JPS6016232B2 - アデノシントリリン酸再生産用酵素の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アデノシントリリン酸（以下ＡＴＰという。

）再生産用酵素の製造法に関するものである。近時、酵
素の触媒としてすぐれた性質、すなわち反応、基質、光
学的な特異性が高いことや反応条件が温和である点が注
目され、化学工業、食品、医療その他多くの分野への利
用が検討され、実施されている。

しかし、これらは現在のところ加水分解酵素の利用には
ほとんど限られている。しかるに、生体内においては、
主にＡＴＰをエネルギー源として利用して、多くの合成
酵素により生合成が行なわれている。この際、エネルギ
ー源として用いられたＡＴＰは、アデノシンジリン酸（
以下ＡＤＰという。）に変換されることになる。そこで
、従来の加水分解酵素の利用から脱却し、酵素の工業的
利用を広げるため、上記生体内で行なわれていると同様
な生合成を生体外において目ざそうとする全く新しい生
産システム、すなわち一般に、バイオリアクターと呼ば
れているシステムを創造することが試みられて来ている
。そのようなバイオリアクターを完成、実施するために
は、エネルギー源として多量のＡＴＰが必要であり、か
つ使用したＡＴＰをＡＤＰより再生産することが必要で
ある。このような目的に沿って、ＡＤＰからＡＴＰを再
生産する方法としては、次式の反応を触媒するホスホト
ランスフェラーゼと総称される酵素の使用が考えられる
。（Ｒ〜■；高エネルギーリン酸化合物、ＲＨ：Ｒ〜■
の加水分解物を表わす。

）数あるホスホトランスフェラーゼのうちでも、■平衡
反応が、十分ＡＴＰ合成側に片よっていること、■リン
酸化合物Ｒ〜■が工業的に容易に、かつ安価に得られる
こと、■酵素標品が容易に十分に純粋になるか、あるい
は不純な場合にも、混在するＡＴＰ分解酵素や阻害物質
を含まないことが重要である。

このような条件をかなり満足する酵素としては、酢酸キ
ナーゼ（酵素番号２．７．２．１）がある。酢酸キナー
ゼは、その平衡反応がＡＴＰ合成側に約１２３音かたよ
っており、さらに、リン酸化合物Ｒ〜■であるアセチル
リン酸は工業的に容易に安価に得ることができ、上記条
件の■および■については十分に満している。しかしな
がら、従来知られている酢酸キナーゼはエシエリキア・
コリあるいはバチルス・ステアロサーモフィルス等から
得られているものであるが、この酢酸キナーゼを採取す
る方法は、酢酸キナーゼが菌体内酵素であるため菌体を
破壊して得た上燈から抽出する方法が一般であり、その
ため上澄には菌体由来の種々が混在し目的とする酵素の
分離精製は非常に困難である。

たとえば、ェシェリキア・コリから酢酸キナーゼを採取
する場合には、ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー、２１１巻、７３汀頁、１９５仏王に記載さ
れているように、粗分画抽出液を得たのち、さらにイオ
ン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、
ゲルクロマトグラフィ一、等露点電気泳動法のはん雑な
精製を行なっても通常は約３０％の純度までしか精製す
ることができなかった。特に等亀点電気泳敷法はスケー
ルアップが困難なため、酢酸キナーゼを大量に精製して
製造するには大きな障害であった。また、バチルス・ス
テアロサ−モフィルスから酢酸キナーゼを採取する場合
には、持関昭５２一２５０８８号やジャーナル・オブ・
バイオケミストリー、鶴巻、１９８頁、１９７８年に記
載されているように、菌体破壊後、ストレプトマイシン
による除核酸を行ない、得られた上燈を硫酸アンモニウ
ム塩折することにより粗酵素沈澱を得た後、ＤＥＡＥセ
ル。ースカラムクロマトグラフィー、ヒドロキシア／ぐ
タイトカラムクロマトグラフイー、ウルトロゲルカラム
クロマトグラフイー、ＤＥＡＥセフアデツクスカラムク
ロマトグラフイーなどをすべて行なう煩雑な工程を経て
精製が行なわれており、酢酸キナーゼの単位酵素あたり
の製造費が高く、バイオリアクターの工業的な展開に著
しい支障となっている。そこで、本発明者らは、これら
の観点から酢酸キナーゼを効率よく得ることは是非とも
必要なことであることから、簡単な精製操作で高純度の
酢酸キナーゼを効率よく得ることを目的として鋭意研究
した結果、特定の不水溶性の担体を用いて精製すると、
上記の目的がすべて達成されることを見し、出し、本発
明に到達した。

すなわち、本発明は、酢酸キナーゼを産出する微生物を
培養し、得られた培養物を一般式（１）（ただしＲ，，
Ｒ２は日原子またはＳ０３Ｎａ基から選ばれ、互に相異
なるもの、Ｒ３は水不溶性の高分子を表わす。

）で示される水不溶性の担体で処理して酢酸キナ−ゼを
該担体に吸着させ、次いで吸着させた酢酸キナーゼを溶
出させることを特徴とするアデノシントリリン酸再生産
用酵素の製造法である。

本発明に用いられる酢酸キナーゼを産出する微生物とし
ては、酢酸キナーゼ生産性を持つ微生物であれば、いか
なるものでも使用できる。

好ましい微生物としては、たとえば、バチルス・ステア
ロ サ ー モ フ イ ル ス （ Ｂａｃｍｕｓｓ
にａｒｏｔｈｒｍｏｐｈｉｌ船）やエシエリキア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｊｃｈｉａｃｏｌｉ）があげられる。特
に耐熱性酢酸キナーゼを産出するバチルス・ステアロサ
ーモフィルスが好ましい。これらの微生物を培養するに
は、たとえば、特開昭５２一２５０８８号公報に記載さ
れているように、グルコース、サツカ。ースまたはリン
ゴ酸などの炭素源および／またはべプトン、肉エキス、
アミノ酸などの窒素源、さらに必要ならば無機塩類およ
び／またはビタミンなどを含む通常の微生物の培養に使
用される培地条件下で培養すればよい。本発明における
一般式（１）で示される水不落性の担体とは、ブルー色
素と水不落性の高分子とを反応させた水に不溶性の化合
物をいい、この水不溶性の高分子としては、たとえばセ
ルロース、デキストラン、アガロース、デンプンなどの
多糖類の誘導体、ポリ酢酸セルロース、ポリビニルアル
コールの誘導体、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ
エチレン、ポリビニルクロライド、ポリ（メチルメタク
リル酸）ヱステル、ポリブデン、ポリベンテン、ポリビ
ニルデンクロライド、ポリアクリロニトリル、ポリメタ
クリル酸、ポリアクリル酸、ポリアミノスチレン、ポリ
ブタジェン、ポリィソプレソ、ポリマレィン酸モノェス
テル、架橋ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド
、ポリビニルアミン、ポリ（ジアルキルアミノェチルメ
タクリル酸ェステル）、ポリ（ジアルキルアミノメチル
スチレン）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルピ
ロリドン）、ポリアクリル酸無水物、ポリメタクリル酸
無水物、ポリマレィン酸無水物、ポリメタクリロニトリ
ル、ボリ（トリフルオロエチレン）、ポリ（テトラフル
オロエチレン）、ポリ（ジビニルベンゼン）、ポリ（Ｑ
ーメチルスチレン）、ポリ（Ｎービニルアミン）、ポリ
（テトラメチレングリコールジビニルエーアル）、ポリ
ビニルスルホン、ポリビニルスルホキシド、ポリアクロ
レイン、ポリメチルピニルケトンなどの不飽和炭素を含
む単量体からなる重合体、ポリフエニレンオキシド、ポ
リメチレンオキシド、ポリエチレンオキシド、ポリテト
ラメチレンオキシドなどのポリェーテル類、ポリアラニ
ン、ポリフェニルアラニンなどのポリベプチド類、ナイ
ロン一３、ナイロン一４、ナイ。

ンー５、ナイロン一６、ナイロン−７、ナイロン−１１
、ナイロン−１２、ナイロン一６，６、ナイロン一６，
１い ポリ（ｍーフエニレンーイソフタラミド、ポリ（
ｐ−フエニレンーテレフタラミド）などのポリアミド、
テレフタル酸、ィソフタル酸、アジピン酸、マレィン酸
、フマル酸、トリメリット酸などのポリカルボン酸と、
エチレングリコール、プ。ピレングリコール、ブチレン
グリコール、ベンタエリスリトール、ビスフエノールＡ
などのポリオールとから誘導されるポリエステル類、グ
リコール類、乳酸、ヒドロキシピリバリン酸などから誘
導されるポリエステル、ジメチルポリシロキサン、メチ
ルフエニルポリシロキサン、メチルビニルポリシロキサ
ン、シアノアルキルメチルポリシロキサン、フルオロア
ルキルメチルポリシロキサンなどのシリコンゴム、トル
エンジイソシアナート、キシレンジイソシアナート、フ
ヱニレンジイソシアナート、エチレンジイソシアナート
、ジフエニルメタンジイソシアナート、トルエントリイ
ソシアナートなどのポリイソシアナートと、ポリエチレ
ングリコール、ポリプロピレングリコール、両末端にＯ
Ｈ基を有するポリエステルなどのポリオールとから誘導
されるポリウレタン類、フェノールーホルムアルデヒド
樹脂、キシレンーホルムアルデヒド樹脂、尿素ーホルム
アルデヒド樹脂、メラミンーホルムアルデヒド樹脂など
のホルムアルデヒド樹脂、ポリィミド、ポリベンツィミ
ダゾール、ポリチアゾールなどの４員環を含むポリマー
、ポリカーボナート、ポリスルホンなどの合成ポリマー
およびガラス、アスベスト、クレイ、マィカ、ヒドロキ
シルアパタィト活性炭、シリカゲル、アルミナなどの無
機物の誘導体およびポリフオスフアゼンのような合成無
機ポリマーなどがあげられる。この一般式（１）で示さ
れる水不落・性の迫体の具体例として、たとえば、市販
のブルーセフア。

ーズやマトレツクス・フルーＡがあげられる。本発明に
おいて、上記の担体に酢酸キナーゼを吸着させることが
必要である。そのためには、培養物から菌体を集菌し、
その集菌した菌体をたとえば、フレンチプレス、マント
ンゴーリン、超音波、凍結融解、ダィノミル等で破砕し
て粗抽出液を得ればよいし、硫酸ストレプトマイシンま
たは硫酸プロタミン等で除核酸処理した除核酸抽出液、
硫酸アンモニア、アセトン等で分画した粗分画抽出液さ
らにはイオン交換クロマトグラフィーや吸着クロマトグ
ラフィー等により前処理した前分画抽出液であってもよ
い。この抽出液と上記の担体とを単に混合するかあるい
はカラムに充填した上記の担体に通液して酢酸キナーゼ
を吸着させることができる。次に、本発明においては吸
着させた酢酸キナ−ゼを溶出させることが必要である。

そのためには、まず、酢酸キナーゼの吸着した担体を緩
衝液で洗浄し、狸体に吸着しない抽出液中の爽雑タンパ
クを除くことが望ましい。この際、吸着した酢酸キナー
ゼが溶出しない条件を選ぶことが望ましい。そのために
は、緩衝液のイオン強度は０．００１からｏ．１５禾満
の範囲、好ましくは０．０１から０．１０さらに０．０
５から０．１０の範囲が最適である。次いで、このよう
にして洗浄した後、たとえば以下に述べる溶出液を用い
て酢酸キナーゼを溶出すればよい。溶出液としては、酢
酸キナーゼの活性が損なわれず、かつ担体から酢酸キナ
ーゼが溶出しうるものであればいかなるものでもよいが
、その中でも酢酸キナーゼが特異的に溶出する、１０の
ＭのＡＴＰを含有する緩衝液、１０のＭのＡＴＰと１０
０のＭの塩化カリウムとを含有する緩衝液、ｌｏｗＭの
ＡＴＰと１００ｍＭの塩化ナトリウムとを含有する緩衝
液が好ましく、さらにバチルス・ステアロサーモフイル
スを用いる場合には、２のＭのＡＴＰと１仇Ｍのフルク
トースー１．６−ジリン酸とを含有する緩衝液が好まし
い。この緩衝液のｐＨは５〜ｌｕ好ましくは６〜９、特
に７〜９が好ましい。また、溶出させる方法としては緩
衝液を一度に加える、いわゆる回分式溶出法でもよいし
、あるいは緩衝液の濃度を連続的に上昇させて溶出させ
る、いわゆる濃度勾配溶出法でもよい。本発明によれば
、等軍点電気泳動法を用いずに、さらに従釆のクロマト
グラフィーのうち、いくつかを省略して高純度の酢酸キ
ナーゼを効率よく得ることができ、精製に要する時間を
大中に短縮することができる。

次に本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例 １バチルス・ステアロサーモフイルＮＣＡ１５
０３の湿菌体５００夕を２倍量の１００のＭトリスー塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、ダィノミルを用いて
細胞を十分に破壊した後、遠心分離により細胞片を除去
し、酢酸キナーゼを含む粗抽出液を得た。

この粗抽出液を、あらかじめ５ｍＭ塩化マグネシウムと
１００ｍＭ塩化カルウムを含む５０ｍＭトリスー塩酸緩
衝液（ｐＨ８０）で平衡化したブルーセフアロース（フ
ァルマシア社製）をつめたカラムに通液した。粗抽出液
の通液後、上記緩衝液で未吸着の交雑タンパクなどを洗
浄した。ついで上記緩衝液と上記緩衝液に２ＷＨＡＴＰ
と２のＭフルクトースー１．６ージリン酸を含んだ緩衝
液で直線勾配の溶出を行なうと、ＡＴＰ濃度で約０．５
仇Ｍの近くに目的の酢酸キナーゼが溶出した。この画分
を補集し、３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）であら
かじめ平衡化したＤＥＡＥ−セフアデックスカラムに通
じ、３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）と、これに４
００のＭの塩化カリウムを添加した溶液との直線濃度勾
配による溶出を行なった。塩化カリウム濃度約１５０ｍ
Ｍの近くに目的の酢酸キナーゼが溶出した。このように
して得た酢酸キナーゼはアクリルアミドディスク電気泳
動で単一なバンドを与え、さらにウルトロゲルＡＣＡ私
クロマトグラフィーにおいても、分子量約１６方のとこ
ろに単一のピークを与え、ほぼ１００％の純度を有して
いる。

また、収量は約３０の９で、酵素Ｉｍｐ当り約１，５０
山単位の力価を示している。このように従釆に比べ高収
率なものが得られ、精製のための操作は大中に軽減され
た。実施例 ２ ェシェリキア・コリから得られた市販の粗酢酸キナーゼ
標品５，００山単位（純度はアクリルアミドディスク電
気泳動法により検定した結果、約３０％であった）を２
０ｍＭィミダーゾールー塩酸、５ｍＭ塩化マグネシウム
、２ｍＭメルカプトェタノールよりなる緩衝液に対して
透析した。

この溶液をあらかじめ上記緩衝液で平衡化したマトレッ
クス・フルーＡ（アミコン社製）をつめたカラムに通し
１００ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾールー
塩酸、５のＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ〆ルカプトェタ
ノールよりなる緩衝液で洗浄した。ついで、洗浄した緩
衝液で食塩濃度を最終的に５００ｍＭとなるように直線
濃度勾配で溶出を行なうと、食塩濃度約３００ｍＭの近
くに目的とする酢酸キナーゼが溶出した。このようにし
て得た酢酸キナーゼは、アクリルァミドディスク電気泳
動法により検定した結果、純度９１％であり、回収され
た酢酸キナーゼは４８００単位であった。

実施例 ３／ゞチルス・ステアロサーモフイルスＡＴＣ
Ｃ７９５４の湿菌体ｌｋ９を２倍量の１００ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、フレンチプレスにて細
胞を破壊した後、遠心分離により不溶物を除去し、酢酸
キナーゼを含め粗抽出液を得た。

この抽出液６００私当り１０％硫酸ストレプトマイシン
溶液３００双‘添加後、生じた次でんを遠Ｄ分離で除去
し、除核酸後抽出液を得た。これに硫酸アンモニウム分
割をほどこし、３０％飽和（４℃）から４５％飽和（４
℃）の間の分割部を得た。この分割部を２０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）にとかした。次にあらかじめ２０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ
−セルロース樹脂と上記の溶液とを混合したのち沈でん
を渡８０した。この沈でんを１５０ｍＭ塩化ナトリウム
を含む上記緩衝液で洗浄した。めでんをさらに２５０ｍ
Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄し
、この櫨液を摘果した。この猿液を１００ｍＭ塩化ナト
リウム、５のＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭイミダ
ゾールー塩酸緩衝液に対して透析したのち、ブルーセフ
ァロースと３０分間混合した。この混合液を猿過し、枕
でんを上記緩衝液で洗浄後、１０のＭのＡＴＰを含む上
記緩衝液で洗浄した。後者の洗浄液を補集すると、目的
とする酢酸キナーゼが、７０，００の単位得られた。引
続き、ウルトロゲルＡＣＡ３４ク。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酢酸キナーゼを産出する微生物を培養し、得られた
   培養物を一般式Ｉ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただしＲ＿１，Ｒ＿２はＨ原子またはＳＯ＿３Ｎａ基
   から選ばれ、互に相異なるもの、Ｒ＿３は水不溶性の高
   分子を表わす。 ）で示される水不溶性の担体で処理して酢酸キナーゼを
   該担体に吸着させ、次いで吸着させた酢酸キナーゼを溶
   出させることを特徴とすアデノシントリリン酸再生産用
   酵素の製造法。 ２ 酢酸キナーゼを産出する微生物がバチルス・ステア
   ロサーモフイラスである特許請求の範囲第１項記載の製
   造法。 ３ １０ｍＭのアデノシントリリン酸を含有する緩衝液
   で溶出させる特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ４ １０ｍＭのアデノシントリリン酸と１００ｍＭの塩
   化カリウムとを含有する緩衝液で溶出させる特許請求の
   範囲第１項記載の製造法。 ５ １０ｍＭのアデノシントリリン酸と１００ｍＭの塩
   化ナトリウムとを含有する緩衝液で溶出させる特許請求
   の範囲第１項記載の製造法。 ６ ２ｍＭのアデノシントリリン酸と１ｍＭのフルクト
   ース−１．６−ジリン酸とを含有する緩衝液で溶出させ
   る特許請求の範囲第１項または第２項記載の製造法。