JPS60156384A - トレポネ−マに対して向けられたモノクロ−ナル抗体を産生するハイブリツド細胞系統及びそのトレポネ−マ感染症の免疫診断用用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、トレポネーマ決定因子に対して特異性を有す
るモノクローナル抗体を産生するノ・イブリドーマに関
する。より具体的には、本発明は、ハイブリドーマ及び
それから産生される、病原性トレポネーマ種に共通な決
定因子に対して交差反応特異性を有するモノクローナル
抗体及びそれらの診断アッセイにおける用途に関する。

トレポネーマ症は、重要な全世界的な人の健康の問題で
ある。三種のトレポネーマによりひき起こされる四つの
明確且つ臨床的に非類似の病気が存在する。梅毒トレポ
ネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉ　−ｄｕｍ　
）は性病の梅毒並びに非性病の風土病梅毒（ｂｅｊｅｌ
　）の病因である病原体である。フランペジアトレポネ
ーマ（Ｔ、ｐｅｒｔｅｎｕｅ　）は７ランベジアの病原
体であり、ピンタトレポネーマ（Ｔ、ｃａｒａｔｅｕｍ
）はピンクの原因となるものである。臨床的な症候は明
確であるが、原因となる病原体間の生物学的相違点は未
だかつて一切に説明されたことはない。

性的に伝染される梅毒とは対照的に７ランペジア及びピ
ンクは緊密な人の接触により伝染されるようである。こ
の伝染は皮膚或いは粘膜の擦過傷が、参み出る病巣から
流出するトレポネーマの侵入を許容する条件下に起こる
。最近まで、病原性トレポネーマのいずれもｉｎ　ｖｌ
ｔｒｏで培養されたことはなかった。しかしながら、梅
毒トレポネーマ及びフランベジアトレポネーマは通常ウ
サギ内に継代培養されている。ビンタトレポネーマは、
シカシながら、ウサギ内では継代培養することができな
い。感染ウサギ組織からこれらのスピロヘータ類を単離
した際に、それらは相互に余りにも近似しているために
、形態学的或いは血清学的のいずれによっても区別する
ことができない。蛍光抗体及びトレポネーマ固定試験は
フランベジア血清或いは梅毒血清が梅毒トレポネーマ或
いはフランペジアトレポネーマのいずれに対して反応さ
れた際にも何等の相違も示さない。しかしながら、病巣
のタイプ及び亀丸炎の発生に必要とされる期間は、これ
らの二つの微生物に対して異るものである。

梅毒トレポネーマは亀丸内感染ウサギ中に本丸炎を確立
するために８〜１２日を必要とするのに対し、フランベ
ジアトレポネーマは２６〜３０日間必要とする。

血清学的試験がこれらのトレポネーマ類間の区別をする
ことができなかったので、生化学的研究が行われた。梅
毒トレポネーマ及びフランベジアトレＩネーマからのＤ
ＮＡがＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド化のＣｏｔ分析によ
り調べられたところ、それらは遺伝子的に区別不可能で
あることが判明した。

従って、二つの明確な病気を提示する臨床データとこれ
らの微生物が実質的に区別不可能であることを示す生化
学的データの間には一貫性が存在しない。本発明は、抗
原性ペプチド類及び病原性トレヂネーマ釉に共通の固有
及び表面−標識化蛋白質プロフィールを対比するメカニ
ズムを提供するものである。

従って、病原性トレポネーマ抗原に対するハイブリッド
細胞系統及びモノクローナル抗体を提供することは極め
て望ましいことである。その様な抗体は、ヒトにおける
トレポネーマ病の鑑別診断、引続（ワクチンとしての使
用のための特異性免疫原の精製、及び有毒トレポネーマ
の免疫原成分の構造及び機能の研究において重要であろ
う。

本発明に従えば、病原性トレポネーマ類即ち梅毒トレＩ
ネーマ及びフランベジアトレポネーマに共通な抗原決定
因子と交差反応性の高度に特異的且つ均質なモノクロー
ナル抗体を作り出し分泌する連続的ハイブリドーマ細胞
系統が確立される。

更に、本発明によるモノクローナル抗体は、ヒトに対し
て病原性のトレポネーマ感染症の免疫化学的診断に有用
な診断試薬を提供する。

以下の説明は、本発明の好ましい実施態様に従うもので
あり、この出願時点における本発明者に知られた最良の
態様を表わすものである。

抗体は、通常骨髄の８９７７９球に由来するりン／ｅ細
胞により合成される。抗体特異性の大きな多様性は多く
の共通の構造的特徴を有する免疫グロブリン分子により
達成される。異質の結合特異性の個々の抗体分子はそれ
らの詳細なアミノ酸配列において異り、同一の特異性の
抗体でさえも、通常は実質的には同種の配列ではあるが
、異ったアミノ酸配列を有する免疫グロブリンの混合物
である。本明細書において「抗体」及び「免役グロブリ
ン−１という用語は互換性を有するものとして使用され
る。

個々のリン・ぐ球は、鵬−アミノ酸配列の免疫グロブリ
ンを産生ずる。リンパ球を直接に培養してそれらの特異
的抗体を産生ずることは不可能である。しかしながら、
コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ　）等はＮａｔｕｒｅ　２５６
：４９５（１９７５）において、体細胞融合、特にリン
パ球とミエローマ細胞間の融合方法が培養液内で生育し
、特異的抗体を産生ずるハイブリッド細胞をもたらすこ
とができるのを示した。ミエローマ細胞はリンパ球の腫
瘍細胞であり、それは細胞株の種類に応じてしばしば抗
体を自ら産生するものであり、更に、幾つかの「非−産
生」株も知られている。

リンパ球及びミエローマ細胞の体細胞融合から生ずるハ
イブリッドは、本発明及び一般的に当該技術において「
ハイシリドーマ、１細胞と称されている。典型的な融合
操作においで、選ばれた抗原に対して免疫化された動物
からの肺臓リンパ球がミエローマ細胞と融合される。得
られたハイブリドーマを次いで一連の別々の培養チュー
ブ或いはマイクロタイタープレートウェル中に分散させ
、目的抗体を産生ずる培養物のスクリーニングを行う。

陽性の培養物を更に希釈して単一細胞から生する＝１０
ニー（クローン）を得る。これらのクローンについて再
び目的抗体を産生ずるためのスクリーニングを行う。ク
ローン化されたハイブリドーマにより産生される抗体を
本発明及び当該技術においては「モ、ツクローナル」と
称する。

モノクローナル抗体は高度に特異的であり単一抗原のみ
に向けられたものである。更に、同一抗原上の異った組
の決定因子に向けられた異った抗体を典型的に含む通常
の抗体標本とは対照的にモノクローナル抗体は抗原上の
単一決定因子に対してのみ向けられたものである。モノ
クローナル抗体は、抗原−抗体結合を使用する診断及び
分析アッセイ法の選択性及び特異性を改良するために有
用なものである。モノクローナル抗体の第２の利点は、
それらがその他の免疫グロブリンにより汚染されること
なくハイシリドーマ細胞により純粋な形態で合成される
という事実により与えられるものである。モノクローナ
ル抗体は、培養されたハイシリドーマ細胞の上澄液或い
はノ・イブリドーマ細胞をマウスの腹腔内接種により誘
発された腹水から調製することができる。

本発明のハイブリッド細胞系統及びモノクローナル抗体
を発生させる方法に従えば、試験動物に梅毒トレポネー
マの抗原標本を用いる免疫化方法により抗体生成のため
の刺戟を行う。例えば、試験動物の免疫化は、ＢＡＬＢ
／ｃマウスの後手前に生きた生物体を皮下接種して行な
うか、或いは、梅毒トレポネーマ免疫優性抗原を表わす
破壊された膜物質又は精製された蛋白質標本の腹腔内注
射により行われる。全ての場合において、本発明者は好
ましい実施態様を寄生虫物質の不均質な組成物によるマ
ウスの免疫化に向け、それにより抗原決定因子の複合配
列を提供した。

宿主動物の免疫化のルート及びスケジュールは、抗体刺
戟及び産生の確立された通常の技術に従う。

本発明者は、マウスを試験モデルとして使用したがヒト
或いはそれからの抗体産生細胞を含む任意の哺乳動物を
操作してハイブリッド細胞系統の製造の基礎に役立たせ
くことができる。

免疫化後、免疫リン・ぞ細胞をミエローマ、プラスマ細
胞腫或いはハイブリドーマ細胞（以下、集合的にミエロ
ーマ細胞と称する）と融合させ、培養及び無限に継代培
養することのできるハイブリッド細胞系統を発生させ、
多量のモノクローナル抗体を製造することができる。

本発明の目的のために、融合のために選択される免疫リ
ンノＲ細胞は、免疫化動物からのリンパ節組織或いは肺
臓組織のいずれから採取されたリンノに球及びそれらの
正常な分化子孫である。本発明において、免疫肺臓細胞
は、マウス系統に関して一層濃縮された便利な抗体産生
細胞の源を提供するので、これらを使用することが好ま
しい。

ミエローマ細胞は融合ハイブリッドの連続的増殖の基礎
を与える。ミエローマ細胞は、骨髄に対して選択性を示
すプラスマ細胞由来の腫瘍細胞である。プラスマ細胞腫
はノラスマ細胞由来の腫瘍性細胞である。特に、免疫グ
ロブリンを分泌しないリン）ｅ球ハイブリドーマ細胞を
使用することが好ましい。リンパ球ハイシリドーマ細胞
はミエローマ或いはプラスマ細胞肺と正常の分化リンパ
細胞との融合により発生する細胞である。ミエローマ、
ソラスマ細胞腫及びハイブリドーマは免疫クロプリン合
成が無いように選択することができる。

ミエローマ及び免疫化抗体産生細胞が得られる特別の動
物の種類は、一つの種類の細胞を他の種類のものと融合
することが可能であるので特に重要ではない。しかしな
がら、免疫化抗体産生細胞とミエローマとの源は同一種
のものから得られたものであることが好ましい。

一般的に、使用された融合技術は、コーラ−等［Ｋｏｈ
ｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｋｕｒ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、　６：１ｌ−１９（１９７６）］及びケネット等（
Ｋｅｎｎｅｔｔ　ｅｔ　ａｔ、　Ｌｖｍｐｈｏ−ｃｙｔ
ｅ　ｌ（ｙｂｒｉｄｏｍａ　−Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐ
ｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ　８１　：　７７−９１（１９７８）
　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ
ｒｋ　：］　に示された方法に従う。融合は、一般的に
生育培地中のミエローマ細胞に抗体産生細胞の懸濁液を
添加し、遠心分離してペレットを形成させた後融合促進
剤、ポリエチレングリコールを添加して達成する。

融合ハイブリッドは次いで病原性トレポネーマに共通な
抗原に特異的な抗体産生についてスクリち、梅毒トレポ
ネーマ及びフランペジアトレポネーマの各々に共通な抗
原性蛋白質膜成分に対して個々の特異性を有する抗体が
含まれる。しかしながら、本発明のモノクローナル抗体
は無発病性のトレポネーマ種により共有されない抗原決
定因子に対しては無視できる特異性を有する。

病原性トレポネーマによって共有される抗原に対して特
異的な抗体を分泌するノ・イブリドーマを培養して安定
な遺伝暗号を有する連続的細胞系統を確立する。これら
の細胞系統は、液体窒素下での凍結及び貯蔵を含む多（
の任意の方法によって貯蔵及び保存することができる。

凍結された細胞系統は再生され、病原性トレポネーマの
共有抗原に対して特異的なモノクローナル抗体の合成及
び分泌を再開して無限に培養することができる。分泌さ
れた抗体は組織培養上澄液から通常の沈澱、イオン交換
、アフイニテイクロマトグラフイなどにより回収される
。回収された抗体は凍結乾燥され、余り活性を損′失す
ることなく少な（とも数週間は冷凍下に貯蔵することが
できる。

以下の具体例は本発明の特別の実施態様を例示するため
に提供されるものであるが、それらは本発明を制限する
趣旨のものではない。

Ａ、抗原の調製 梅毒トレポネーマ（Ｎｉｃｈｏｌｓ株）及びフランペジ
アトレポネーマ（Ｇａｕｔｉｅｒ株）を病気コントロー
ルセンター（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　
Ｃｏｎｔｒｏｌ、ジョーシア州アトランタ）から得、ウ
サギ中での通常の継代により維持した。トレポネーマ類
の保存溶液はＣｒｙｏｂｊｏｌｏｇｖ　９：４０４−１
０（１９７２）　中に記載されたように一８０°　で冷
却保存した。トレポネーマ類ハ感染つサギ本丸からＩｎ
ｆｅｅｔｌｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　２６　：
１０４８−５６（１９７９）に素描された方法に従って
収穫された。トレポネーマ類は皐丸炎のピーク（梅毒ト
レポネーマについては接種後１１〜１４日、及びフラン
ベジアトレポネーマについては接種後２６〜３０日目）
において析出された細かく刻まれた本丸組織から１５　
ｍ１３の塩類−グルコーストレポネーマ培地中で還元条
件下に１５分間室温で振盪することにより取り出された
。ｍ１３当り１．５Ｘ１０　〜４．０〜１０８個の生物
体のトレポネーマ懸濁液を５００　Ｘ　ｇで１５分間二
回清澄化した後細胞の破片を０．８チＭｅｔｈａ、ｃｅ
ｌ　（Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社、ミシガン州、ミツ
ドランド）　−５０％　ｆ（ｙｐａｑｕｅ　（Ｗｊｎｔ
ｈｒｏｐ　ＬＩａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）ニューヨー
ク州、ニューヨーク）のクッション上でｓｏｏ　ｘ　ｇ
にて室温で加分間遠心分離することにより除去した。次
いで、それぞれトレポネーマを１７．０００　Ｘ　ｇ　
でペレット化し、ＰＢＳ　（１３７ｍＭＮａＣｌ、　２
．７　ｍＭ　ＫＣＩ、４．６　ｍＭ　Ｎａ２ＰＯ４及び
１．５ｍＶ　ＫＨ２ＰＯ４）中で二回洗浄してトレポネ
ーマの外部エンベロープに伴うゆるく結合した宿主プラ
スマ蛋白質を除去した。生物体を次いでＰＢＳ中に再懸
濁して所望濃度にした。

Ｂ、融合用リンパ球の調製 トレポネーマ類（０，５ｍＡｍ水塩６×１０８梅毒トレ
ポネーマ）をフロイントの完全アジュバント中に１＝１
（容蓋：容量）で乳化した。生物体はＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／
ｃ雌マウマウス〜６週令）中に筋肉内（１０ｍ０．０．
１　ｍｌ　）　、皮下（８，ｅｌ、Ｑ、１ｍＡ）及び腹
腔内（’、ｐ、、０．３　ｍｌ）に投与した。谷マウス
は合計３Ｘ１０８個の梅毒トレポネーマを受け取った。

７１目及び２１日１にマウスは上記の如くフロイントの
不完全アジュバントに乳化された３×１０８個のトレポ
ネーマで追加抗原刺戟を受けた。最終免疫化後４日後に
肺臓を取り出し、肺臓細胞をハイブリドーマ構成に使用
するために単離した。

Ｃ，ハイブリドーマの形成 ハイブリドーマはオーイ及びヘルゼンパーグの基本操作
［Ｏｉ　ａｎｄ　ｆ（ｅｒｚｅｎｂｅｒｇ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　−Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｈｙｂ
ｒｉｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ、Ｉｎ　５ｅｌｅｃｔｅ
ｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ収録、（Ｂ、Ｂ、　Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳ
０Ｍ、Ｓｈｉｉｇｉ編ｐｐ、　３５１−３７１、Ｊ）１
．Ｆｒｅｅｒｒａｎ　ａｎｄＣｏ、、　１９８０年サン
フすンシスコ）〕の修正法を用いて免疫化マウスからの
肺臓細胞をネズミＳＰ２１０−Ａｇ１４ハイシリドーマ
細胞（以下、５Ｐ２１０と称する）と融合させることに
より製造した。

適当な細胞系統はＤｕｋｅ太学のニド・ヘイズ（ＦＡ）
Ｔａｙｅｓ　）氏及びＳ、ロパートソン氏（Ｓ。

Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ　１ダラスのＴｅｘａｓ大学健康科
学センター）より得られ、これらは元々シュルマン（Ｓ
ｃｈｕｌ−ｍａｎ　）等によりＮａｔｕｒｅ　２７６：
２６９−２７０（１９７８年）に示された通りのもので
ある。Ｓ　Ｐ　２１０ハイブリドーマ細胞系統はＢＡＬ
Ｂ／ｃ牌臓細胞と肺臓ローマ細胞系統Ｘ　６３−Ａｇ５
間のハイブリッドとして形成されたＳＰ２／）ＩＧＬＫ
由来のハイブリッド細胞系統である。

この細胞系統は免疫グロブリン鎖を合成せず、酵素ヒポ
キサンテングアニンホスホリボシルートランスフエラー
セ（ＨＧＰＲＴ）を欠き、８−アザグアニンに対して耐
性を有し、Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄのヒポキサンチン−
アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ　）選択培地の存在
下において死滅する。５Ｐ２１０細胞は、］、５５％容
量／容量）の熱−不活性化ウシ（ｅａｌｆ　）胎児血清
（Ｍｊｃｒｏｈｊｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔ
ｅｓ　）、２ｍＭＬ−グルタミン、及び関単位／酊ペニ
シリン及び５０μｇ　７ｍｌストレプトマイシンを補給
されたＴ）ｕｌｂｅｃｃｏの修正イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）　（Ｍｉｃｒｏｂｉｏ−１ａｇｉｃａｌ　Ａｓ５ｏ
ｃｉａｔｅｓ　、メリー２ンド州、ウォーカースピル）
中で生育された。５Ｐ２１０細胞は）ＴＧＰＲＴ−陽性
の復帰細胞が細胞培養液中に存在しないことを確実にす
るためにハイブリッド化実験に使用する直前に８−アザ
グアニン（２０μｇ／　ｍｌ　）を含有するこの培地中
で生育された。

肺臓を免疫化マウスから無菌的に取り出し、鉗子を用い
てゆっくりほぐして血清のないＤｕｌｂｅｃｃ。

の修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の単一細胞懸濁液を
調製した。５Ｐ２１０細胞は対数増殖期において収穫し
、両方の細胞タイプは８℃において２７０×ｇにおいて
１０分間遠心分離して採取し、ＤＭＥＭで五目洗浄した
。全細胞数はＮｅ１１ｂａｕｅｒ血球計数器を用いて決
定され、生存率はトリパンゾル−排除試験により測定し
た。

はぼ１０８個の肺腺細胞を生きた５Ｐ２１０細胞当り７
（１ａの生きた肺臓細胞の割合で５０ｍ１３円錐管中で
混ぜ合せ、得られた細胞懸濁液を４００　Ｘ　ｇにて１
０分間遠心分離することによりペレット中に集めた。

１溌培地を除去し、細胞ペレットを含有する管を３７℃
の水浴中に１分間置いた。

細胞融合は、１ｒｎｅずつの予め温められた（３７℃）
ＤＭＥＭ中の５０％（３に：ｆ／容量）のポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ　１０００　；　ＡＴＣＣ）の浴液
を１分間に亘って細胞ペレットにゆっくり攪拌しながら
滴加することにより開始された。この懸濁液を更に１分
間攪拌した。次いで、２ｍｌの血清のないＤＭＥＭを更
に２分間に亘って添加した。最後に７１（１〜２×１０
　肺臓細胞）の２０％ウシ（ｂｏｖｉｎｅ　）胎児血清
（）・イブリドーマ成長について試験されたもの、　Ｍ
ｉｃｒｏｂｊｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ
　）−を補給された予め温められた１）ＭＥＭを２〜３
分間に亘って添加した。細胞を次いで４００　Ｘ　ｇに
て１０分間遠心分離し、細胞を３Ｘ１０−６Ｍグリシン
を補給したＤＭＥＭ中で２〜４　Ｘｌ０６／ｍｅに再懸
濁した。

この懸濁液５０μｌを５０μｌのＤＭＥＭ＋グリシン中
に１×１０５正常ＢＡＬＢ／ｃ牌臓供給細胞を含有する
９６−ウェルのマイクロタイター組織培養プレート（Ｈ
ｅｌｌｃｏ、ニューシャーシー州、パインランド）の各
ウェルに分割添加した。

融合後１日目に、０．２ｍＭヒ〆キサンテン、０．７ｍ
Ｍアミノゾテリ／及び３２ｍＭチミジン（ＨＡＴ選択培
地）を補給した１００μｌのＤＭＥＭ　＋グリシンを各
ウェルに添加した。これらの細胞は次いで７％ＣＯ２雰
囲気を含有する湿潤化されたインキュベーター内で３７
℃において７〜１０日間インキュベートし、ノ・イゾリ
ツド細胞系統を生育させた。

未融合５Ｐ２１０細胞はＩ（ＡＴ中において２４〜４８
時間以内に死滅した。ＨＡＴＡＴ中における細胞生育は
ハイプリツｒ化の成功を示すものである。生育クローン
を含有したウェルのアッセイを行って病原性トレポネー
マに共通な抗原決定因子に向けられたモノクローナル抗
体を検出した。上澄液が寄生虫に対する抗体について陽
性である細胞をこれらの個々のウェルからウェル当り１
×ｍ　個のＢＡＬＢ／ｃ牌臓供給細肺臓含有する９６ウ
エルの組織培養プレー）　（Ｒｅ１ｌｃｏ　）の各ウェ
ルに移した。

クローン化されたハイブリドーマはＢＡＬＢ／ｃマウス
（６〜１０週令）の腹水中で生育された。マウスは１日
目及び４日目に９．５ｍＡのＰｔ１ｓｔａｎｅ■（２，
６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン、Ａｌｄｒ
ｊｃｈ　Ｃｂｅｍｉｃａ１社、ライスコンシン州、ミル
ウオーキー）を腹腔内に注射した。５〜１０日後マウス
には塩水中１×１０６個のノ・イブリドーマ細胞の腹腔
内注射が与えられた。７〜１０日後に腹水を腹腔から取
り出した。

Ｄ、モノクローナル抗体の特性化 梅毒トレポネーマ膜抗原に対して向けられたモノクロー
ナル抗体の存在についてのハイブリッドクローン培養上
澄液のスクリーニングはマイクロＥＬＩＳＡ技術を用い
て行われた。新たに抽出された梅毒トレポネーマ生物体
はアルプレート等Ｃ，Ａｌｄｅｒｅｔｅ　ａｔ　ａｌ、
、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、２６　：１０４８〜
５６（１９７９）：］　により説明された通りの１１’
ｂｔｈｏｃｅｌ（１）ｏｗ　Ｃｈｅｍｉ　ｃａ　１社、
ミシガン州、ミツドランｒ）−）ｉｐａｑｕｅ　（■’
１ｎｔｈｒｏｐ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｑ社１　ニュ
ーヨーク）勾配遠心分離により精製された。約３×１０
８個の生物体／１を含有するトレポネーマ懸濁液をリン
酸緩衝塩水（ＰＢＳ；　１３７　ｍｍｏｌ／　Ｉ　Ｎａ
１ｌ　、　２．７ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＣＩ　、　４．６　
ｍｍｏｌ／Ｉ　Ｎａ２ＨＰＯ４及び１．５ｍｍｏｌ／ｌ
　’ＩＧ（２ＰＯ４、ｐＨ７，２）を用いて一度洗浄し
、１７．５００　Ｘ　ｇ　で１０分間遠心分離を行った
。ペレットを３．５×１０７トレボ不−マ／ｍｅＰＢＳ
に再懸濁した。５０μｍを−１６−ウェルＰＶＣマイク
ロタイターゾレート（Ｔ）ｖ４ａｔｅｃｋ　Ｔ、ａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ　％　米国、パー・ジニア州、アレキ
サンドリア）の各ウェルに分配し、懸濁液を空気中で３
７℃で乾燥した。次いで５０μｌの９５チエタノールを
各ウェルに添加し、プレートを３７℃で乾燥し、使用す
るまで４℃において乾燥剤の下に貯蔵した。

精製した梅毒トレポネーマ蛋白質を炭酸緩衝液中で１μ
ｇ／ｌに希釈し、９６−ウェルマイクロタイタープレー
ト上に分配（５０ｎｇ　／ウェル）し、４℃にて一晩イ
ンキュベートした。直ちに使用しない場合は、プレート
をＰＢＳで一度洗浄し、ＰＢＳ　−１％　ＵＳＡを充填
し、−加℃で貯蔵した。

全梅毒トレポネーマ生物体に対する抗体を検出するため
に、修正されたＥＬＩＳＡ技術を使用した（　Ｖｏｌｌ
ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ、ＲｏＲｏｓｅ及びＦｒ　ｉ
　ｅ　ｄｍａｎ　＠　Ｍａｎｕａ　１ｏｆ　Ｃ３ｉｎｉ
ｃａｌ　ＩｍｍｕｎｏＩｏｇｙ収録、ワシントン、Ｄ、
Ｃ。

アメリカ微生物学会９．５０６．１９７６年）。簡単に
述べると、ＰｖＣマイクロタイタープレートの抗原被覆
後１％ＢＳＡを補給したＰＢＳで充填されたウェルを最
低２時間３７℃でインキュベートした。プレートを次い
でＰＢＳで五目洗浄し、ＰＢＳ　−１％ＵＳＡで希釈し
た５０μｍの試験血清を指示ウェルに添加した。３７℃
で１時間インキュベーション後プレートを四回ＰＢＳで
洗浄した。次いで、ＰＢＳ　−１％ＲＡＳ中に１．／３
０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−
ウサギＩｇＧ　（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ。

米国、インジアナ州、エルクハ＃））ヲ５０μｍずつ谷
ウェルに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュ
ベート後、逐次ＰＢＳ　（五目）、蒸留水（二回）で洗
浄した。最後に、ジェタノールアミン緩衝液中で調製し
た５０μｍ、の１　ｍ９　／　ｍｌ：　ｐ−ニトロフェ
ニルリン酸二ナトリウム（Ｓｊｇｍａ　）　を各ウェル
に添加し、プレートで３７℃で３０分間インキュベート
した。抗体反応性はＭｉｃｒｏ　ＥＬＩＳＡ　Ｒｅａｄ
ｅｒ（Ｔ′）Ｖｎａｔｅｃｈ　）を用いて４０５　ｎｍ
における光学密度の読み取りにより測定した。

吸光度が抗原のない対照ウェルを用いて得られた背景水
準の吸光度よりも少なくとも二倍大きいマイクロタイタ
ーウェルを梅毒トレポネーマ生物体に対して向けられた
抗体の存在について陽性と評価した。

陽性のクローン成長を示すほぼ１５００のウェルのうち
、５４個のクローンが全梅毒トレポネーマ生物体に対し
て反応性であった（　０．１５０より大きいＥＬＩＳＡ
値）。

梅毎トレポネーマ全生物体に対して反応性を示す５４個
のモノクローナルについて、次いで、音波処理をしたト
レポネーマ類、即ちそれぞれ梅毒及びフランペジアに対
する病原体である梅毒トレポネーマ（Ｔ、ｐａｌｌｉｄ
ｕｍ　）及びフランペジアトレポネーマ（Ｔ、ｐｅｒｔ
ｅｎｕｅ　、）並びに二つのヒトに対する非病原性のト
レポネーマｍ、Ｔ、ヒオディセンテリアエ（Ｔ、　ｈｙ
ｏｄｖｓｅｎｔｅｒｉａｅ　）及びＴ、ファゲデニス（
Ｔ、ｐｈａｇｅｄｅｎｊｓ　）バイオタイプライタ−（
ＭｏｔｙｐｅＲｅｉｔｅｒ　）に対する反応性のスクリ
ーニングを行った。

各トレポネーマの音波処理したトレポネーマ抗原は精製
トレポネーマ類を炭酸緩衝液（ｐ）Ｉ　９．６４当り１
．５９　ｇ　Ｎａ２ＣＯ３及び２，９３　ｇ　ＮａＴ（
ＣＯ３）　中に懸濁することにより調製した。音波処理
は氷上で４５秒間の間歇的インキュベーションと共に六
回の１５秒間の音波発生により達成された（　５ｏｎｉ
ｆｉｅｒＣｅｌｌ　Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ、　ｒ４ｄｅｌ
　Ｗ１４０Ｄ、　Ｂｒａｒ＋ｓｏｎ　５ｏｎｉｃ　Ｐｏ
ＷｅｒＣｏ、）。

各音波処理されたトレポネーマ蛋白質混合物の各々を上
記と同様にして、但し、ウェル当９１μｇの蛋白質の濃
度でマイクロタイターウェル上に被覆した。

継続スクリーニングに選ばれた５４個のモノクローナル
のうち、それらから産生されたモノクローナル抗体は下
記の如（精製された。ｆ）ｒｎｌのマウス腹水を０．０
１　Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，２で１：５に希釈し、１．
５×９ｃｍの蛋白質Ａ−セファロースのペラＰに適用し
た。４罰ずつの画分を集め、各々２８０　ｎｍにおける
吸光度を背景が０．０２未満となるまで追跡した。次い
で、溶出緩衝液をｐＨ２，８グリシン塩酸塩に切り換え
た。Ａ２８０吸収物質を含有する画分を集め、二段階法
により先ず５０ｍＭクエン酸、５０ｍＭ　リン酸、０．
１５　Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ５，５に対して、及び最終的
にＰＢＳに対して透析させた。

この精製モノクローナル抗体を次いでＰＢＳ中において
１〜／ｍ１３に希釈し、使用するまで小アリコートとし
、て−７０℃に貯蔵した。

次いで、前記マイクロＥＬＩＳＡ操作を繰り返して、ど
のモノクローナル抗体が病原性トレポネーマに共通な蛋
白質抗原決定因子と交差反応し、ヒトに対する非病原性
トレポネーマと反応しないかを決定した。５４個の試験
されたモノクローナル抗体のうち４個がヒトに対して病
原性の梅毒トレポネーマ及びフランペジアトレポネーマ
に対して向けられたものであり、ヒトに対して病原性で
ないトレポネーマとは反応性を有しなかった。表１にこ
れらの結果を記載する。

３、免疫優性ＩリペゾチドＰ６に対する特異性を上記四
つのモノクローナル（１１Ｆ２．１３Ｆ３．２３Ｃ９及
び２０Ｇ１１　）　を更に試験したところ、これらのモ
ノクローナルの内三つ（１，１Ｆ２．１３Ｆ３及び２３
Ｃｇ　）　は病原性トレポネーマ類、梅毒トレポネーマ
及びフランペジアトレポネーマに共通の免疫曖性ポリベ
ゾチドＰ６に対して特異性を有する抗体を統生じた。ア
ルプレート等［Ａｌｄｅｒｅｔｅ　ｅｔ　ａｌ、。

’　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｅｒｕｍ　ＩｇＧ　ａ
ｇａｉｎｓｔ　Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ
Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｉｎ　Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔａｌｌｙ　ＩｎｆｅｃｔｅｄＲａｂｂｉｔｓ
“、　Ｒｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｎ
ｅｒａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　５７：３０２−８（１９８
１））　（本発明において準用する）に記載されている
操作に従い、四つの試験されたモノクローナル抗体は表
■に示す如く梅毒トレポネーマ蛋白質と反応した。トレ
ポネーマ成分Ｐ６はほぼ４２，５００ダルトン（分子量
）メ表面蛋白質であり、感染したヒト及びウサギの免疫
学的反応に基づ（有害トレポネーマ類の免役優性エンベ
ロープ蛋白質の一つである。

各種可溶化トレポネーマ類の蛋白質：Ｔ、ＰａｌＨ−ｄ
ｕｍ、　Ｔ、ｐｅｒｔｅｎｕｅＳＴ、ｈｙｏｄｙｓｅｎ
ｔｅｒｊａｅ及び］”、ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓバイオタ
イプライタ−に対するモノクローナル抗体１３Ｆ３のＷ
ｅｓｔｅｒｎ法分析は、１３Ｆ３モノクローナル抗体が
Ｔ、　ｐａｌｌｉｄｕｍ及びＴ、ｐｅｒｔｅ−ｎｕｅに
より保有される免疫優性蛋白質Ｐ６とは反応性を有する
が、しかし、試験された他の二つのトレポネーマとは反
応性を有しないことが確認された。

今日まで、本発明者は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　
ＴｖｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　、メ
リーランド州、ロックビル）にクローン１１Ｆ２（ＡＴ
ＣＣ寄託番号ＨＢ８３９６　）及びクローン１３Ｆ３（
ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ８３９５　）に対応するハイブリ
ッド細胞系統を寄託している。

モノクローナル抗体１３Ｆ３　の梅毒トレポネーマに対
する抗原検出の効率を決定するために、塩化ポリビニル
（ｐｖｃ）マイクロタイタープレートウェル（Ｄｙｎａ
ｔｅｃｈ、　Ｉｎｖｎｕｌｏｎ　ｎプレート）を１３Ｆ
３モノクローナル抗体を含有する１、１０及び１００μ
ｇ蛋白質濃度の腹水で被覆した。これは炭酸緩衝液を用
いる標準的操作により達成された。この様に、１３Ｆ３
　抗体の配向は感染者の体液或いは組織内のトレポネー
マ抗原の特異的結合のための吸引分子、のそれである。

マイクロタイタープレートウェルの一晩の被覆後、プレ
ートをＰＢＳですすぎ、室温で乾燥させ使用するまで４
℃で貯蔵した。数週間貯蔵されたプレート中には反応性
の損失は検出されなかった。本発明において説明される
診断目的のためには前日調製された抗体を有するプレー
トのみを使用した。

被覆プレートを次いでＰＢＳ−１乃ＢＳＡで処理して全
ての非特異性部位を緊縛した。３７℃で２時間インキュ
ベーション後、プレートを少なくとも五目ＰＢＳで洗浄
し、谷ウェルに　１）未感染ウサギからの正常組織、　
１１）梅毒トレポネーマを接種されたウサギの毛を剃っ
た背中からの組織、及びｌ１１）抗体がトレポネーマ成
分と反応性であることを確認するための陽性対照例とし
ての梅毒トレポネーマ生物体、の新たに調製されたホモ
ジネート（下記の如くに得られたもの）１００μｍ　を
添加した。３７℃において２時間インキュベーション後
、ウェルを上記の如（再び洗浄し、対照例として正常マ
ウス血清或いは梅毒トレポネーマで感染したマウスから
集められた血清と共にインキュベートした。これらの血
清は放射性免疫沈降技術を用いて梅毒トレポネーマの外
部インペロープ蛋白質に対する反応性について予め検査
が行われ、梅毒のマウスの血清は鍵表面免疫原に対する
高力価の抗体を保有することが見出された。ウェルをこ
れらの抗原試薬で６０分間処理し、洗浄し、アルカリホ
スファターゼ結合ヤギ抗−マウス免疫グロブリン（Ｉｇ
Ｇ画分）を添加後更に３７℃でインキュベートした。６
０分後、ウェルを再びＰＢＳで洗浄し基質を添加した。

プレートを更に６０分間インキュベートして、個々のウ
ェルについて４０５　ｎｍ　についてＴ）ｙｎａｔｅｃ
ｈマイクロタイタープレート走査計上で読み取りを行っ
た。（梅毒のヒト或いはウサギからの血清も又上記アッ
セイに僅か修正を施こせば使用できることは注目に値す
る。この場合、マウス血清試薬が使用されたのは対照マ
ウス中に反応性が欠けること及び梅毒マウス血清中に高
力価のＩｇＧが見出されたものによるものである。）こ
れらの結果は、感染ウサギ病巣からの１０６個の生物体
を含有する０４ｍ１３による対抗後７日目に発生するト
レポネーマ抗原の１３Ｆ３　モノクローナル抗体による
成功した検出を示した。予想された如（ＰＶＣプレート
上に被覆された各濃度に対して１３Ｆ３ダクローナル　
は精製された全生物体のホモジネートから容易に梅毒ト
レポネーマ抗原を検出した。

同様に行われた実験に対照例の未感染組織の同様なホモ
ジネートか使用された場合には反応性は見られなかった
。

上記の如く、皮膚試料をウサギから得るために組織部検
を得るために皮膚科実験室で使用されている皮膚・ξン
チを使用した。はぼ７５朋　の表面積を有し、皮膚及び
皮下組織を含有する二つのもつ上った病巣からの試料を
細かく切り、１ｍＭフェニルメチルスルホニルクロライ
ｙ　（ＰＭＳＦ）　（非特異的プロテアーゼ阻害剤）及
び０．０５％両性３−１２洗剤を含有するＰＢＳ中に２
ｍ１３まで再懸濁した。

この物質を次いで回転モーター上で毎分１００回転する
テフロン乳棒を有するＤｏｕｎｃｅホモジナイザーを用
いて均質化した。はぼ５０ストローク後−、ホモジネー
トを微細管に移し、１０，０００×ｇ　で５分間遠心分
離を行った。上澄液を上記酵素結合免役吸着アッセイの
抗原として使用した。梅毒トレポネーマ生物体は同様に
０，０５％の両性３−１２洗剤を含有する１　ｍｌ　Ｐ
ＢＳ　−１ｍＭ　ＰＭＳＦ中において予めＰＢＳで良く
洗われた１０　個の生物体を再懸濁させることにより均
質化させた。この懸濁液を標準的なガラス乳偉、緊密適
合ホモジナイザーを用いて１０ストロークで均質化した
。可溶性物質を遠心分離にかけ（１００，０００Ｘ　ｇ
　）、不溶破片を除去し、上澄液をＥＬＩＳＡのための
ウェルに添加した。

以」：、本発明の組成物及び方法を好ましい実施態様に
ついて説明したが、各種変化が冒頭に掲げた特許請求の
範囲に規定された本発明の範囲から離れることなく開示
された組成物及び方法に行うことが可能なことは当業者
には明らかであろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト病原性トレポネーマ類に共通な抗原決定因子に
   対しては反応性であるが、しかし、ヒト非病原性トレポ
   ネーマ類に対しては非反応性であるモノクローナル抗体
   を産生する連続ハイブリッド細胞系統から本質的になる
   ハイブリドーマであって、該細胞系統がミエローマ細胞
   とヒト病原性トレポネーマ類に対して免疫化されたリン
   パ球との融合として形成されることを特徴とするハイブ
   リドーマ。 ２、ハイブリッド細胞系統がマウスミエローマ細胞に融
   合された、ヒト病原性トレポネーマ抗原に対して免疫化
   されたマウスリンパ球の細胞ハイブリッドである、特許
   請求の範囲第１項記載のハイブリドーマ。 ３、連続ハイブリッド細胞系統が、マウスミエローマ細
   胞に融合された、ヒト病原性トレポネーマ抗原に対して
   免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウス免疫牌臓細胞の肺臓ハ
   イブリッドである、特許請求の範囲第１項記載のハイブ
   リドーマ。 ４、ハイブリッド細胞系統が、５Ｐ２１０ハイプリドー
   マ細胞に融合された、ヒト病原性トレポネーマ抗原に対
   して免疫化されたマウスリンパ球の細胞ハイゾリンＰで
   ある、特許請求の範囲第１項記載のハイブリドーマ。 ５、ヒト病原性トレポネーマ抗原が梅毒トレポネーマ（
   Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ　）抗原である
   、特許請求の範囲第１項、第２項、第３項又は第４項記
   載のハイブリドーマ。 ６、ヒト病原性トレ２ネーマ抗原がＰ６免疫浸性蛋白質
   である、特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、又は
   第４項記載のハイブリドーマ。 ７、ハイブリッド細胞系統がハイブリドーマクローンＡ
   ＴＣＣ寄託物ＨＢ８３９５或いはＨＢ８３９６である、
   特許請求の範囲第１項記載のノ・イブリドーマ。 ８、ヒト病原性トレポネーマ類に共通な抗原決定因子に
   対しては特異性を有するが、しかしヒト非病原性トレポ
   ネーマ類に対しては特異性を欠（モノクローナル抗体か
   ら本質的になる組成物。 ９、モノクローナル抗体が梅毒トレポネーマ（Ｔ、ｐａ
   ｌｌｉｄｕｍ　）及びフランベジアトレポネーマ（Ｔ、
   ｐｅｒｔｅｎｕｅ　）に共通な抗原決定因子に対して特
   異性を有するが、しかし、ヒトにおいて病原的でないト
   レポネーマ類に対しては特異性を欠く、特許請求の範囲
   第８項記載の組成物。 １０、モノクローナル抗体がＰ６免疫優性蛋白質に対し
   て特異性を有する、特許請求の範囲第８項記載の組成物
   。 １１、モノクローナル抗体がハイシリビーマクローンＡ
   ＴＣＣ寄託物ＨＢ８３９５或いはＨＢ８３９６　から産
   生されたものである、特許請求の範囲第８項記載の組成
   物。 １２、宿主におけるヒト病原性トレポネーマ感染を診断
   する方法において、 宿主からの生理学的試料を、ヒト病原性トレポネーマ類
   に対して共通な抗原決定因子に対して特異性を有するが
   、しかし、ヒト非病原性トレポネーマ類に対しては特異
   性を欠（モノクローナル抗体を含む組成物と接触させ、 生理学的試料の抗原物質とモノクローナル抗体間の免疫
   学的結合反応性を測定することを特徴とする方法。 １３、生理学的試料が血清である、特許請求の範囲第１
   ２項記載の方法。 １４、生理学的試料が感染した組織である、特許請求の
   範囲第１２項記載の方法。 １５、モノクローナル抗体が、梅毒トレポネーマ（Ｔ、
   　ｐａｌｌｉｄｕｍ　）及びフランベジアトレポネーマ
   （１’、　ｐｅｒｔｅｎｕｅ　）に共通な抗原決定因子
   に対して特異性を有するが、しかし、ヒト非病原性トレ
   ポネーマ類に対して特異性を欠く、特許請求の範囲第１
   ２項記載の方法。 １６、モノクローナル抗体がＰ６免疫優性蛋白質に対し
   て特異性を有する、特許請求の範囲第１２項記載の方法
   。