比較し、固定化
ウリカーゼ膜を用いることによりアセチルセルロース膜
で得られる反応電流の２倍の値が得られ、生成した尿酸
とＨ２Ｏ２を測定していることにより精度の向上が図れ
ることがわかった。
実施例６
実施例１の過酸化水素電極１０を用い、白金極３０に一
〇、６０Ｖを印加して酸素電極として作用させ、実施例
２に従って尿酸と無機リンを連続して定量した場合の還
元電流の変化を第７図に示す。
〇、６０Ｖを印加して酸素電極として作用させ、実施例
２に従って尿酸と無機リンを連続して定量した場合の還
元電流の変化を第７図に示す。
試料を２０μノ注入すると（時点２００）、電極電流は
急激に減少し、３０秒後に定常状態となる。
急激に減少し、３０秒後に定常状態となる。
３０秒後に混合試薬２０μｌを注入すると（時点２０２
）、約１５秒後から再び還元電流の減少が観測された。
）、約１５秒後から再び還元電流の減少が観測された。
このようにして実施例２と同様に、第７図中のΔ１１か
ら尿酸濃度を、Δ１２から無機リン濃度をそれぞれ分析
できる。
ら尿酸濃度を、Δ１２から無機リン濃度をそれぞれ分析
できる。
以上の説明かられかる様に、本発明によれば酵素電極法
による検出部を構成したため、同一反応セル内での尿酸
と無機リンの連続定分が可能となった。さらに無機リン
をイノシン、ＰＮＰ、ＸＯＤと反応させて酵素的に尿酸
と過酸化水素を生成させ、これを同定化ウリカーゼ膜を
被覆した過酸化水素電極あるいは酸素電極を介して定量
するようにしたため、反応電流の倍化をもたらし、その
結果反応時間の短縮が可能となり、かつ精度の向上を図
ることができた。又、固定化酵素膜を使用しているため
、長期の全血測定に対しても安定した出力が得られるよ
うになった。さらに酵素電極法により無機リンを定量す
るため、連続的に迅速・簡便に、かつ共存物質の影響を
受けずに、尿酸と無機リンの分析操作を行うことが可能
となった。
による検出部を構成したため、同一反応セル内での尿酸
と無機リンの連続定分が可能となった。さらに無機リン
をイノシン、ＰＮＰ、ＸＯＤと反応させて酵素的に尿酸
と過酸化水素を生成させ、これを同定化ウリカーゼ膜を
被覆した過酸化水素電極あるいは酸素電極を介して定量
するようにしたため、反応電流の倍化をもたらし、その
結果反応時間の短縮が可能となり、かつ精度の向上を図
ることができた。又、固定化酵素膜を使用しているため
、長期の全血測定に対しても安定した出力が得られるよ
うになった。さらに酵素電極法により無機リンを定量す
るため、連続的に迅速・簡便に、かつ共存物質の影響を
受けずに、尿酸と無機リンの分析操作を行うことが可能
となった。
第１図は本発明の方法に使用する装ａ♀の検出部の平面
図、第２図はポーラログラフ用過醒化水素電極の構造を
示す横断面図、第３図は本発明の方法を実施する尿酸お
よび無機リン分析装置の一系統図、第４図は過酸化水素
電極を用いた場合のポーラログラフ装置の出力、すなわ
ち本発明の定−ζν法の状態をかす線図、第５図は本発
明のポーラログラフ装置の出力と尿酸濃度の関係を示す
線区、第６図は本発明のポーラログラフ装置の出力と無
機リン濃度の関係を示す紗図、第７図は酸素電極を用い
た場合のポーラログラフ装置の出力、すなわち本発明の
定盆法の状態を示す線図である。 １０・過酸化水素′１Ｌ極、１８ 反応セル、２０・・
反応セル室、２２ 注入口、３０ ・白金極、３４ 電
極、４０ 固定化ウリカーゼ股、５゜緩衝液、５２−検
出部、５８ ポーラログラフ装置、６０ ・出力記録部
。 ′−゛ ８丁１ノ１．゛、τλ−１１ノロに；九、−ｍ−バー 第１ 図 ヤＺ閃 才３閃 θ ｌ ２ ３ ４ 糸［伍碕関 （今〕 才４（２） ０ ｔｏ ２０ 、 ３０ ４θ 屈蔽（笥Ｊ六ρ） オｊ 閃 ０ 、ｆ ｔＱ Ｕ魚摂°りン） ／ ｇｌ ／ｌｉ／ｌ ）才ろ 喝
図、第２図はポーラログラフ用過醒化水素電極の構造を
示す横断面図、第３図は本発明の方法を実施する尿酸お
よび無機リン分析装置の一系統図、第４図は過酸化水素
電極を用いた場合のポーラログラフ装置の出力、すなわ
ち本発明の定−ζν法の状態をかす線図、第５図は本発
明のポーラログラフ装置の出力と尿酸濃度の関係を示す
線区、第６図は本発明のポーラログラフ装置の出力と無
機リン濃度の関係を示す紗図、第７図は酸素電極を用い
た場合のポーラログラフ装置の出力、すなわち本発明の
定盆法の状態を示す線図である。 １０・過酸化水素′１Ｌ極、１８ 反応セル、２０・・
反応セル室、２２ 注入口、３０ ・白金極、３４ 電
極、４０ 固定化ウリカーゼ股、５゜緩衝液、５２−検
出部、５８ ポーラログラフ装置、６０ ・出力記録部
。 ′−゛ ８丁１ノ１．゛、τλ−１１ノロに；九、−ｍ−バー 第１ 図 ヤＺ閃 才３閃 θ ｌ ２ ３ ４ 糸［伍碕関 （今〕 才４（２） ０ ｔｏ ２０ 、 ３０ ４θ 屈蔽（笥Ｊ六ρ） オｊ 閃 ０ 、ｆ ｔＱ Ｕ魚摂°りン） ／ ｇｌ ／ｌｉ／ｌ ）才ろ 喝
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）試料中の尿酸と無機リンの定量法において、固定化
ウリカーゼ膜と過酸化水素電極からなる酵素電極を備え
、かつ緩衝溶液で満たされた反応セルに試料溶液を導入
し、前記酵素電極で試料中の尿酸濃度をポーラログラフ
的に測定し、次にブリンヌクレオシドホスフオリラーゼ
とイノシンとキサンチンオキシダーゼを含む混合溶液を
反応セル内に導入し、被検液と反応させ、逐次生成する
尿酸と過酸水素を前記酵素電極でポーラログラフ的に検
出し、間接的に無機リン濃度を定量することを特徴とす
る尿酸と無機リンの連続定量法。 ２）試料中の尿酸と無機リンの定量法において、固定化
ウリカーゼ膜と酸素電極からなる酵素電極を備え、かつ
緩衝溶液で満たされた反応セルに試料溶液を導入し、前
記酵素電極で試料中の尿酸濃度をポーラログラフ的に測
定し、次にプリンヌクオンドホスフオリラーゼとイノシ
ンとキサンチンオキシダーゼを含む混合溶液を反応セル
内に導入し、被検液と反応させ、逐次生成する尿酸と溶
存酵素の減少量を前記酵素電極でポーラログラフ的に検
出し、間接的に無機リン濃度を定量することを特徴とす
る尿酸と無機リンの連続定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59008794A JPS60152947A (ja) | 1984-01-20 | 1984-01-20 | 尿酸と無機リンの連続定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59008794A JPS60152947A (ja) | 1984-01-20 | 1984-01-20 | 尿酸と無機リンの連続定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60152947A true JPS60152947A (ja) | 1985-08-12 |
Family
ID=11702770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59008794A Pending JPS60152947A (ja) | 1984-01-20 | 1984-01-20 | 尿酸と無機リンの連続定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60152947A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5288613A (en) * | 1988-02-17 | 1994-02-22 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The National Research Council Of Canada | Enzyme-based biosensor system for monitoring the freshness of fish |
-
1984
- 1984-01-20 JP JP59008794A patent/JPS60152947A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5288613A (en) * | 1988-02-17 | 1994-02-22 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The National Research Council Of Canada | Enzyme-based biosensor system for monitoring the freshness of fish |
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