JPS6018179A - 人工肝臓用材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、人工肝臓用材料に関し、更に詳しくは単離肝
細胞を固定化材料に包括固定した人工肝臓用料に関する
。

人工肝臓とは、肝機能の一部または全てを一時的に代行
させ、生体機能の維持および補充をはかる体外代謝装置
である。

急性肝不全の発症は、全国集計で年間１５〜２０万人と
いわれ、そのうち２０００〜３０００例が劇症化する。

末期症状の肝性昏睡に陥った場合、早くこの状態を脱し
なければ死に至る。食事がｒ法および薬物療法などのい
わゆる保存的療法のみでは、死亡率は８０〜９０％に達
する。肝臓が非可逆変化をきたしていない場合、患者に
人工肝臓を用いることにより、肝性昏睡起因物質の処理
促進、体内減少物質の補充、代謝異常の改善などを行わ
せ、失われた肝機能を代償させて昏睡からの回復および
延命をはかり、その間に再生能力の強い肝臓の機能を回
復させて救命することができる。

人工肝臓には、血中の有害物質の物理的除去、すなわち
解勇能を代行することを目的とした非生物学的人工肝臓
と、代謝合成まで含めた肝機能のほとんど全部を代行す
ることを目的とした生物学的人工肝臓がある。

非生物学的人工肝臓には、ＰＡＮ膜による血液透析、活
性炭による吸着などがある。これらは緊急時に使用でき
るという利点はあるものの、除去物質が非選択的である
ため、血液の正常成分まで除去する、代謝や合成ができ
ないという様な欠点がある。

肝臓のほとんどすべての機能を代行しうる人工肝臓をめ
るならば、素材を生物材料にめなければならない。しか
し、生物材料を用いると、免疫学的問題、機能維持、装
置の開発などの問題が生ずる。免疫学的問題については
、凍結保存可能なヒトの肝細胞を用いることが有効であ
るが、また肝細胞を包括することにより免疫学的問題を
排除出来る。機能維持については、肝細胞は接着するこ
とにより安定性が増大するから長期機能維持は可能であ
る。さらに、装置については、生物学的人工肝臓の目的
からみて透析効果のみにならないよう高密度肝細胞が要
求される。

そこで、単離肝細胞に注目し、肝細、胞の安定化、細胞
密度の上昇をはかるべく鋭意研究を行った結果、肝細胞
を固定化材料をこ包括固定することにより細胞密度が上
昇し、細胞が安定化されることを見い出し本発明を完成
するに至った。

すなわち、本発明の要旨は、単離肝細胞を固定化材料に
包括固定して成る人工肝臓用材料に存する。

肝細胞は、既知の方法で調製されたものが用いられ、凍
結肝細胞も用いることができる（たとえば水戸頂部ら、
人工臓器（］２＋、３９Ｍ１９８０）参照）。

単離肝細胞は、他の細胞に比べて非常に弱いため、固定
化に伴い細胞が損傷されやすい。従って固定化材料とし
ては、比較的穏やかな条件で細胞を固定化できる材料を
用いる必要がある。好ましい固定化材料の例として、コ
ラーゲン、フィブリン、アルギン酸Ｃａ、に−カラギー
ナン、寒天および低融点アガロースが挙げられるが、こ
れらに限定されるものではない。就中、フィブリンおよ
びアルギン酸Ｃａが、アンモニア除去能およびウレア合
成能の点で優れているので、特に好ましい。

包括固定化方法は、一般に固定化材ねと細、抱懸濁液を
混合し、適当な条件で培養することから成るが、詳細な
手順および条件は、固定化材料の種類により異なるので
後記実施例に詳述しである。

包括固定に用いる器具、材料等は、すべて滅菌したもの
を用い、固定化も無菌的に行う。

本発明の人工肝臓材料は、単離肝細胞を固定化材料に包
槓固定しているため、細胞の安定性が増大し、細胞密度
も高くなる。そして、細胞を接着させる必要がないから
緊急時の使用が可能となり、また機械的強度が得られ、
リアクターの作成が容易になる。さらに、高密度および
大量培養が可能となる、など多くの利点を有している。

次に参考例、実施例および試験例を示し、本発明を具体
的に説明する。

参考例 単離肝細胞の調整ニー 単離肝細胞は、Ｂｅ　ｒ　ｒ　ｙとＦｒ　ｉ　ｅｎｄ　
のコラゲナーゼ血流法を主体として調整した（　Ｂｅｒ
ｒｙ、　Ｍ、Ｗ、５ＦｒｉｅｎｃＬＤ、Ｓ、、Ｊ、Ｃｅ
１１．Ｂｉｏｌ、、４３　＋５０６　（１９６９）参照
）。

ＳＤ系雄性ラット（２００〜３５０ｉに、５０り／　Ｋ
ｇのベンドパルビタールＮａを腹腔的注射し、麻酔下で
開腹した。門脈に糸のループをかけ、門脈の下部を鉗子
で止め、眼科用ハサミで門脈を切り、カニユーレ（Ｈｉ
ｂｉｋｉ　ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｃｕｂｉｎｇ　
５ｉｚｅ７）を入れ、ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＨＡＮＫＳ　
Ｃａ２＋ｆｒｅｅ　５ｏｌｕｔｉｏｎ（組成は第１表参
照）を約２Ｑ　７／　ｒｎｌｎ　で流し込むと同時に工
大動脈を切断し脱面させた。カニユーレを糸で縛り、そ
の状態でラットから肝臓を取り出し循環装置にのせ、そ
の後チユーブ内液量を含めて最終濃度が０．０５％コラ
ゲナーゼ（ｓ　ｉ　ｇｍａ”ＹＰｅｌ）・５ｍＭ塩化カ
ルシウムになるように液を加えた。−Ｉ−ＩＡＮＫＳ液
を２５　ｍｌ／＃Ｒで１５分から２０分潅流させ、肝臓
表面から液が浸出した時、層流を中止した。なお、　Ｈ
ＡＮＫＳ液は肝臓が３７°Ｃに保温できるように適当な
温度（４２〜４５°Ｃ）に保ち、ｐＨ増加を避け、酸素
供給をするために、ＣＯ５％、０２９５％の混合ガスで
バブリングした。消化した肝臓を１００ｍ／のビーカー
に移し、残っている酵素液を入れ、ハサミで大きく切り
、５００ｍ／のマイヤーに移し、ＨＡＮＫＳ液を入れ全
量を約１００ｍＪ＋こし、３７°Ｃて１０分間約１００
ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎで、０２９５％、Ｃ，０２５％
の混合ガスを通気しながらインキュベーションし、その
後、氷で充分冷した後、１５０メツシユのふるいで沖過
し、６ｏ　ｏ　ｒＰｍで３０秒間０°Ｃで遠心した。沈
澱にＩ−ＩＡＮＫＳ液を加え遠心洗浄を行い、最後にＷ
Ｅ培地（Ｗｉ　Ｉｌｉａｍｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ、組成
は第２表参照）で遠心洗浄し、細胞を１００＋＋＋ｔの
ＷＥ培地に懸濁し単謙肝細胞液とした。なお、６００　
ｒＰｍ、３０秒の遠心条件では実質細胞のみが下におち
る。

顕微鏡観察では、はとんどが′１個ずつの細胞になって
おり、実質細胞であった。

第１表　つづき 第２表（つづき） 第２表（つづき） 第２表（つづき） 注１）本発明では、ウシ血清（ｆａｔａｌ）　１０％、
インシュリン１０−６Ｍ、デキサメタシン１０−５に、
ペニシリン１００Ｕ／πｌ、ストレプトマイシン１００
μｇ／πｔおよびファンジゾン０．２５μｇＡｔｔｌを
加えた。

実施例１ 単離細胞の包括固定： 参考例で調整した肝細胞を、コラーゲン、フィブリン、
ア゛ルギン酸Ｃａ’、に一カラギーナン、寒天および低
融点アガロースに包括固定した。

器具、材料等はすべて滅菌して用い、固定化は無菌的に
行った。以下の各分量はシャーレ（直径３．５Ｇ）１枚
あたりの量を示し、肝細胞は１．２８×１０６個ずつと
なるように予め細胞濃度を調節して用いた。

コラーゲンへの固定 ０．３％コラーゲン溶液（高研株式会社）０．９ｍｌお
よび０．２　ＭＮａＨＰＯ４／１．３　ＭＮａＣ４０，
０７６ｍｌを４°Ｃに冷却しながら混合した。混合物に
肝細胞懸濁液０．１　ｍｌを加え、穏やかに手やく混合
した。

フィブリンへの固定 ５係フイブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ　［ｒａｃｔｉｏｎ
　Ｊ、）注） （５ｒｎ　Ｍ　Ｃａ　Ｃ（１２、ＰＢＳ（−１溶液）０
．’５＋ｙｔおよび肝細胞懸濁液０．５　ｍｌを４°Ｃ
に冷却しながら混合し、次いで２５１Ｕ／ｒＢｌ　）ロ
ンビン０．０９　ｍｌを加え、放置した。

３％アルギン酸ＮａのＰＢＳｆ−１庄）溶液０．５　ｒ
ａｔおよび肝細胞懸濁液０．５　ｍｌを４°Ｃに冷却し
ながら混合し、注射器を用いて２０Ｇの針から等張Ｃａ
　Ｃ４２溶液中に１滴ずつおとした。

２．５％Ｉ（−力ラギーナン１耐および肝細胞懸濁液０
．２５πｔを３７°Ｃ付近で混合し、すみやかに氷冷し
た。

寒天への固定 ２．５％寒天０．７５　ｍｌおよび肝細胞懸濁液０．２
５ｍ１を３７°Ｃ付近で混合し、すみやかに氷冷した。

低融点アガロースへの固定 ２．５外低融点アガＤ−ス（ＢＲＬ　Ｉｎｃ　）０．７
５πｌおよび肝細胞懸濁液０．２５　ｍｌを３５°Ｃ付
近で混合し、すみやかに氷冷した。

注）ＰＢＳ＠の組成は次の通りである：成分　１１９／
（Ｉ ＮａＣ／　８０００．０ Ｉ（ＣＪＩ？　２００．Ｏ Ｎａ　ＨＰＯ’　１１’５．０ 　４ ＫＨ２ＰＯ４２００，０ なお、対照の為、肝細胞懸濁液１ｍｌのりをシャーレに
入れ９．接着培養した。

培養はいずれも、添加物（２，５ｒｎ　Ｍ　ＮＨ４Ｃｌ
　）入りＷＥ培地ＩＦＩＩｔを入れたシャーレに上記の
肝細胞と固定化材料の混合物を加え、３７°ＣでＣＯ２
インキユベータ内で行った。サンプリング毎に培地交換
した。

培養物のアンモニア除去能は、アンモニアを奥田−藤井
の直接法（奥田拓道ら、最新医学、２１．６２２（１９
６６））に準じ、生成したインドフェノールを６２０ｎ
ｍで比色定量して評価した。

尿素合成能は、ジアセチルモノオキシム法を用い、黄色
の発色を４８ＯｎｌＴＩて比色定量した。

結果を第３表に示す。

第３表（つつき） なお、第３表の数値は、３回の実験の結果の平均であり
、シャーレ接着培養の結果を１００％として相対的に示
したものである。

実施例２ 長期安定性試験ニー 直径６　ｏｎのシャーレを用い、肝細胞量（ゲル）およ
び培地量をともに３−とする以外は実施例１と同様の手
順により肝細胞をアルギン酸Ｃａに包括固定した。

固定化後、ＦＡ加物（２，５ｍＭ　ＮＨ４Ｃ（４，２，
５μｇ／ｄβインドール）入りＷＥ培地で洗浄し、同培
地３πｔずつを入れて３７°ＣにおいてＣ０２インキュ
ベーター内で培養した。サンプリングは、添加物入りＷ
Ｅ培地置換直後と３．６．９および１２時間後に行い、
サンプリング後は、添加物なしＷＥ培地で培養した。な
お、アンモニア、インドールの解毒能は、添加物入りＷ
Ｅ培地て０、■、対照トして、直径６ｃｍのシャーレに
細胞懸濁液（１，２８Ｘ　１０６ｃｅｌＩＳ／ｍｌ　）
　３ｍｌをまき、３７°ＣにおいてＣＯ２インキユベー
タ内で２４時間接着させた後、固定化の場合と同様にサ
ンプリングした。

アンモニア除去量は実施例１に記載の方法により定量し
た。結果を第１図に示す。

アルギン酸Ｃａ包括固定培養およびシャーレ接着培養と
もに全培養期間にわたりアンモニア除去活性が維持され
ていた。

ウレア合成能は実施例１に記載の方法によりｔ（１定し
た。結果を第２図に示す。

両培養系ともに全培養期間にわたりウレア合成能が維持
されていた。

インドール除去能は、トルエンにより抽出した後、Ｐ−
ジメチルアミノベンズアルデヒドとインドールが縮合し
て呈する赤色を５７　Ｑ　ｎｍで比色定置した（神前三
部、人工臓器６．４６６（１９７７）参照）。結果を第
３図に示す。

インドキシル硫酸抱合能は、ｏｂｅｒｍａｙｅｒ試薬を
加え、クロロホルムで抽出し、生じた青色のインジゴを
５９５　ｎｍで比色定置した（分析化学便覧（日本分析
化学金網）第３版１３７９頁参照）。

結果を第４図に示す。生成量はインドール減少量の約５
０％で文献値（佐藤了、薬物代謝（講談社）２０９頁参
照）とよく一致していた。

実施例３ 細胞密度を１．２８　Ｘ　１０６ｃｅｌｌｓ／＋ｙ　ｇ
ｅｌｌの３倍および１０倍密度とする以外は実施例１と
同様の手順により肝細胞をアルギン酸Ｃａに包括固定し
た。

培養は、シリコナイズした１８φ試験管にゲル１ｍｌと
添加物（２，５ｍＭＮＨ４Ｃ（１）入りＷＥ培地１πｔ
を入れ、シリコン栓をして、３７°Ｃの恒温室内でＩ　
Ｑ　Ｑ　ｏｓｃＨ１ａｔｉｏｎ／ｇｉで振とう培養した
。

結果を第４表に示す。

第４表 １０倍での活性が１０倍まで上らないのはｏ２２定によ
るものと考えられる。

【図面の簡単な説明】

箔１〜４図は、実施例２におけるアンモニア除去量、ウ
レア合成量、インドール除去量およびインドキシル硫酸
抱合能をそれぞれ示すグラフである。 特許出願人　三　浦　喜　温

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、単離肝細胞を固定化材料に包括固定して成ることを
   特徴とする人工肝臓用材料。 ２、固定化材料が、コラーゲン、フィブリン、アルギン
   酸Ｃａ、に−カラギーナン、寒天または低融点アガロー
   スである特許請求の範囲第１項記載の人工肝臓用材料。 ３、固定化材料が、フィブリンまたはアルギン酸Ｃａで
   ある特許請求の範囲第２項記載の人工肝臓用材料。 ４、単離肝細胞が、コラゲナーゼ処理１区後のもの田