JPS60160883A - 細胞培養床 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ホ乳類動物を始めとする生物の細胞を培養す
るために使用される細胞培養床に関するものである。

最近においては、生物の細胞の種々の条件下における反
応およびその他の特性の研究あるいは特定の細胞の代謝
活動による生成物の研究が活発に行なわれており、特に
純人工的には合成不可能なあるいは合成が極めて困難な
物質を。

特定の細胞の活動を利用して製造することが多方面にお
いて研究されている。そのような物質の具体例としては
１例えばインターフェロン。

ホルモン、リンフ才力イン、その他を挙げるととができ
る。

細胞の培養は９通常、細胞を培養床に接種したものを例
えば培地中に置き、当該細胞に適応した環境条件下でイ
ンキュベーションすることによって行なわれるが１種々
の制約があって所期の細胞培養を行なうことは相当に困
難である。

その障害のうちの大きなものとして培養床の問題がある
。即ち、正常２倍体細胞などの接着性細胞は、培養床に
接着して単層で増殖するものであるので、細胞の培養収
率は使用される培養床の状態１％にその増殖性の良否に
よって大きく左右される。

従来においては、多糖類のような高分子物質。

成る種の合成重合体などが培養床として用いられている
が、必ずしも良好な結果を得ることができないため、新
規で有用な細胞培養床の出現が強く望まれている。

以上のごとき背景下において１本発明者らは新規な細胞
培養床をめて鋭意研究を重ねた結果、天然由来のタンパ
ク質の中で特定のタンバり質を選択し、当該タンパク質
を架橋反応によシ本質的に水不溶性にした架橋体により
その表面を形成した細胞培養床は１接着依存性細胞に対
し大きな増殖性を与えることを見出し、この知見に基づ
いて本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、高い培養収率で細胞培養を行なうこと
のできる細胞培養床を提供するにある０ 本発明の特徴とするところは、羊毛由来のタンパク質の
架橋体により、細胞培養床の表面を形成せしめる点にあ
る。

以下本発明について詳細に説明する。

本発明の細胞培養床は、羊毛から化学的可溶化処理によ
り抽出した羊毛由来のタンパク質から作製されるが、こ
れは、羊毛由来のタンパク質が水不溶性であるために、
特に化学的可溶化処理により抽出するものである。

本発明における羊毛とは、特にその種類を限定されるも
のではないが９例えばメリノ６４“８種、リンカーン種
などを挙げることができ、好ましくは７９７６４８種を
挙げるととができる。

羊毛は、一般的には有機溶媒に浸して脱脂した後に化学
的可溶化処理を行う。ここにおける有機溶媒は特に限定
されるものではないが、その例ヲ挙ケルトエチルアルコ
ール、ベンゼン、エチルエーテル、石油エーテルなどが
ある。

羊毛の化学的可溶化処理によるタンパク質の抽出方法と
しては１例えば以下の方法を挙げることができる。

（１）還元剤によシ羊毛を還元して可溶化する方０．７ 法。具体的には、還元剤としての１１１１Ｑ〜ＩＭチオ
グリコール酸水溶液に、抽出を効率良く行なうだめにア
ンモニアや水酸化カリウムなどのアルカリ性物質を加え
てｐＨ７〜１２とした中に、０〜４０℃で１〜２４時間
程度羊毛を浸すことによりタンパク質を抽出する方法を
例示することができる。特にこの方法における抽出を０
〜５℃で行ない、さらに抽出効率を上げるだめに再度こ
の条件による抽出をくり返すことにより得られるタンパ
ク質（成分１）および残シの未溶解繊維を純水中に浸す
ことによシ得られるタンパク質（成分２）は９本発明の
細胞培養床を作製するのに好適なタンパク質である。ま
だ還元剤としての１〜１．００　ｍ　Ｍのトリス（ヒド
ロキシメチル）ホスフィン、トリス（ジエチルアミノエ
チル）ホスフィン、トリーｎ−ブチルホスフィンなどの
第三級ホスフィンの水溶液を含む１０〜５０％（ｖ／ｖ
）の極性有機溶媒中に、０〜４０℃で１２〜４８時間程
度羊毛を浸すことによりタンパク質を抽出する方法を用
いることもできる。

ここにおける極性有機溶媒としては１例えばｎ−フロビ
ルアルコール、エチルアルコール、アセトン、ジエチル
エーテル、酢酸エチルなどを挙げることができる。

（２）還元剤と変性剤を併用する方法。

具体的には、還元剤としての０．１〜５％（Ｗ／ｖ）２
−メルカプトエタノールおよび／もしくは１０〜１００
ｍＭジチオスレイトールならびに変性剤としての２〜８
Ｍ尿素および／もし毛を浸すことによりタンパク質を抽
出する方法を例示することができる。

このような方法により得られる抽出液には、羊毛由来の
タンパク質以外に還元剤、変性剤などが混入しているだ
めに１通常はカラムクロマトグラフィーＱまたは一透析
などの方法により。

混在する還元剤、変性剤などを除いて、緩衝液。

例えばｐＨ７の２０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液に溶媒
を置換する。

抽出された当該羊毛由来のタンパク質は、水溶性となっ
ており、これらを担体表面上において再び非水溶性に改
質し、細胞培養液中への溶出を防がなければならないが
、その方法は、グルタルアルデヒドなどの化学的架橋剤
による架橋反応、羊毛由来のタンパク質自身が有するス
ルフヒドリル基の酸化による架橋反応、紫外綜照射によ
る羊毛由来のタンパク質の重合による架橋反応などが用
いられる。すなわち水溶性の羊毛由来のタンパク質を水
不溶性へ改質するためには、羊逅由来のタンパク質を担
体表面に塗布した後に架橋することが必要である。

架橋方法の具体例としては、以下の方法を挙げることが
できる。

（１）羊毛由来のタンパク質溶液を０．１〜２％（Ｗ／
Ｖ）濃度とし、担体をこの溶液に浸し。

室温で１０〜６０分間程度放置した後、その溶液の大部
分を除去し、担体を窒素気流下に置き。

低圧水銀灯で１〜２４時間程時間外線を照射する方法。

（２）　羊毛由来のタンパク質を０．１〜２％（Ｗ／Ｖ
）溶液とし、担体をこの溶液に浸し。

室温で１０〜６０分間程度、放置した後、その溶液の大
部分を除去し、担体を清浄空気中に０〜４０℃で放置し
、羊毛由来のタンパク質のスルフヒドリル基を空気酸化
させる方法。

（３）羊毛由来のタンパク質を０．１〜２％（Ｗ／Ｖ）
溶液とし、担体をこの溶液に浸し。

室温で１０〜６０分間程度放置した後、その溶液の大部
分を除去し、空気中または窒素気流下で乾燥後、ｐＨ７
の１００ｍＭリン酸ナトリウム水溶Ｍ、ｐＨ８のｔｏｏ
ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液などの緩衝液に溶解した１〜
５％（Ｗ／Ｖ）グルタルアルデヒドなどの化学的架橋剤
溶液に担体を浸し、室温で１〜２４時間程度放置する方
法。

羊毛由来のタンパク質の架橋体をその表面に形成させる
だめの担体は種々の材質および形状のものを用いること
ができる。ここに材質および形状は特定されるものでは
ないが、材質としてはポリスチレン、ガラスなどを、形
状としてはシャーレ、ファイバー、ビーズなどを例示す
ることができる。

このようにして作製される本発明の細胞培養床は、一般
的には中性緩衝液、好ましくはｐＨ７の１０〜１００ｍ
Ｍリン酸ナトリウムと純水で洗浄後、低圧水銀灯で１〜
２時間紫外線滅菌した後、細胞培養に供する。

本発明の細胞培養床は１種々の細胞の培養に用いること
ができる。ここに細胞の種類は特に限定されるものでは
ないが、ヒト子宮ガン細胞）（ｅＩ、ａ、チャイニーズ
ーハムスター肺細胞Ｖ　−７９、ヒト胎児肺細胞ＭＲＣ
−５，チンノぐンジー肝繊維芽細胞、ヒト包皮細胞、ニ
ワトリ胎児繊維芽細胞などを挙げることができる。

まだ１本発明の細胞培養床は種々の細胞培養液を用いて
種々の条件下で細胞を培養できる。

ここに、細胞培養液および培養条件は特に限定されるも
のではないが、細胞培養液としては。

１〜３０％（Ｖ／Ｖ）の子牛血清まだは牛脂児血ｍ　ヲ
含ｔｒミニマルーエノセン７ヤル培地（ｍｉｎｉｍａｌ
　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　：汎用細胞培養
用基礎培地）や１〜３０％（Ｖ／Ｖ）の子牛血清または
牛胎児血清を含むダルベツコ変法イーグル培地などを例
示することができ、培養条件としては、２〜５％（Ｖ／
Ｖ）程度の炭酸ガス雰囲気中、３５〜４０℃程度、好ま
しくは３６〜３８℃の培養条件を例示することができる
。

以下実施例により具体的に説明する。

実施例１゜ 脱脂した８Ｍ尿素水溶液の中に１石油エーテルおよびエ
チルアルコールで脱脂しだメリノ６４’　Ｓ　ｈＪｆ羊
毛１７ｇと２−メルカプトエタノール１　ｍｌを加え、
水酸化カリウムでｐ　Ｈ１０，５とした。窒素気流下、
室温で３時間９弱くかきまぜた。この結果、９８２ｍｇ
の羊毛由来のタン／Ｘり質が抽出された。次いで不溶物
を除去した後。

セファデック、７．０−２５　（５ｅｐｈａｄｅｘＧ−
２５゜架橋デキストランより成るゲルりロマトグラフィ
ー用担体、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ社製品）を用いたクロマトグラフィーにより抽
出物溶液の溶媒をｐＨ７の２０　ｍ　Ｍ　ＩＪン酸ナナ
トリウム水溶液置換し、羊毛由来のタン・；り質の濃度
が０．２５％（ｗ／ｌの溶液を得た。

この溶液をポリスチレン製シャーレに流し込み室温で３
０分間放置した後、ピペットを用いて溶液が薄くシャー
レ表面を濡らす程度を残して吸い取った。シャーレを空
気中に１２時間放置し、シャーレ表面に残る羊毛由来の
タンパク質を架橋した。このシャーレをｐＨ７の１００
ｍＭリン酸ナトリウムと蒸留水で洗浄し、自然乾燥した
後、紫外線殺菌してＨθＬａ細胞を培養した。培養液と
しては、１０％（Ｖ／Ｖ）子午面／Ｉ’ｆを含むミニマ
ルエンセンシャル培地を用い。

培養条件は５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガス雰囲気中。

３７℃とした。培養の結果、１００個の細胞がｌＯ日日
間２００．０００〜３００，０００個となり良好な増殖
が観察−された。

実施例２８ 石油エーテルおよびエチルアルコールで脱脂したメリノ
６４゛Ｓ種羊毛１．７ｇを、窒素気流下。

水酸化ナトリウムでｐＨ１０，５に調整したチオグリコ
ール酸水溶液（５０ｍｌｌ　）に０℃で１８時間浸した
。溶出した羊毛由来のタンパク質（成分１）を含有する
溶液をナイロンメツシュを用いて未溶解繊維より分離し
た。

さらに未溶解繊維を再び窒素気流下、水酸化ナトリウム
で１）　Ｈ１０，５に調整しだチオグリコール酸水溶液
５０ｍ１に０℃１８時間浸し、前記と同様に溶出した羊
毛由来のタンパク質（成分１）を含有する溶液を未溶解
繊維より分離した。次いで未溶解繊維を１００ｍ１の水
に懸濁し、ワーリングプレンダーで激しくかき回し、溶
出した羊毛由来のタンパク質（成分２）を含有する溶液
をろ紙を用いて未溶解繊維より分離した。以上により成
分ｌを２８４ｍｇおよび成分２を１２６０ｙＪ得だ。成
分１の溶液と成分２の溶液をさらに別々にセファデック
スＧ−２５を用いたクロマトグラフィーにより抽出物溶
液の溶媒をｐＨ７の２０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液に
置換し、羊毛由来のタンパク質の濃度が０．２５％（Ｗ
／Ｖ）の溶液を得た。この溶液をポリスチレン製シャー
レに流し込み室温で３０分間放置した後、ピペットを用
いて溶液が薄くシャーレ表面を濡らす程度を残して吸い
取った。シャーレをただちに窒素気流下に置き、１０Ｗ
の低圧水銀灯で４時間紫外線を照射し、シャーレ表面に
残る羊毛由来のタンパク質を架橋した。このシャーレを
ｐＨ７の１００ｍＭリン酸ナトリウムと蒸留水で洗浄し
、自然乾燥した後、紫外線殺菌してｖ−７９細胞を培養
した。培養液としては、１０％（Ｖ／ｌ牛脂児血清を含
むミニマルーエソセンゾヤル培地ヲ用い、　培養条件は
５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガス雰囲気中、３７℃とした。

培養の結果、成分１および成分２のいずれを用いても１
００個の細胞が７日間で４００．０００〜５００，００
０個となり、良好な増殖が観察された。

特許出願人 名称　日本合成ゴム株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 羊毛由来のタンパク質の架橋体により表面が形成されて
   いることを特徴とする細胞培養床。