JPS60155973A - 生化学的処理用シ−ト、その製造方法及び使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は生化学的処理と関連して使用する物質で調整さ
れたシートに関し、更に詳しくは特定物質がシート材料
に特異的に接着するようにした１分離技術の一部として
使用されるような調整シートに関する。本発明は更に調
整シートの製造法、及び生化学的処理の一部としてこの
シートを使用する方法に関する。

従来の技術 大抵の生物学的に重要な物質は特定配位子に対して＾い
親和力を示す。本明細書において配位子とは他の分子を
認めうる（　ｒｅｃｏｇｎ　ｉ　ｚｅ　）化合物と定義
しうる。配位子は、酵素−基質反応の基質；より複雑な
複写及び実施方法における酵素型板；繊維特異性を有す
る生体分子の活性部位、即ち神経細胞のための阿片剤；
核酸の場合における補完的連鎖；或いは抗原の場合にお
ける抗体を含む。ある場合には高い親和力は例えばポリ
−へ末端成熟殻ＩＩＩ　ＲＮＡに対するある種の核質蛋
白質及び細胞質蛋白質の特異結合におりるような明瞭な
機能にリンクされるものではない。このような親和力は
、例えばアガロース柱への抗原の不動化による抗体の分
離（親和力クロマトグラフィー）の多糖類の細工に基質
を不動化することによる酵素の分離、セルローズ柱上へ
のオリゴｄＴ或いはオリゴＵの不動化によるポリ−へ富
化ＲＮＡの精製等における補充分子の存在に使用される
。このような方法は、　ｉこのような相補性の存在の確
認のためには認められているが、基質の分離のためには
許容されるものでなかった。この分離は、別に、長くし
ばしば厄介な方法により実施しな番プればならなかった
。公知方法もまた多数の標本の迅速な選別を許容するも
のでない。なぜなら例えば親和ツノクロマトグラフィに
おける個々の標本は別々６′コラム上で分析し、溶出さ
せ、このようにして後に始めて更に処理されるものであ
るからである。

公知方法における別の問題は、混合物中における二つ以
上の成分が活性配位子である時、例えば所定抗原に対す
る多数の免疫グロブリン属における場合、コラムに留ま
る免疫グロブリンの混合物及び別々の素子の実際の分析
は、夫々の標本について別々の実験により行わなければ
ならない。

また、単分校抗体分離の場合において何百もの細胞株を
選別しなければならない時にはこの方法は厄介であり費
用がかさばる。

薬品中の分野、例えば神経細胞ロシの摂受体を有する薬
品においては、素子の数により、作業は極めて困難なも
のとなる。従って活性物質及び摂受体を探すために必要
な技術は、ゲル電気泳動を含む一連の長々しい分離処理
のみによって決定されるのである。

公知技術が煩雑ｒこみいった性質であることに観み、関
連する物質を分離し生物学的に純化するばかりでなく同
定すると同時に特異相互作用に使用できるような技術に
対づる強い要望があった。

公知技術においてはまさにこの問題に強い関心が払われ
ている。ケミカルアブストラクト９０：１８４４４ｒは
、１３ｒａｏｉｏｎｉ　ホかによる論文”　Ｄ　Ｎ　Ａ
セルロースの新しい調整方法″、Ａ　ｐａｌ　３１ｏｃ
ｈｅｉ、　１９７８年刊、８９　（２＞６１６−１９ペ
ージ、の抜粋であり、これは、塩化シアヌール酸（Ｉ＞
により活性化されたセルローズの使用を開示している。

この抜粋は、ＤＮＡの相当量が処理されるセルローズに
結合されることを述べている。この方法は満足のゆくも
のではない。なぜなら分離される材料が使用できる前に
引き続き溶出工程が必要であるからである。

従って興味を引く該当物質の所在をつきとめるのみなら
ずこれを自動的に分離し後の処理のために使用可能状態
になしうるような技術が開発されるならば有利である。

発明が解決しようとする問題点 かくして本発明の一つの目的は、対象となる生物学的物
質を、後の処理のために容易に利用できるような形で分
離するために使用できる方法及び物質を提供することで
ある。

問題点を解決するための手段 この目的及びその他の目的は、本発明によれば、配位子
及びシート物質との間に共有結合を行わせる化合物によ
り調整された前記シートを提供することにより解決され
る。この目的のために好ましい化合物は塩化シアヌール
！ＩｌＩ′ｃあるが、アミノチオフェノールのような他
の物質も同様に使用できる。このシートの著しい特徴は
、シートを活性化させるため塩化シアヌール酸或いはそ
の他の化合物により処理されたシート体であることであ
る。セルローズの塩化シアヌール酸処理自体は知られて
いる【プれども、このような処理物は従来常にコラムに
詰められたセルロース粉末の形で行われていた。このよ
うな方法は既に述べたような難点を有する。従って本発
明の物質がシート体をなしているという事実は特に興味
をひくものである。

もちろん本発明は更に、調整されたシート体物質を配位
子と結合させるためにこのシート体物質を使用する方法
にもかかわる。この方法においては、配位子をシートに
共有結合させる塩化シアヌール酸或いはその他で処理し
た後、シートを配位子を含有する物質と接触させるよう
にする。この方法を用いて配位子はシート体物質に着合
し、ひきつづく使用のために保持される。

同様にして本発明は、配位子をシートに共有結合させ、
次にこのシートを乾燥させうる塩化シアヌール酸その他
の化合物の溶液に接触さけることにより、シート調整を
行なうことを含むシート製造法にも及ぶ。

シー１−それ自体はセルローズ性か或いはプラスチック
物質からなり、本発明の著しい特徴は塩化シアヌール酸
と反応性のある遊離水酸基をシートが含むことである。

セルローズ性ペーパーが使用される場合、シートはフィ
ルター或いは吸取ペーパーの形であってよい。

配位子は、塩化シアヌール酸その他の物質によりシート
に共有結合される。塩化シアヌール酸に共有結合され物
質は蛋白質、ポリヌクレオチド、ポリサッカライド、グ
リコプロティン。

リボプロティン、カルシノーゲン或いは生物学的に関連
のある摂受体を有する化合物からなる群から選ばれるも
のであってよい。このような摂受体を有する化合物はま
た中枢神経系に影響を及ぼすことのできる物質も含む。

中枢神経系に影響を及ぼすことのできる物質は阿片剤を
含む。

調整されたシートは、例えば同定される物質を含む液と
このシートを接触させることにより使用される。或いは
該当物質はゲルの形、例えば電気泳動において普通使用
されるような寒天ゲル中に存在するようにしてもよい。

ペーパーシート体をゲル上に配置させることにより、該
当物質はシートの共有結合配位子に着合する。

液から作用を受けると、シートはフィルター或いは吸い
取り紙の形になり、シートを毛細管作用で液が移動する
一方該当物質はシートに固着し以后の処理可能な状態と
なる。

本発明の別の実施態様によればシートはそれ自体、配位
子が存在する別のシートに適用することができる。

作用 本発明はシート製品及びシートを生成、使用して生物学
的に重要な分子をとりあげ、分離し、更に可能な場合は
単離する方法を提供するものである。このようなシート
はゲルの電気泳動或いはりＯマドラ９フ４分離と組合せ
た場合に特定の用途が見出される。本発明シートは均質
である平板でち密な表面を有し、セルローズ性もしくは
プラスチック材料から形成される。興味を引く該当物質
が特異的にこのシートに結合され、次に放射線写真、酵
素免疫分析或いは特定されたスティン技術により検出す
ることができる。

好ましい実施態様においては、アミノ基及び多糖類のい
くつかの水酸基と反応するジクロロトリアジニルセルロ
ーズを生成するため従来多糖類を使用したような態様で
（Ａ　ｎｕａｌ　３　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　６１−
３９２．１９７４年刊参照）、本発明においては塩化シ
アヌール酸と反応させることによりセルローズもしくは
グラスチックシートを先ず活性化させてシートを生成す
る。

遊離アミノ基或いは反応性水酸基を有する配位子分子、
或いはこのような基を有する配位子と結合する分子は、
シートの表面に均質に結合することができる。完全にか
つ均質に被覆された平板な表面は次にプロット（吸取）
材料として使用し、遊離拡散或いは電気泳動的な動きに
よりゲル或いは薄層から或いはペーパークロマトグラフ
ィ装置から分離された成分を吸い取るようにする。シー
トの平板面は、特異性抗体の存在を検査するためマイク
ロプレート　ウェル、のスクリーン処理のためにも使用
することができる。

シート或いは基体はセルローズ性のものであってよく、
また塩基性条件下で塩化シアヌール酸と反応することの
できる従来型のフィルタペーパー或いは天然もしくは合
成シートであってもよい。

前述の如く塩化シアヌール酸は好ましい材料であるけれ
ども、配位子と共有結合する他の材料も使用することが
でき、これらは本発明の範囲に属することは明らかであ
る。

シアヌール酸塩が使用される時はシートを３ＭのＮａ　
ＯＨ或いはＫＯＨに浸漬する。過剰の塩を洗浄した後１
：１ジオキサン：キシレンに５−１０％の塩化シアヌー
ル酸を溶かした溶液を添加して、塩化シアヌール酸とペ
ーパーとの重量比がほぼ１：１になるようにする。撹拌
俵シートを有機溶媒で洗浄し、酢酸ニジオキサン：水（
１：２：１ｗ／ｗ／ｗ）ですすぐ。シートを次にアセト
ンで洗浄し真空乾燥する。適当な温度で定常的な撹拌下
に最適な結合をするのに十ゝ分な時間にわたって、シー
トをこの配位子溶液と接触させる。配位子が一旦結合さ
れると、シート上のなお活性であるＣｊ基は遊離アミノ
基に富む緩衝液の使用により不活性化される。シートは
次に乾燥されそして使用可能状態となる。

実施例１ ニューカッスルビールスの粗標本からの特定抗体の同定
。

２ｇの重量を有するベーパー（１５Ｘ１５ｃｍ）のシー
トを３０−４５分間３ＭのＮａ　ＯＨ中に浸漬した。過
剰液を排出させた後シートを、１：１ジオキサン：キシ
レン混合液３５１１中に塩化シアヌール酸２ｇを溶かし
た溶液を収容するトラフ中に室温で２時間、ゆっくり撹
拌しつつ浸漬したゎ過剰溶液を除去しシートを１００ｉ
ｊのジオキサン、ジオキサン、酢酸／ジオキサン／水１
　：２：１　（ｗ／ｗ／ｗ）、アセトン、アセトン、及
びトリーグリシン０．ＩＭをそれぞれ含む溶液中に１５
分間ずつ通過さゼた。

このシートを真空乾燥し、非緩衝塩類を含み粗抗ニュー
カッスル抗血清を１：１０の割合で含む２０１！を収容
したトラフ中に置き、−晩反応づるにまかせた。シート
を次に乾燥し使用可能な状態としｌｃ０ニューカッスル
ビールス粒体の粗標本を、当業者にはよく知られた多糖
類ゲル電気泳動法により処理する。蛋白質分離及び再天
然化の後、ゲルをシート上への電気泳動的移動のために
使用する。ゲルと接触した後、シートを食塩溶液で強く
洗浄し、抗血清ニューカッスル活性に対応する抗原的活
性を有する蛋白質のみがシートになお結合しているよう
にする。

この標本を採取し、同定されるビールス蛋白質及び抗原
をスティン処理したゲルと比較する。

実施例２ ポリ八結合蛋白質の同定及び精製 シートを例１のように調整したがその活性化ペーパーを
ポリ−△の０．ＩＷＩＧ＋／ν！溶液に浸漬した。準備
が整うと、シート上の残る活性位置を室温で一時間０．
１Ｍのトリーグリシンによりブロック処理した。核蛋白
質混合物のゲル電気泳動を行ない、例１のようにシート
上への電気泳動的移動を行うように使用した。ポリー八
結合蛋白質が同定され、シートを結合位置で切断した。

２Ｍ塩緩衝液に浸漬した後、シート上のポリＡに結合さ
れるポリＡ結合蛋白質をシートが遊離した。

実施例３ ＳＶ４０連鎖の同定 ＳＶ４０に対する特異親和力を有する連鎖を含むＰＢＲ
３２２からなるプラスミドを生長させ、分離し、実施例
２のようにシートに結合させた。

ＳＶ４０因子の疑似担体である細胞をあらかじめアイソ
トープ標識をつけた後ＤＮＡ或いはＲＮＡ分離のため処
理した。ＤＮＡ或いはＲＮＡ抽出物のいずれかは、巨大
分子の完全な除蛋白の後ポリアクリルアミドのゲル上に
流した。

シートを次にゲル上で吸い取ら往、交雑層ＳＶ４０連鎖
と相補的な連鎖のみ平板面に残った。

この連鎖は放射線標識により同定された。

本発明は特定の物質、組成物及び例と関連しつつ説明し
たけれども、開示された特定内容にのみ限定されるもの
ではなく、特許請求の範囲を逸脱しない限りにおいてす
べての均等物にも及ぶものであることが理解されるべき
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）塩化シアヌール酸により調整されたシート。 （２）前記シートがセルロース性である特許請求の範囲
   第１項記載のシート。 （３）前記シートがプラスチック物質からなる特許請求
   の範囲第１項記載のシート。 （４）配位子が結合している特許請求の範囲第２項もし
   くは３項記載のシート。 （５）前記配位子が前記塩化シアヌール酸調整シートに
   共有結合している特許請求の範囲第４項記載のシート。 （６）前記配位子が蛋白質、ポリヌクレオヂド。 ポリサッカライド、グリコプロティン、リポプロティン
   、カルシノーケン。或いは生物学的に関連のある摂受体
   を有（る化合物からなる群から選ばれている特許請求の
   範囲第５項記載のシート。 （７）生物学的に関連する摂受体を有する前記化合物は
   、中枢神経系に影響を及ぼしうる物質の群から選ばれる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第６項記載のシート。 （８）中枢神経系に影響を及ぼしうる物質が阿片剤であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第７項記載のシート
   。 （９）前記シートが、前記塩化シアヌール酸と反応性の
   ある遊離水酸基を含むことを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載のシート。 （１０）前記シートはフィルタペーパーである特許請求
   の範囲第１項記載のシート。 （１１）前記シートは吸取ベーパーである特許請求の範
   囲第１項記載のシート。 （１２）塩化シアヌール酸で調整し該当物質の配位子を
   結合させたシートを前記該当物質と接触させ、該当物−
   質を前記調整シートに肴合さ旭ることを含んでなる該当
   物質の結合方法。 （１３）前記シートがセルロース性である特許請求の範
   囲第１２項記載の方法。 （１４）前記シートがプラスチック材料からなることを
   特徴とする特許請求の範囲第１２項記載の方法。 （１’）ｌ）前記−１１１位子が蛋白質、ポリヌクレオ
   チド。 ポリサッカライド、グリコプロティン、リボプロティン
   、カルシノーゲン或いは生物学的に関連ある摂受体を有
   する化合物からなる群から選ばれたものであることを特
   徴とする特許請求の範囲第１３もしくは１４項に記載の
   方法。 （１６）前記配位子が、中枢神経系に影響を及ぼしうる
   物質からなることを特徴とする特許請求の範囲第１５項
   記載の方法。 （１１）中枢神経系に影響を及ぼしうる前記物質が阿片
   剤であることを特徴とする特許請求の範囲第１６項記載
   の方法。 （１８）前記シートは、前記塩化シアヌール酸と反応性
   のある遊離水酸基を含んでいることを特徴とする特許請
   求の範囲第１２項記載の方法。 （１９）前記シートがフィルタペーパーであることを特
   徴とする特許請求の範囲第１２項記載の方法。 （２０）前記シートが吸取ペーパーであることを特徴と
   する特許請求の範囲第１２項記載の方法。 （２１）該当物質がゲル状である時にはシートを該当物
   質と接触させることを含んでなり、この際前記シートを
   前記ゲルと接触さぼることを含む特許請求の範囲第１２
   項記載の方法。 り２２〉前記該当物質が別のシート上にある時にはシー
   トを該当物質に接触させることを含んでなり、この際前
   記シートを前記別のペーパーと接触させることを含む特
   許請求の範囲第１２項記載の方法。 （２３）調整物質シートの製造方法であって：イ）前記
   物質シートを塩化シアヌール酸の水溶液と接触させるこ
   とにより前記物質シー１へを調整し；そして、 口）前記物質シートを乾燥させる段階を含んでなる方法
   。 （２４）配合紙を段階口）の前記シートに結合させるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第２３項記載の方法。 （２５）前記シートがセルローズ性であることを特徴と
   する特許請求の範囲第２４項記載の方法。 （２６）前記シートがプラスチックであることを特徴と
   する特許請求の範囲第２４項記載の方法。 り２７〉前記シートはフィルタペーパーで蕊ることを特
   徴とする特許請求の範囲第２４項記載の方法。 （２８）前記配位子が蛋白質、ポリヌクレオチド。 ポリサッカライド、グリコプロティン、リポプロティン
   、カルシノーゲン、或いは生物学的に関連のある摂受体
   を有する化合物からなる群のうちから選ばれることを特
   徴とする特許請求の範囲第２４項記載の方法。 （２９）生物学的に関連のある摂受体を有する化合物が
   中枢神経系に影響を与えることのできる物質の群から選
   ばれることを特徴とする特許請求の範囲第２８項記載の
   方法。 （３０）前記中枢神経系に影響を与えることの群が阿片
   剤であることを特徴とする特許請求の範囲第２９項記載
   の方法。 （３１）前記シートは、塩化シアヌール酸と反応性のあ
   る遊離水ｉ！基を有することを特徴とする特許請求の範
   囲第２３項記載の方法。 ＜３２）前記シートがフィルタペーパーであることを特
   徴とする特許請求の範囲第２３項記載の方法。 （３３）前記シートが吸取ペーパーであることを特徴と
   する特許請求の範囲第２３項記載の方法。 （３４）配位子と共有結合しうる化合物により調整され
   てなるシート。 （３５）該当物質をシートに結合さ迂る方法であって； イ）配位子を前記シートに共有結合させることのできる
   組成物にシートを接触させ； 口）前記シートを配位子溶液と接触させることにより、
   配位子をシートに結合させ； ハ）配位子を結合した前記シートを該当物質と接触させ
   てこれをシートに結合さける段階を含んでなる方法。 （３６）シートの調整方法であって： イ）配合子をシートに共有結合させることのできる組成
   物溶液を前記シートに接触させることにより前記シート
   を調整し； 口）前記シートを乾燥させる段階を含んでなる方法。