JPS60153799A - β−ラクタム抗生物質の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物質’ｋ　ｉｌｉｌｌ定する方法に関するものである
。

従来のバイオアッセイは試験菌が感受性であるところの
あらゆる抗生物質に対して使用できるが、β−ラクタム
抗生物質についてはバイオアッセイに適する感受性菌は
知られていなかった。

本発明はβ−ラクタム抗生物質をパイオア，セイで測定
する方法を開発するべくなされたものであり、プロテウ
ス属に属する微生物を変異処理することによってβ−ラ
クタム抗生物質に対する感受性が特異的に増加した新規
な微生物の取得に成功したことに基いている。

すなわち本発明は、プロテウス属に属し測定対象のβ−
ラクタム抗生物質に対して感受性を有する微生物を、試
料を含有する培地に培養することを特徴とするβ−ラク
タム抗生物質の測定方法に関するものである。

本発明の方法に用いる微生物はゾロテラス属に属し測定
対象のβ−ラクタム抗生物質に対して感受１’ｌ有する
ものである。

β−ラクタム抗生物質とは抗菌活性を有し、その構造中
にβーラクタム頃を有する化合物であって、例エばにニ
シリ７Ｇ，アンピシリン、カルベニ７リン、６−アミノ
４，＝シラン酸、セファロチン、セファＶキンンなどで
ある。本発明の方法に用いる微生物は測定対象のβ−ラ
クタム抗生物質に対して感受性を有していればよく、従
って測定目的に応じーのβ−ラクタム抗生物質に対して
感受性を有している場合もあり、二以上のβ−ラクタム
抗生物質に対して感受性を崩している場合もある。

このような微生物はゾロテラス属に属する微生物を公知
の変異処理、例えば紫外線、Ｘ線、γ線などの照射ある
いはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロングアニジ
ン（以下、ＮＴＧと略記する。）などの突然変異誘起剤
などで処理した後に選択培地に生育させて測定対象のβ
−ラクタム抗生物質に対する感受性を測定し、親株より
も感受性が増加している株を選択することによって得る
ことができる。このような微生物の例として、プロテウ
ス・ブルガリスＩＦ０．３１６７を紫外線処理疎びＮＴ
Ｇ処理して得られたプロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔ
ｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｊｓ　）　ＭＭ３−２０微工研菌
寄第７３５８号を挙げることができる。

次に、プロテウス・ブルガリスＭＭ３−２ＯＦＦＪＲＭ
Ｐ−７３５８の菌学的性質を示す。

（、）　形態 グラム陰性桿菌で、細胞の大きさは０．５〜１０×１．
０〜２０ミクロンである。多形性は示さない。

運動性があり、鞭毛は周毛性であるが劣化しやすい。胞
子を形成しない。

（ｂ）　各種培地における生育状態 ■　肉汁寒天平板培養 、　コロニーは円板状で、全綴、軟質であり、表面は光
沢がある。色荒は産生じない。コロニーの大きさは直径
１．０〜１．５　ｔａｎである。

■　肉汁寒天斜面培養 縁状に良好に生育し、軟質である。表面は光沢がある。

凝縮水でも良く生育する。

■　肉汁液体培養 適度に生育し、混濁する。沈渣を生ずる。被膜を形成し
ない。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養 表面及び高層部分でよく生育し、液化する。

沈渣を生ずる。

（ｃ）　生理学的性質 ■　ＭＲテスト　−　陽性 ■　ｖｐテスト　′　陰性 ■　インドールの生成　陽性 ■　硫化水素の生成　７日目で若干産生ずる。

■　クエン酸の利用　’Ｋｏｓｅｒ培地、Ｃｈｒｉｓｔ
ｅｎｓｅｎ培地とも陽性 ■　ウレアーゼ　陽性 ■　オキシダーゼ　陰性 ■　カタラーゼ　陽性 ■　酸系に対する態度　通性嫌気性 ■　Ｏ−Ｆテスト　醗酵的 ■　糖類から酸の生成 り−グルコース、グリセリン、ザリシン、マルトース、
シュクロース及びＤ−キシロースから酸を生成する。ア
ドニトール、Ｌ−アラビノース、ズルシトール、イノジ
ット、乳糖、Ｄ−マンニット及びラムノースからは酸を
生成しない。

■　糖類からガスの生成 り−グルコースからガスを生成する。

０　糖の利用性 シュクロース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンノース、マ
ルトース、Ｄ−グルコース、乳糖、ザリシン、Ｄ−キシ
ロース及びＬ−アラビノースを利用する。Ｄ−マンニッ
ト、イノジット、ズルシトール及びラフィノースを利用
しない。

■　各種抗生物質に対する感受性 本部及び親株ＩＦＯ３１６７について下記の抗生物質の
最小発育阻止（＾度を測定した結果を第１ペニシリンＧ
　Ｏ，３９）４００ アンピシリン　０．３９　）４００ カルベニシリン　０．７８　）４００ ６−アミツベニシラン酸　２５　＞４００セフアロチン
　０．３９　）４００ セフアレキシン　１．５６　１００ ０−サイクロセリン　２００　２００ ７オスフオマイシン　１２．５　１２．５ノボビオシン
　２５　１２．５ バシトラシン　＞４００　＞４００ １ポリミキシ：／Ｂ　＞１００　＞１００グンタマイン
ン　１，５６　１．５６ カナマイ７ン　３１２　３１２ ストレゾトマイシン　６．２５　−　３．１２ネオマイ
シン　６．．２５　６．２５ クロルテトラサイクリン　１，５６　１．５６クロラム
フエニコール　１．５６　１．５６エリスロマイシン　
５０　１０’０ これらの性質を親株と比較すると、抗生物−質の最小発
育阻止濃度が相違する点並びに、本部の硫化水素の産生
能及びラフィノースの利用能力が弱い点において親株と
相違するが、その他の性質が親株と同じであるところか
ら本部はやはりプロテウス・ブルガリスに分類されるべ
きである。しかしながら、本部は上記の抗生物質に対す
る感受性において示される通シ、β−ラクタム抗生物質
以外の抗生物質に対する感受性は親株とほとんど変って
いないが、β−ラクタム抗生物質に対する感受性が著し
く増加している。このようにβ−ラクタム抗生物質に対
して高い感受性を有する微生物はシュードモナス属（龍
野ら、シャーナル・オブ・ファーメンテ−ジョン・テク
ノロジー、５４巻、６９６頁１９７６年）、エッシェリ
ヒア属（青水ら、ザ・ジャパニーズ・ジャーナル・オブ
・アンチバイオティクス、３０巻補追、Ｓ−２０７頁、
１９７７年）などで報告されているが、ゾロテラス属に
は見当らないところから本部は明らかに新規な微生物で
ある。

培養方法は公知のプロテウス属菌の場合と同様でよく、
炭素源としてはグルコース、シュクロース、フラクトニ
スのような本部が資化し得る化合物であればいかなるも
のでもよい。窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウムのような無機窒素や、ベ
ノトン、酵母エキス、肉エキスのような有機窒素を適宜
組合せて使用すればよい。無機塩は塩化ナトＩＪウム、
塩化カリウム、リン酸−カリウム、リン酸二カリウム、
硫酸マグネシウム等を使用できる。培養は静置培養ある
いは振盪培養でよく、培養温度は２５−Ｌ３０℃が好ま
しい。本部は凍結法や凍結乾燥法等の通常微生物の保存
に用いられる方法で保存できる。

β−ラクタム抗生物質の測定方法としては、要は測定対
象のβ−ラクタム抗生物質に対して感受性を有する微生
物を試料を含有する培地に培養して生育状態を測定すれ
ばよいのであるが、例えば前記のプロテウス・ブルガリ
スＭＭ３−２０　ＦＦ！ＲＭＰ−７３５８を接種した検
定平板（寒天培地）を調製し、この上に測定試料をしみ
込ませたに−１４−ディスクを置いて所定時間培養し生
じた生育阻止帯の直径を測定すればよい。４−ノや一デ
ィスクを用いるかわりに検定平板にウェルを穿ち、この
ウェル内に試料溶液を入れて所定時間培養して生じた生
育阻止帯の直径を測定してもよい。そのほか、液体培養
して培養液の比濁を測定してもよい。いずれの方法にお
いても、予め既知濃度のものを用いて測定して得た検１
線と比較することによって濃度を決定することができる
。スクリーニングなどの場合には、前記のＭＭ３−２０
菌の親株であるプロテウス・ブルガリス１ＦＯ３１６７
を接種した検定平板（寒天培地）も併せて調製しておき
、試料をＭＭ３−２０菌と１ＦＯ３１６７菌の２つの平
板に加えてそれぞれ培養し、両者の生育阻止帯の直径を
比較することによって試料中のβ−ラクタム抗生物質の
存在を知ることもできる。

本発明の方法はβ−ラクタム抗生物質を簡便な手段で高
感度かつ特異的に測定できるものである。

以下、実施例を示す。

実施例１ プロテウス・プルがリスＩＦＯ３１６７を５　ｍｌの普
通ブイヨンを入れた試験管に接種し、３７℃１．夜装置
培養した。この培養液を滅菌生理食塩水で１０倍に希釈
し、そ（Ｄ　５　ｍｌを’／ヤーレ（ｉｉｉｆ径９ｃｒ
ｎ）に入れて、１５ワツトの殺菌ランプを４０　ｃｍの
高さから４０秒間、シャーレを回しながら照射した。

この処理液を適当に希釈し、’０．１　ｍｌを普通寒天
平板に塗抹して、３７℃で１夜培養した。生じたコロニ
ーを１００μｍ１／ｍｌのセファロチンを含有する普通
寒天平板と含有しない平板にレゾリカ法により接種し、
３７℃で１夜培養後、前者の平板で増殖せず後者で増殖
するコロ＝−を連数して旧４２−３５株を得た。次にこ
のＭ１４２−３５株を普通ブイヨン５　ｍｌで培養し、
遠心集菌後、この菌体を１００ｔｄ／／ｍｌのＮＴＧを
含む５　ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＩ−１６，０
）Ｉｃ懸濁させて３７℃ｆ３０分間処理シた。遠心によ
り集菌し、ＮＴＧを含有しない同緩衝液で洗浄後、新し
い普通ブイヨンに懸濁させて３７℃で３時間培養した。

適当に希釈して０．１　ｍｅを普通寒天平板に塗抹し、
３７℃１夜培養した。

生じたコロニーについてｌμＩ／／ｍｌのセファロチン
を含有する平板上での増殖の可否を調べ、増殖できない
コロニーを選択してＭＭ３−２０株（ＦｇＲＭＰ−７３
５８）を得た。

次に、普通ブイヨン５　ｍｌを入れた試験管を１２１℃
で２０分間滅菌し、Ｍ’Ｍ３−２０株（ＦＥＢＭＰ−７
３５８）をよく生育した斜面培地より１白金耳を接種し
て、３７℃で１夜培養し、これを種培養液とした。この
種培養液５　ｍｌをあらかじめ滅菌し、４５〜５０℃に
保温しておいた２００ゴの普通寒天培地に接種した。よ
く混合した後、１０ｍ１ずつシャーレ（直径９ｃｒｎ）
に分注し、室温に放置して固化させた。この寒天平板を
滅菌したコルクポーラ−等を用いて穿穴してアガーウェ
ルを作製し、検定平板とした。

セファロチンの既知濃度１．５．１０．１５゜２０　、
３０　、４０　、５０　、６０　、７０　、、、１００
μｊｉ／ｍｌの標準溶液を作製し、各標準溶液１５０μ
ｔを検定平板のアガーウェルに入れて３７℃で１夜培養
後、生じた生育阻止帯の直径を測楚した。得られた結果
を「日本抗生物質医薬品基準解説」（厚生省薬務局監修
、１９７４年）に記載の・漂準曲線法に基いてまとめ作
製したセファロチンの標準曲線を図面に示した。

実施例２ ゾロテラス・ブルガリスＭ　Ｍ　３−２０　（ＦＥＲＭ
Ｐ−７３５８）及びその親株（ＩＦＯ３１６７）につい
て実施例１と同様にして検定平板を作製した。

この各検定平板に第２表に示す各抗生物質をしみ込ませ
た直径８論のｄ−／４’−ディスクを置き、３７℃で１
夜培養後生じた生育阻止帯の直径を測定したところ第２
表に示すような結果が得られた。

第２表 セファロチン　１０　２０．３　０ アンピシリン　１０　１８．８　０ カナマイシン　２０　１４．０　１４．２

【図面の簡単な説明】

図面はゾロテラス・ブルガリスＭＭ３−２０を用いて得
られたセファロチンの標準曲線の一例を示すものである
。 特許出願人　富士レビオ株式会社 代理人弁理士　１）　中　政　浩

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. プロテウス属に属し測定対象のβ−ラクタム抗生物質に
   対して感受性を有する微生物を、試料を含有する培地に
   培養することを特徴とするβ−ラクタム抗生物質の測定
   方法