JPS60188075A - ウイルス性転写促進配列 - Google Patents
ウイルス性転写促進配列Info
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- JPS60188075A JPS60188075A JP59044437A JP4443784A JPS60188075A JP S60188075 A JPS60188075 A JP S60188075A JP 59044437 A JP59044437 A JP 59044437A JP 4443784 A JP4443784 A JP 4443784A JP S60188075 A JPS60188075 A JP S60188075A
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- Japan
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- dna
- gene
- virus
- transcription
- cells
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒトを起源とする野生型ウイルスおよびその
各種変異型ウイルスより得られるウイルスＤＮＡ初期遺
伝子上流に存在する塩基配列に関する。
各種変異型ウイルスより得られるウイルスＤＮＡ初期遺
伝子上流に存在する塩基配列に関する。
更に詳しくは、ヒトのＢＫウィルスの野生株およびその
変異株（国立予防衛生研究所より分与さる）より単離さ
れた、それぞれ固有の塩基配列であシ、更にこれを目的
遺伝子に連結させ、動物細胞内において、その遺伝子の
転写活性を数１０倍に促進増強し、遺伝子産生量を増加
せしめる転写促進配列に関する。
変異株（国立予防衛生研究所より分与さる）より単離さ
れた、それぞれ固有の塩基配列であシ、更にこれを目的
遺伝子に連結させ、動物細胞内において、その遺伝子の
転写活性を数１０倍に促進増強し、遺伝子産生量を増加
せしめる転写促進配列に関する。
最近、遺伝子発現における研究過程において、転写に必
要なりＮＡ領域が注目を集めている。
要なりＮＡ領域が注目を集めている。
Ｃｈａｍｂｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ、 ２９０．５０４．’
＋ ９８１ ；Ｐｒｏｃ、 ＮａｔｌＡｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、 ＵＳＡ、 ７７、３８９８．１９８０）や５ｃ
ｈａｆｆｎｅｒ（ＣｏＩ２．２７．２９９．１９８１；
Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄ、 Ｒｅｅ、 ９゜６２５１＋１
９８１）等は、それぞれサルのＳＶ４０ウィルスやマウ
スポリオーマウィルスより分離された、ウィルスＤＮＡ
のブロモ−ター近傍のあるＤＮＡ断片につき、それらの
作用を解析し、このようなりＮＡ断片を他の遺伝子と連
結°してやると、その遺伝子の転写活性が著しく増強さ
れることを明らかにした。この遺伝子は、その効果が連
結する方向性や連結遺伝子との距離及び遺伝子の種類と
は無関係に現われることから転写促進配列（ｅｎｈａｎ
ｃｅｒ）と名付けられた。
＋ ９８１ ；Ｐｒｏｃ、 ＮａｔｌＡｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、 ＵＳＡ、 ７７、３８９８．１９８０）や５ｃ
ｈａｆｆｎｅｒ（ＣｏＩ２．２７．２９９．１９８１；
Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄ、 Ｒｅｅ、 ９゜６２５１＋１
９８１）等は、それぞれサルのＳＶ４０ウィルスやマウ
スポリオーマウィルスより分離された、ウィルスＤＮＡ
のブロモ−ター近傍のあるＤＮＡ断片につき、それらの
作用を解析し、このようなりＮＡ断片を他の遺伝子と連
結°してやると、その遺伝子の転写活性が著しく増強さ
れることを明らかにした。この遺伝子は、その効果が連
結する方向性や連結遺伝子との距離及び遺伝子の種類と
は無関係に現われることから転写促進配列（ｅｎｈａｎ
ｃｅｒ）と名付けられた。
本発明の転写促進配列は、現在知られているＳＶ４０ウ
ィルス、ポリオーマウィルス等のＤＮＡよシ単離された
転写促進配列とは全く異なった性質、塩基配列を有する
新規なものである。
ィルス、ポリオーマウィルス等のＤＮＡよシ単離された
転写促進配列とは全く異なった性質、塩基配列を有する
新規なものである。
本発明の転写促進配列は、修飾された蛋白質、例えばグ
リコジル化されたγ−インターフェロン、インターロイ
キン■によって代表される各種リンフ才力イン等の蛋白
質性生理活性物質を真核細胞を利用して発現または産生
させる際に特に重要である。
リコジル化されたγ−インターフェロン、インターロイ
キン■によって代表される各種リンフ才力イン等の蛋白
質性生理活性物質を真核細胞を利用して発現または産生
させる際に特に重要である。
今日まで、組み換えＤＮＡ技術の進歩にも拘らず、多く
の場合、上記の如き真核細胞性蛋白質の製造は原核細胞
性宿主中で行わざるを得なかった。
の場合、上記の如き真核細胞性蛋白質の製造は原核細胞
性宿主中で行わざるを得なかった。
原核細胞は真核細胞性蛋白質に糖質部分を正しく結合で
きない。従って組み換えＤＮＡ技術によシ修飾された蛋
白を製造する為には、真核細胞性化。
きない。従って組み換えＤＮＡ技術によシ修飾された蛋
白を製造する為には、真核細胞性化。
主が不可欠である。しかじ真核細胞は培養時において世
代の交代時間が長く目的物質の商業的生産には不適であ
る。
代の交代時間が長く目的物質の商業的生産には不適であ
る。
本発明の転写促進配列は上記の間＠を解決するものであ
る。すなわち真核細胞によシ目的物質を生産させる際に
、適当なベクターに目的物質産生遺伝子と共に本発明の
転写促進配列を組み込んだものを使用すると、目的物質
産生遺伝子のみを組み込んだベクターを使用するのに比
して数１０倍の生産増加を示す。
る。すなわち真核細胞によシ目的物質を生産させる際に
、適当なベクターに目的物質産生遺伝子と共に本発明の
転写促進配列を組み込んだものを使用すると、目的物質
産生遺伝子のみを組み込んだベクターを使用するのに比
して数１０倍の生産増加を示す。
本発明の転写促進配列は更に以下に記す特徴を有してい
る。■遺伝子操作技術に適した比較的短い塩基配列であ
る。■目的ｉ伝子に対する連結方向はどちら向きでも転
写促進活性を発揮する。
る。■遺伝子操作技術に適した比較的短い塩基配列であ
る。■目的ｉ伝子に対する連結方向はどちら向きでも転
写促進活性を発揮する。
■遠く離れた遺伝子にも働き、組み込まれる位置はその
上流でも下流でもよい。■活性化する遺伝子は何んでも
よい。■宿主真核細胞の種類は問わず転写促進活性を発
揮する。
上流でも下流でもよい。■活性化する遺伝子は何んでも
よい。■宿主真核細胞の種類は問わず転写促進活性を発
揮する。
本発明の転写促進配列はヒトのＢＫウィルス（例えば野
生株ＷＴ５０１．変異株Ｐｍ４１１． Ｐｍ５２２゜Ｐ
ｍ ５２５等）より得られ、例えば制限酵素Ｈｉｎｄ
［１によシウィルスＤＮＡを切断することにより得られ
る。具体的に説明すると、ヒトのＢＫウィルス例えば変
異株Ｐｍ ５２５よシウィルスＤＮＡを抽出分離し、制
限酵素Ｈ１ｎｄ Ｉｌｌによって切断し、各断片を単離
後ＴＫ遺伝子と連結し、複合グラスミドＤＮＡ（ヘルペ
スジンプレックスｌウィルスＤＮＡのＴＫ遺伝子をｐＢ
Ｒ３２２に挿入したものを使用）としてリン酸カルシウ
ム法によりＴＫ遺伝子を真核細胞（ラット由来のＦ２４
０８ＴＫ−及びマウス由来のＬＴＫ−細胞）に導入して
発現量をＨＡＴ培地存在下で形成されるコロニー数を測
定することにより転写促進活性を持つ本発明の転写促進
配列が得られる。
生株ＷＴ５０１．変異株Ｐｍ４１１． Ｐｍ５２２゜Ｐ
ｍ ５２５等）より得られ、例えば制限酵素Ｈｉｎｄ
［１によシウィルスＤＮＡを切断することにより得られ
る。具体的に説明すると、ヒトのＢＫウィルス例えば変
異株Ｐｍ ５２５よシウィルスＤＮＡを抽出分離し、制
限酵素Ｈ１ｎｄ Ｉｌｌによって切断し、各断片を単離
後ＴＫ遺伝子と連結し、複合グラスミドＤＮＡ（ヘルペ
スジンプレックスｌウィルスＤＮＡのＴＫ遺伝子をｐＢ
Ｒ３２２に挿入したものを使用）としてリン酸カルシウ
ム法によりＴＫ遺伝子を真核細胞（ラット由来のＦ２４
０８ＴＫ−及びマウス由来のＬＴＫ−細胞）に導入して
発現量をＨＡＴ培地存在下で形成されるコロニー数を測
定することにより転写促進活性を持つ本発明の転写促進
配列が得られる。
上記の場合転写促進活性はＰｍ ５２５ウイルスＤＮＡ
のＨｉｎｄ ＩＩＩ切断々片Ａ （２，５Ｋ＋） ）
、 Ｂ （ｔ９ｘｂ）。
のＨｉｎｄ ＩＩＩ切断々片Ａ （２，５Ｋ＋） ）
、 Ｂ （ｔ９ｘｂ）。
Ｃ（０，５１Ｋ ｂ）及びＤ（（］、４２に１））のう
ちＣ断片に認められた。変異株Ｐｍ４１１． Ｐｍ５２
２及び野性株ＷＴ５０＋について上記と同様に転写促進
活性を調べると全てＨｉｎｄ ｍ切断４片のＣ断片に認
められた。そこで本発明の転写促進配列を仮にＨｉｎｄ
［１−Ｃと叶ぶことにする。
ちＣ断片に認められた。変異株Ｐｍ４１１． Ｐｍ５２
２及び野性株ＷＴ５０＋について上記と同様に転写促進
活性を調べると全てＨｉｎｄ ｍ切断４片のＣ断片に認
められた。そこで本発明の転写促進配列を仮にＨｉｎｄ
［１−Ｃと叶ぶことにする。
Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ −０のＤＮＡ断片ｆ：ｍ ｐ ８フ
アージＤ’ＮＡに組み込み、大腸菌ＪＭ１０１に感染さ
せて鋳型１本鎖ＤＮＡを作成し、ジデオキシ法（Ｓａｎ
ｇｅｒ、 Ｆ、。
アージＤ’ＮＡに組み込み、大腸菌ＪＭ１０１に感染さ
せて鋳型１本鎖ＤＮＡを作成し、ジデオキシ法（Ｓａｎ
ｇｅｒ、 Ｆ、。
Ｎ１ｃｋｌｅｎ、 Ｓ 、 ＆ Ｃｏｕｌｓｏｎ、 Ａ
、Ｒ，Ｐｒｏｃ 、 Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ 。
、Ｒ，Ｐｒｏｃ 、 Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ 。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ Ｚユ、５４６３．１９７７）によって
塩基配列を決定した。
塩基配列を決定した。
その結果野生株ＷＴ５０１．変異株Ｐｍ４１１．Ｐｍ５
２２及びＰｍ５２５のＨｉｎｄｌｌｌ−Ｃ！（仮に各々
ＷＴ５０１ Ｈｌｎｄｌｌｌ−Ｃ，Ｐｍ４１１ Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ−Ｃ，Ｐｍ５２２Ｈｉｎｄ １ｌｌ−Ｃ及びＰ
ｍ ５２５ Ｈｉｎｄ ［１−Ｃと名付けるンは全て
互いに異なった塩基配列を示し、また従来より知られて
いるサルＳＶ４０やマウスポリオーマウィルスＤＮＡの
転写促進配列とも塩基配列を異にし、各々全く新規な転
写促進配列であることがわかった。
２２及びＰｍ５２５のＨｉｎｄｌｌｌ−Ｃ！（仮に各々
ＷＴ５０１ Ｈｌｎｄｌｌｌ−Ｃ，Ｐｍ４１１ Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ−Ｃ，Ｐｍ５２２Ｈｉｎｄ １ｌｌ−Ｃ及びＰ
ｍ ５２５ Ｈｉｎｄ ［１−Ｃと名付けるンは全て
互いに異なった塩基配列を示し、また従来より知られて
いるサルＳＶ４０やマウスポリオーマウィルスＤＮＡの
転写促進配列とも塩基配列を異にし、各々全く新規な転
写促進配列であることがわかった。
また同様にＷＴ ５０１ Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｃ！、 Ｐ
ｍ ４１１ Ｈｉｎｄ■−Ｃ及びＰ ｍ ５２２ Ｈｉ
ｎｄ ｌ［−Ｃについて、前記う。
ｍ ４１１ Ｈｉｎｄ■−Ｃ及びＰ ｍ ５２２ Ｈｉ
ｎｄ ｌ［−Ｃについて、前記う。
トＦ ２４０８ＴＫ−及びマウスＬＴＫ−細胞を用い転
写促進活性を調べたところ約８〜２０倍の転写促進活性
であった。前記Ｐｍ ５２’５’Ｈｉｎｄ ｌ［−Ｃの
場合も約２０倍の転写促進活性を示した。
写促進活性を調べたところ約８〜２０倍の転写促進活性
であった。前記Ｐｍ ５２’５’Ｈｉｎｄ ｌ［−Ｃの
場合も約２０倍の転写促進活性を示した。
更に上記の実験結果よシ各Ｈ１ｎｄ ｉｌｌ −０は各
々塩基配列が異なるとともに宿主細胞に対する親和性が
異なる（すなわち導入する宿主細胞の種により転写促進
活性が異なる）ことが確認された。このことは目的遺伝
子の発現に適した真核性宿主細胞毎に本発明の転写促進
配列が選べることを示唆する。
々塩基配列が異なるとともに宿主細胞に対する親和性が
異なる（すなわち導入する宿主細胞の種により転写促進
活性が異なる）ことが確認された。このことは目的遺伝
子の発現に適した真核性宿主細胞毎に本発明の転写促進
配列が選べることを示唆する。
一方、従来より得られているサルＳＶ４０及びマウスポ
リオーマの転写促進配列は、それぞれの超厚宿主である
サル及びマウス細胞において特に高い転写促進活性を示
す（Ｎｕｃｌ 、 Ａｃ１ｄＲｅθ、註。
リオーマの転写促進配列は、それぞれの超厚宿主である
サル及びマウス細胞において特に高い転写促進活性を示
す（Ｎｕｃｌ 、 Ａｃ１ｄＲｅθ、註。
７９６５．１９８２）。このことは本発明のヒトＢＫウ
ィルスよシ作製した本転写促進配列が、ヒト細胞におい
て最も強力にその活性を発揮することを充分示唆してい
る。
ィルスよシ作製した本転写促進配列が、ヒト細胞におい
て最も強力にその活性を発揮することを充分示唆してい
る。
以上述べてきたことより本発明の転写促進配列は、比較
的短い、遺伝子操作に適した塩基配列であり、目的遺伝
子と連結した時のみ作用し、目的遺伝子に対する連結位
置及び方向には無関係にその促進活性を発揮し、目的遺
伝子の発現に適し′た真核宿主細胞に対して最適の転写
促進配列が選べる有用な塩基配列である。
的短い、遺伝子操作に適した塩基配列であり、目的遺伝
子と連結した時のみ作用し、目的遺伝子に対する連結位
置及び方向には無関係にその促進活性を発揮し、目的遺
伝子の発現に適し′た真核宿主細胞に対して最適の転写
促進配列が選べる有用な塩基配列である。
また、以上述べてきたことよシ明らかな如く、本発明の
転写促進配列は以下の実施及び参考例に拘束されるもの
ではない。
転写促進配列は以下の実施及び参考例に拘束されるもの
ではない。
実施例１
Ｈｉｎｄ ［１−Ｃの製造
１）ＢＫウィルスからＤＮＡの抽出
ヒト胎児腎細胞ＨＥＫで増殖させたＰｍ５２５ウイルス
粒子８×１０１２個にプロナーゼとＥＤＴＡを最終濃度
０１〜／−及び１０ｍＭになるように各各加えた。（最
終液量ｏ、 ａ ｍｌ）。３６℃にて１夜放置後、フェ
ノールを０，４−加えてよく混合し、１２．０００回転
で３分間遠心し、上澄液を別のチューブに移し取った。
粒子８×１０１２個にプロナーゼとＥＤＴＡを最終濃度
０１〜／−及び１０ｍＭになるように各各加えた。（最
終液量ｏ、 ａ ｍｌ）。３６℃にて１夜放置後、フェ
ノールを０，４−加えてよく混合し、１２．０００回転
で３分間遠心し、上澄液を別のチューブに移し取った。
この上澄液にクロロホルムを０．４ ｒｎｌ加え、フェ
ノールと同様に処理した。
ノールと同様に処理した。
再び上澄液を別のチーープに移し取り、５Ｍ酢酸ナトリ
ウムを４０μｇ加え、さらに冷エタノールをΩ、８−加
えて混合し、−２０℃に４時間放置後１２．０００回転
で５分間遠心し、上蛭液を完全に除去した。
ウムを４０μｇ加え、さらに冷エタノールをΩ、８−加
えて混合し、−２０℃に４時間放置後１２．０００回転
で５分間遠心し、上蛭液を完全に除去した。
以上の操作により、Ｐｍ５２５ウイルスＤＮＡが約４０
／ｉｇ得られた（第１図、（イ））。以後の実験はこれ
を蒸留水又はｊＫ緩衝液（１０ｍＭトリス噛Ｈｏｔ、ｐ
ｔ（８，０，１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解させて使用した。
／ｉｇ得られた（第１図、（イ））。以後の実験はこれ
を蒸留水又はｊＫ緩衝液（１０ｍＭトリス噛Ｈｏｔ、ｐ
ｔ（８，０，１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解させて使用した。
同様の方法によ’ｐＷＴ５０１．Ｐｍ４１１．及びＰｍ
５２２ウイルスからＩＩＮＡを抽出した。
５２２ウイルスからＩＩＮＡを抽出した。
２）ＢＫウィルスＤＩＪＡからＨｉｎａｌｌ−〇ＤＮＤ
の単離Ｐｍ５２５ウイルスから抽出したＤＮＡ５／ｉｇ
を反応液（１０ｍＭ）リス・Ｅｅｌ、 ｐＨ７，５、６
０ｍＭ ＩＪａＯｌ。
の単離Ｐｍ５２５ウイルスから抽出したＤＮＡ５／ｉｇ
を反応液（１０ｍＭ）リス・Ｅｅｌ、 ｐＨ７，５、６
０ｍＭ ＩＪａＯｌ。
６ｍＭ ＭＹＣ１２，１ｍＭジチオスレイト−＃ ）
１００μｅ中で制限酵素１（ｉｎａ １［（宝酒造■製
）５ユニツト（５ｕ）と３７℃、２時間反応させ、続い
て低融点の１％寒天ゲル（Ｏ，５１１ｇ／−のエチジウ
ムブロマイドを含む）で５０ｍＡ、約６時間電気泳動し
た。暗室でＩＪ４照射することにより４本のバンドを確
認し、陰極側から分子サイズの大きい順にＨｉｎｄｌｌ
ｌ−Ａ、 Ｂ、 Ｏ及びＤと名付けたＤＮＡ断片を含む
ゲルのうち、Ｈｌｎｄ［［−０ＤＮＡ断片のみを含むゲ
ルを切シ出し、６５℃で加熱して寒天を溶かした後、Ｔ
ＩＪＩＩ衝液１００．μｌｆ加え、更に等量のＴＫ緩衝
液飽和フェノールで充分混合し、＋２．０００回転で３
分間遠心した。上層の水溶液層を別のチユーブに移し取
り、フェノール処理をさらに２回繰り返した。別のチュ
ーブに移し取った水溶液層にに容量の６Ｍ酢酸ナトリウ
ムを加え、さらに２倍量のエタノールを加えて混合し、
−２０℃に４時間放置した。次いで１２，０００回転で
５分間遠心し、上澄液を取シ除いた後８０％冷エタノー
ル１００μｌを静かに加え、１２，０００回転６分間遠
心分離した。上澄液をできるだけ除去し、沈殿物（ＤＮ
Ａ ）を蒸留水１０μｇに溶かした。
１００μｅ中で制限酵素１（ｉｎａ １［（宝酒造■製
）５ユニツト（５ｕ）と３７℃、２時間反応させ、続い
て低融点の１％寒天ゲル（Ｏ，５１１ｇ／−のエチジウ
ムブロマイドを含む）で５０ｍＡ、約６時間電気泳動し
た。暗室でＩＪ４照射することにより４本のバンドを確
認し、陰極側から分子サイズの大きい順にＨｉｎｄｌｌ
ｌ−Ａ、 Ｂ、 Ｏ及びＤと名付けたＤＮＡ断片を含む
ゲルのうち、Ｈｌｎｄ［［−０ＤＮＡ断片のみを含むゲ
ルを切シ出し、６５℃で加熱して寒天を溶かした後、Ｔ
ＩＪＩＩ衝液１００．μｌｆ加え、更に等量のＴＫ緩衝
液飽和フェノールで充分混合し、＋２．０００回転で３
分間遠心した。上層の水溶液層を別のチユーブに移し取
り、フェノール処理をさらに２回繰り返した。別のチュ
ーブに移し取った水溶液層にに容量の６Ｍ酢酸ナトリウ
ムを加え、さらに２倍量のエタノールを加えて混合し、
−２０℃に４時間放置した。次いで１２，０００回転で
５分間遠心し、上澄液を取シ除いた後８０％冷エタノー
ル１００μｌを静かに加え、１２，０００回転６分間遠
心分離した。上澄液をできるだけ除去し、沈殿物（ＤＮ
Ａ ）を蒸留水１０μｇに溶かした。
以上の方法により約０．４Ｒのｐｍ５２５ウィルスのＨ
ｌｎｄｌ［１−ＣＤＮＡ断片（Ｐ ｍ ５２５ Ｈｉｎ
ｄ ［１−Ｃ）を得た。（第１図、（ロ）） 全く同様の方法によシＷＴ５０１．Ｐｍ４１＋及びＰｍ
５２２ウイルスＤＮＡよシ各々のＨｉｎｄ １ｌｌ−Ｃ
ＤＮＡ断片（ＷＴ５０１１（ｉｎｃｌｌ［−Ｃ！、 Ｐ
ｍ４ ＋ ＋Ｈｉｎｄ［１−０及びＰｍ５２２Ｈｉｎｄ
１１１−Ｃ）を得た。１実験例１ ＢＫウィルスＤＮＡのＨｉｎｄｌｌ−ＯＤ Ｎ Ａ断片
の塩基配列の決定 実施例１により得たＰｍ５２５Ｈｉｎｃｌｌｌｌ−ＣＤ
ＮＡ断片５０ ｎｇを、反応液（５０ｍＭ）リス−ＨＣ
ｌ 。
ｌｎｄｌ［１−ＣＤＮＡ断片（Ｐ ｍ ５２５ Ｈｉｎ
ｄ ［１−Ｃ）を得た。（第１図、（ロ）） 全く同様の方法によシＷＴ５０１．Ｐｍ４１＋及びＰｍ
５２２ウイルスＤＮＡよシ各々のＨｉｎｄ １ｌｌ−Ｃ
ＤＮＡ断片（ＷＴ５０１１（ｉｎｃｌｌ［−Ｃ！、 Ｐ
ｍ４ ＋ ＋Ｈｉｎｄ［１−０及びＰｍ５２２Ｈｉｎｄ
１１１−Ｃ）を得た。１実験例１ ＢＫウィルスＤＮＡのＨｉｎｄｌｌ−ＯＤ Ｎ Ａ断片
の塩基配列の決定 実施例１により得たＰｍ５２５Ｈｉｎｃｌｌｌｌ−ＣＤ
ＮＡ断片５０ ｎｇを、反応液（５０ｍＭ）リス−ＨＣ
ｌ 。
ｐＨ７，５，２０ｍＭＭｙＣｔ２．１ ｍＭＡＴＰ 、
５ｍＭジチオスレイトール）１０μｅ中でＩ（ｉｎｄ
［１で開裂した２本鎖ｍｐ８ファージＤ ’Ｎ Ａ
（アマージャム社のクローニング用キット）２１９と共
に、Ｔ４ＤＮＡリガＴゼ（全酒造■製）１ユニツトを用
いて１４℃３時間反応させた。この反応によりＨｉｎｄ
ｌｌｌ−ＣＤ’ＮＡ断片をｍｐ８ファージＤＩＪＡのＨ
ｉｎｄ■部位に挿入した組み換えＤＮＡを得た。続いて
０ａＯ６２法（Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｆｉ、 Ｆ
、 Ｆｒ１ｔｓｃｈ 、 Ｊ。
５ｍＭジチオスレイトール）１０μｅ中でＩ（ｉｎｄ
［１で開裂した２本鎖ｍｐ８ファージＤ ’Ｎ Ａ
（アマージャム社のクローニング用キット）２１９と共
に、Ｔ４ＤＮＡリガＴゼ（全酒造■製）１ユニツトを用
いて１４℃３時間反応させた。この反応によりＨｉｎｄ
ｌｌｌ−ＣＤ’ＮＡ断片をｍｐ８ファージＤＩＪＡのＨ
ｉｎｄ■部位に挿入した組み換えＤＮＡを得た。続いて
０ａＯ６２法（Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｆｉ、 Ｆ
、 Ｆｒ１ｔｓｃｈ 、 Ｊ。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ ； Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｏｌｏｎ
ｉｎｇ、 ｐ ２５０ 、 ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｕｒ Ｌａｂ、、 １９８２ ）によシ得ｆｃｏ
ａ”処理大腸菌ＪＭ＋０１にｃａｚ＋の存在下に上記Ｄ
ＮＡた。このようにして調製した形質転換菌に、５−プ
ロモー４−クロロ−６−インドリル−β−ガラクトシド
（２０■／ｒｎｌの濃度でジメチルホルムアミドに溶解
）２５μｅ、インプロピル−β−Ｄ−チオーガラクトピ
ワノシド（２５ｒｒｓ；ｔ／ｍｅ、、 ’Ｉ（２０）２
５μｇ、及び対数増殖期の大腸菌Ｊ Ｍ ｉ ０１２０
０ ／ｄを混合し、５０℃に保温したＨ上層寒天（トリ
プトン１０ ？ 、ＮａＣ４ｔ８ ？、寒天６９／ｌ）
５ｍｌを加えよく混合した後、Ｈ寒天プレート（トリプ
トン１０ｒ、ＮａＣ４８Ｓ’、寒天１２ｆ／ｌ）にまい
た。１夜培養すると青色プラークと無色プラークが生じ
る。
ｉｎｇ、 ｐ ２５０ 、 ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｕｒ Ｌａｂ、、 １９８２ ）によシ得ｆｃｏ
ａ”処理大腸菌ＪＭ＋０１にｃａｚ＋の存在下に上記Ｄ
ＮＡた。このようにして調製した形質転換菌に、５−プ
ロモー４−クロロ−６−インドリル−β−ガラクトシド
（２０■／ｒｎｌの濃度でジメチルホルムアミドに溶解
）２５μｅ、インプロピル−β−Ｄ−チオーガラクトピ
ワノシド（２５ｒｒｓ；ｔ／ｍｅ、、 ’Ｉ（２０）２
５μｇ、及び対数増殖期の大腸菌Ｊ Ｍ ｉ ０１２０
０ ／ｄを混合し、５０℃に保温したＨ上層寒天（トリ
プトン１０ ？ 、ＮａＣ４ｔ８ ？、寒天６９／ｌ）
５ｍｌを加えよく混合した後、Ｈ寒天プレート（トリプ
トン１０ｒ、ＮａＣ４８Ｓ’、寒天１２ｆ／ｌ）にまい
た。１夜培養すると青色プラークと無色プラークが生じ
る。
Ｐｍ５２５Ｈ１ｎｄｌｌ−ＣＤ Ｎ Ａ断片が組み込ま
れたＤＮＡを持つファージの存在する無色プラークを滅
菌ピペットで吸いとシ、培養液ｔ ｓ ｍＪ’（＋夜培
養したＪＭｌｏｌを２倍のＴＹ（バクトドリプトン８２
、イーストエキストラクト５ｒ、ＮａＣ４２，５２／ｌ
）で１００倍に希釈したもの〕に接種した。
れたＤＮＡを持つファージの存在する無色プラークを滅
菌ピペットで吸いとシ、培養液ｔ ｓ ｍＪ’（＋夜培
養したＪＭｌｏｌを２倍のＴＹ（バクトドリプトン８２
、イーストエキストラクト５ｒ、ＮａＣ４２，５２／ｌ
）で１００倍に希釈したもの〕に接種した。
３７℃で４〜５時間振盪培養すると鋳型１本鎖ＤＮＡが
培養液中に出てくるので、この培養液を微量遠心チュー
ブに移し取り１２，０００回転で３分間遠心した。次い
でピペットで上澄液のみを新しい微量遠心チー−プにと
９ｐＥａ／Ｎａａｔ溶液（ポリエチレングリコール６０
００’ｉ ２０％とＮａＣ！ｔを２．５Ｍ含む水溶液）
２００μｌを加えて混合し、室温に１５分間靜装した。
培養液中に出てくるので、この培養液を微量遠心チュー
ブに移し取り１２，０００回転で３分間遠心した。次い
でピペットで上澄液のみを新しい微量遠心チー−プにと
９ｐＥａ／Ｎａａｔ溶液（ポリエチレングリコール６０
００’ｉ ２０％とＮａＣ！ｔを２．５Ｍ含む水溶液）
２００μｌを加えて混合し、室温に１５分間靜装した。
１２，０００回転で５分間遠心し目的とするＤＮＡ１沈
殿させ、上澄液をできるだけ除去した。得られたＤ’Ｎ
Ａを実施例１と同様にフェノール処理しエタノール沈
殿により精製し、５０μｅのＴＥ緩衝液に溶解した。上
記の方法で調製した鋳型１本鎖ＤＮＡ中に目的とするＰ
ｍ５２５ウイルスＤＮＡのＨｉｎｄｌｌｌ−ＣＤＮＡ断
片が挿入されている。
殿させ、上澄液をできるだけ除去した。得られたＤ’Ｎ
Ａを実施例１と同様にフェノール処理しエタノール沈
殿により精製し、５０μｅのＴＥ緩衝液に溶解した。上
記の方法で調製した鋳型１本鎖ＤＮＡ中に目的とするＰ
ｍ５２５ウイルスＤＮＡのＨｉｎｄｌｌｌ−ＣＤＮＡ断
片が挿入されている。
２）塩基配列の決定
りによって調製した、Ｐｍ５２５Ｈ１ｎｄ［１−ＣＤＮ
Ａの挿入されている鋳型１本鎖り、ＮＡを用いジオキシ
法によりＰｍ５２５Ｈ１ｎｄｌｌｌ−Ｃの塩基配列を調
べた。塩基配列決定にはアマージャム社の塩基配列法的
用のキラ１４−使い、添付ハンドブックに従った。（Ｍ
１３ ０１ｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇｈａｎｄｂｏｏｋ、 Ａｍｅｒｓｈａｍ ４＋ｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ’、 ）まず、調製した鋳
型１本鎖ＤＮＡ５μｌとＭ＋３プライマー１μｇをクレ
ノー緩衝液（ｏ、 １Ｍ ）リス・ＨＣｌ、 ｐＨａ５
、 ５０ｍＭＭｙＣ４ｚ） １．５／ｌｌ、水２５μ
ｅ中で６０℃、１時間反応させた。（これをアニーリン
グ反応という）続いてこのアニーリング反応液１０μｌ
にクレノーＤＮＡポリメ７−セ１／１８． （、ａ−３
２ｐ）ｄＯＴＰｉμｇｌ加えて混合しこの混合液２，５
μｌを赤、青、緑及び黄色の微量遠心チー−プに加えて
軽く混合した。ここで別に第１表のＮＴＰ混合液４種類
（仮ＫＡ’、ｃ’、 Ｇｏ、Ｔ０ト名づけり）ヲ調製し
ておき、これを赤色チー−ブにはＡｏｆ：青にはｃｏを
緑にはＧｏを黄にはＴ０ヲそれぞれ２５μｌずつ加えて
軽く混合、２０’Ｃで１５分間居応させた。
Ａの挿入されている鋳型１本鎖り、ＮＡを用いジオキシ
法によりＰｍ５２５Ｈ１ｎｄｌｌｌ−Ｃの塩基配列を調
べた。塩基配列決定にはアマージャム社の塩基配列法的
用のキラ１４−使い、添付ハンドブックに従った。（Ｍ
１３ ０１ｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇｈａｎｄｂｏｏｋ、 Ａｍｅｒｓｈａｍ ４＋ｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ’、 ）まず、調製した鋳
型１本鎖ＤＮＡ５μｌとＭ＋３プライマー１μｇをクレ
ノー緩衝液（ｏ、 １Ｍ ）リス・ＨＣｌ、 ｐＨａ５
、 ５０ｍＭＭｙＣ４ｚ） １．５／ｌｌ、水２５μ
ｅ中で６０℃、１時間反応させた。（これをアニーリン
グ反応という）続いてこのアニーリング反応液１０μｌ
にクレノーＤＮＡポリメ７−セ１／１８． （、ａ−３
２ｐ）ｄＯＴＰｉμｇｌ加えて混合しこの混合液２，５
μｌを赤、青、緑及び黄色の微量遠心チー−プに加えて
軽く混合した。ここで別に第１表のＮＴＰ混合液４種類
（仮ＫＡ’、ｃ’、 Ｇｏ、Ｔ０ト名づけり）ヲ調製し
ておき、これを赤色チー−ブにはＡｏｆ：青にはｃｏを
緑にはＧｏを黄にはＴ０ヲそれぞれ２５μｌずつ加えて
軽く混合、２０’Ｃで１５分間居応させた。
第−表 ＮＴＰ混合液
１５分後に０．ｊｍＭｄＡＴＰ、’ ０．５ｍＭｄＣＴ
Ｐ、０．５ｙｙ１ＭｄＧＴＰ及び０．５ｍＭｄＴＴＰ’
ｉ各々２μｅずつ加えて、２０℃、１５分間反応させた
。反応終了後、ホルムアミド色素液（ホルムアミド１（
ｌｏｍｇ、キシレンシアツール０．１ｆ、ブロムフェノ
ールブル−ｏ、 １ｙ、ｏ、ｓＭＥＤＴＡ２−）ｓＳを
加えて反応を停止させた。次いで沸騰水中で５分間熱処
理し、６％ポリアクリルアミドゲルにのせて２時間電気
泳動を行った。泳動条件は１５００ Ｖ、 ５０ｍＡ。
Ｐ、０．５ｙｙ１ＭｄＧＴＰ及び０．５ｍＭｄＴＴＰ’
ｉ各々２μｅずつ加えて、２０℃、１５分間反応させた
。反応終了後、ホルムアミド色素液（ホルムアミド１（
ｌｏｍｇ、キシレンシアツール０．１ｆ、ブロムフェノ
ールブル−ｏ、 １ｙ、ｏ、ｓＭＥＤＴＡ２−）ｓＳを
加えて反応を停止させた。次いで沸騰水中で５分間熱処
理し、６％ポリアクリルアミドゲルにのせて２時間電気
泳動を行った。泳動条件は１５００ Ｖ、 ５０ｍＡ。
泳動緩衝液はＴＢＫ緩衝液（トリス塩１０．８ｇ、ホウ
酸５．５ ？、 ］ＩｃＤＴＡ ２ＮａＯ，９３ｆ／ｌ
）ｆ用いた。
酸５．５ ？、 ］ＩｃＤＴＡ ２ＮａＯ，９３ｆ／ｌ
）ｆ用いた。
電気泳動終了後、ゲルをはがし、ゲル固定液（メタノー
ル、酢酸：水＝＋：１：ａ′／Ｉ）に１５分間浸した。
ル、酢酸：水＝＋：１：ａ′／Ｉ）に１５分間浸した。
固定液をできるだけ除去し、ゲルにｐ紙を乗せてゲルを
付着させた。ｐ紙を付着させた側の裏面にランプを被せ
、ゲル乾燥装置（Ａｔｔｏ ＡＥ −３７００、Ｈｏｅ
ｆｅｒ ＳＢ１１５０ ）でゲｉｌｒ充分乾珠させ、次
いでＸ線フィルムで一２０℃、約１２時間感光させ、Ｘ
線フィルムを現像後解読し、塩基配列を決定した。
付着させた。ｐ紙を付着させた側の裏面にランプを被せ
、ゲル乾燥装置（Ａｔｔｏ ＡＥ −３７００、Ｈｏｅ
ｆｅｒ ＳＢ１１５０ ）でゲｉｌｒ充分乾珠させ、次
いでＸ線フィルムで一２０℃、約１２時間感光させ、Ｘ
線フィルムを現像後解読し、塩基配列を決定した。
上記と全く同様な方法でＷＴ５０１Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｃ
。
。
Ｐｍ４１１Ｈｉｎｄｌｌｌ−０及びＰｍ５２２ Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ−Ｃの塩基配列を各々決定した。結果は第２図
、第６図。
ｄｌｌｌ−Ｃの塩基配列を各々決定した。結果は第２図
、第６図。
第４図及び第５図に示す。
またＰｍ５２５ Ｈｉｎｄｉｌ−０，ＷＴ５０１ Ｈｉ
ｎｄｌｌｌ−Ｃ。
ｎｄｌｌｌ−Ｃ。
Ｐｍ４１１ Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｃ！及びＰｍ５２２ Ｈ
ｉｎｄｌｌｌ−Ｃ！の各ＤＮＤ断片の塩基数は各々ｓ
１ｏ ｂ、ｐ、 （ベース・ペア） ５５５ｂ、ｐ、５
１２ｂ、ｐ、及び４５１ ｂ、、ｐ、であった。変異株
のＰｍ４１１． Ｐｍ５２２及びＰｍ５２５のＨｉｎｄ
ｎｌ −Ｑは野生株のＷＴ５０１ Ｈｉｎｄｉｌｌ−
Ｃから°の塩基脱落が数ケＰＪＴアリ、塩基数が数１０
ｂ、ｐ、減少していた。尚、Ａ、Ｂ、ＤのＤＮＡ断片
の分子量は野生株、変異株とも同じ値を示した。
ｉｎｄｌｌｌ−Ｃ！の各ＤＮＤ断片の塩基数は各々ｓ
１ｏ ｂ、ｐ、 （ベース・ペア） ５５５ｂ、ｐ、５
１２ｂ、ｐ、及び４５１ ｂ、、ｐ、であった。変異株
のＰｍ４１１． Ｐｍ５２２及びＰｍ５２５のＨｉｎｄ
ｎｌ −Ｑは野生株のＷＴ５０１ Ｈｉｎｄｉｌｌ−
Ｃから°の塩基脱落が数ケＰＪＴアリ、塩基数が数１０
ｂ、ｐ、減少していた。尚、Ａ、Ｂ、ＤのＤＮＡ断片
の分子量は野生株、変異株とも同じ値を示した。
実験例２
＋）Ｐｍ５２５Ｈ１ｎｄｌｌｌ−ＣＤＮＡ断片を含む複
合プラスミドＤＮＡの作製 ここで使用するプラスミドｐＴＫは、ヘルペスシンプレ
ックスＩ型ウィルスＤＮＡから制限酵素ＢａｍＨ工によ
シ切シ出したＴＫ、（チミジンキナーゼノ遺伝子を大腸
菌プラスミドｐＢＲ３２２の１３ａｍ Ｈ工切断部位に
挿入してクローニングしたものであシ、挿入される方向
性によ９２種類ある（市及び７）。このＴＫ遺伝子には
制限酵素Ｓａｃ ｌによる切断部位が存在しない。（こ
のｐＴＫプラスミドは成人、羽倉助教授より分与された
）。
合プラスミドＤＮＡの作製 ここで使用するプラスミドｐＴＫは、ヘルペスシンプレ
ックスＩ型ウィルスＤＮＡから制限酵素ＢａｍＨ工によ
シ切シ出したＴＫ、（チミジンキナーゼノ遺伝子を大腸
菌プラスミドｐＢＲ３２２の１３ａｍ Ｈ工切断部位に
挿入してクローニングしたものであシ、挿入される方向
性によ９２種類ある（市及び７）。このＴＫ遺伝子には
制限酵素Ｓａｃ ｌによる切断部位が存在しない。（こ
のｐＴＫプラスミドは成人、羽倉助教授より分与された
）。
先ず、ｐＴＫＤＮＡ ２１１９を実施例１と同様の条件
でＨｌｎｄ ｍｌ ｋ用いて開裂し、順次フェノール処
理、エタノール沈殿を行った。得られたＤＮＡ全５０ｍ
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，４）に溶解し、アルカリ性フ
ォスファターゼ（全酒造■製） ’Ｃ＋ ｕ加えて６５
℃で１時間反応させ脱リン酸化を行った。
でＨｌｎｄ ｍｌ ｋ用いて開裂し、順次フェノール処
理、エタノール沈殿を行った。得られたＤＮＡ全５０ｍ
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，４）に溶解し、アルカリ性フ
ォスファターゼ（全酒造■製） ’Ｃ＋ ｕ加えて６５
℃で１時間反応させ脱リン酸化を行った。
次いで実施例１と同様な方法でフェノール処理２回、エ
タノール沈殿を行い約１．２μｇのＤＮＡを得、６０μ
ｅの蒸留水に溶解した。
タノール沈殿を行い約１．２μｇのＤＮＡを得、６０μ
ｅの蒸留水に溶解した。
１）−■で調製したＰｍ５２５Ｈ１ｎｄｌｌｌ−ＣＤＮ
Ａ断片とＨｉｎｄ ｉｌｌにより開裂させ７’（ｐＴＪ
プラスミドＤＮＡをそれぞれ＋０Ｓ（０，４〜）及び５
μｔ（０２ｐｇ）混合し、反応液（３０ｍＭ）リス、
Ｈａｔ、 ｐＨ７，８，１０ｍＭＭｆＣ１２，１０ｍＭ
ジチオスレイトール。
Ａ断片とＨｉｎｄ ｉｌｌにより開裂させ７’（ｐＴＪ
プラスミドＤＮＡをそれぞれ＋０Ｓ（０，４〜）及び５
μｔ（０２ｐｇ）混合し、反応液（３０ｍＭ）リス、
Ｈａｔ、 ｐＨ７，８，１０ｍＭＭｆＣ１２，１０ｍＭ
ジチオスレイトール。
０．５ｍＭＡＴＰ）２０ｐｌ中でＴ４ＤＮＡリガーゼ２
ｕを用い１５℃、６時間反応させて複合プラスミドを作
製した。（第１図、（ホ）） Ｈｉｎｄ １ｌｌ−ＯＤ Ｎ Ａ断片がｐＴＫに挿入さ
れる方向は２通シあるので、それぞれの方向に組み込ま
れた複合プラスミドをおのおの選別し、転写促進活性に
及ぼす影響を調べる実験に使用した。
ｕを用い１５℃、６時間反応させて複合プラスミドを作
製した。（第１図、（ホ）） Ｈｉｎｄ １ｌｌ−ＯＤ Ｎ Ａ断片がｐＴＫに挿入さ
れる方向は２通シあるので、それぞれの方向に組み込ま
れた複合プラスミドをおのおの選別し、転写促進活性に
及ぼす影響を調べる実験に使用した。
つまり、Ｈｉｎｄ ｉｌｌ −ＣＤ Ｎ Ａ断片にはも
とのＢＫウィルスＤＮＡに存在しりｖｐとＴ−Ａｙ（Ｔ
抗原）全コードする塩基配列の起点部位の極く一部が互
いに逆向きに含まれており、ＴＫ遺伝子に向ってＶｐ側
又ｉｄ Ｔ−’Ａ７側が向くように挿入される場合の２
通りが存在する（第６図、（イ）（０））。
とのＢＫウィルスＤＮＡに存在しりｖｐとＴ−Ａｙ（Ｔ
抗原）全コードする塩基配列の起点部位の極く一部が互
いに逆向きに含まれており、ＴＫ遺伝子に向ってＶｐ側
又ｉｄ Ｔ−’Ａ７側が向くように挿入される場合の２
通りが存在する（第６図、（イ）（０））。
第６図中の遺伝子のわきの矢印は遺伝子が読まれる向き
であり、図の下の名前についている矢印はＣの上の矢印
がｖｐが読まれる向きであり、ＴＫの上の矢印はＴＫ遺
伝子が読まれる向きを表わす。例えば、ｐｌｌｌｌに５
２５Ｊ（ｉｎｃｌｌ［ｌ−ｆ’ｒＴ’は、Ｐ ｍ ５２
５ Ｈｉｎｄ ｌ［−０Ｄ Ｎ Ａ断片のＶｐ側が、Ｔ
Ｋ遺伝子が読捷れていく方向にプラスミドｐＢＲ５２２
に挿入されていることを示す。逆にＣならＴ−Ａ２側が
ＴＫ遺伝子側に向いていることになる。
であり、図の下の名前についている矢印はＣの上の矢印
がｖｐが読まれる向きであり、ＴＫの上の矢印はＴＫ遺
伝子が読まれる向きを表わす。例えば、ｐｌｌｌｌに５
２５Ｊ（ｉｎｃｌｌ［ｌ−ｆ’ｒＴ’は、Ｐ ｍ ５２
５ Ｈｉｎｄ ｌ［−０Ｄ Ｎ Ａ断片のＶｐ側が、Ｔ
Ｋ遺伝子が読捷れていく方向にプラスミドｐＢＲ５２２
に挿入されていることを示す。逆にＣならＴ−Ａ２側が
ＴＫ遺伝子側に向いていることになる。
１）−■複合プラスミドＤＮＡの太ＩＵＩｉＨＢ１０＋
への感染を目的とする複合プラスミド保持菌の検出 １）−■で作製した各種複合プラスミドＤＮＡを大腸菌
ＨＢ＋０１にＣ！ａ０ｔ２法で実験例１−１）と同様に
導入して形質転換させ、１．４Ｘ寒天培地（アンピシリ
ン２５〜／ｍ７！’ｅ含むＬ〜培地（後記））にまいた
。６７℃で培養すると外部からプラスミドＤＮＡ１取り
込んだＨＢ＋０１のコロニーが生じる。このコロニーに
は目的の複合プラスミドＤＮＡ以外のＤＮＡ’ｉ含む園
が多数存在するので目的のプラスミドＤＮＡ’ｉ含む菌
を選別する必要がある。各コロニーから滅菌した爪楊枝
で１の一部ヲ取り、アンビンリン２５／ＪＪｊ／ｍｌを
含むＬ−培地（バクトドリプトン１ｏ１゜イーストエキ
ストラクト５９ 、Ｎａ（：！ｔ５ ｔ ／ｌ 。
への感染を目的とする複合プラスミド保持菌の検出 １）−■で作製した各種複合プラスミドＤＮＡを大腸菌
ＨＢ＋０１にＣ！ａ０ｔ２法で実験例１−１）と同様に
導入して形質転換させ、１．４Ｘ寒天培地（アンピシリ
ン２５〜／ｍ７！’ｅ含むＬ〜培地（後記））にまいた
。６７℃で培養すると外部からプラスミドＤＮＡ１取り
込んだＨＢ＋０１のコロニーが生じる。このコロニーに
は目的の複合プラスミドＤＮＡ以外のＤＮＡ’ｉ含む園
が多数存在するので目的のプラスミドＤＮＡ’ｉ含む菌
を選別する必要がある。各コロニーから滅菌した爪楊枝
で１の一部ヲ取り、アンビンリン２５／ＪＪｊ／ｍｌを
含むＬ−培地（バクトドリプトン１ｏ１゜イーストエキ
ストラクト５９ 、Ｎａ（：！ｔ５ ｔ ／ｌ 。
ＰＨ７，２） １５−に接種した。３７℃で１夜振盪培
養後１−を微量遠心チーーフに移し、１２．ｏｏ。
養後１−を微量遠心チーーフに移し、１２．ｏｏ。
回転で３０秒遠心した。ペレットを自体洗浄液（１０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｔ、 ＰＨ８，０，＋ ｍＭＥＤＴＡ
。
Ｍトリス−ＨＣｔ、 ＰＨ８，０，＋ ｍＭＥＤＴＡ
。
０．８５％Ｎａ１ｌ ） ５００ ｐｇに懸濁させ再び
同様に遠心した。ベレノ）（Ｈ８ＴＦｉＴ液（５０ｍＭ
）リス・ＨＣＩ、 ｐｉ（ａ、ｏ、８％／ヨ糖、５Ｘト
ライトンＸ１ｏｏ。
同様に遠心した。ベレノ）（Ｈ８ＴＦｉＴ液（５０ｍＭ
）リス・ＨＣＩ、 ｐｉ（ａ、ｏ、８％／ヨ糖、５Ｘト
ライトンＸ１ｏｏ。
５０ｍＭＫＤＴＡ）７ｐｌに完全に懸濁させ、３０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐｉ（８，Ｑ）に溶かしたりゾチーム溶
液水 （１０ｍｆ／ｍｌ） ｆ氷水中で７μ６加え混合し、沸
騰罹に４０秒秒間上た後す早く１２，０００回転、１ｏ
分間遠心した後、ペレットを取シ除いた。上澄液に冷イ
ングロビルアルコールを７５μ６加え、混合シて一２０
℃に１０分間放置した。次いで＋２，０００回転、７分
間遠心しＤＮＡ’ｉ沈殿させ上計液をできるだけ除去し
、減圧下でＤＮＡ１乾燥させた。続いて制限＃素Ｅａｍ
Ｈｌ 、 Ｈｉｎｄ （１１、Ｐｖｕ （１（宝酒造
■製）等で切断して、寒天平板ゲル電気泳動にかけ、分
離されるＤＮＡバンド数と泳動距離から、目的の複合プ
ラスミドＤＮＡを持った菌を選別した。制限酵素Ｂａｍ
Ｈ１は＋０ｍＭ）す、ｘ −Ｈｅｔ、 ｐＨ７，５，＋
ＯｍＭＭｙＣ１２，５０ｍＭＮａ０ｊ、 １ｍＭジチ
オスレイトール中で、Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ及びＰｖｕ ｌ
は１０ｍＭ）リス−ＨＣＩ、 ｐＨ７、５、６ｍＭＭｙ
ＣＡ２ 、 ６０ ｍＭＮａｏｔ、１ｍＭジテオスレイ
トール中で実施例１と同様の方法で行っこ。・電気泳動
の条件も実施例１の方法に準じた。目的とする複合プラ
スミドはＢａｍＨｌで切断すると３６ｘｂ（キロベース
）の位置にＴＫ遺伝子のバンドと約４゜９Ｋｂの位置に
、ｐＢＲ３２２にウィルスＤ’ＮＡのＣ断片が挿入され
たＤＮＡバンドが見られ、（第１０図（ａ））、またＨ
ｉｎｄ ｉｌｌで切断した場合は、約０５Ｋｔ）の位置
にウィルスＤＮＡのＣ断片ＤＮＡの心バンドが、７９Ｋ
ｂの位置にＴＫ遺伝子がｐＢＲ５２２に挿入されたＤＮ
Ａのバンドが見られる（第７０図（ｂ））。またＰｖｕ
■はｐＢＲ３２２に１ケ所、ＴＫ遺伝子上に２ケ所Ｂ
ＫウイルスＤＮＡのＣ断片上（Ｈｉｎｄｌｌｌ−０）に
１ケ所切断部位を持つので、この制限酵素で切断すると
ＴＫ遺伝子とＨｉｎｄ ｌ［ｌ −Ｃ断片ＤＮＡがｐＢ
Ｒ３２２に挿入された方向性の違いＶＣより切断されて
生ずるＤＮＡのサイズが違なる（第６図（イ）。
トリス緩衝液（ｐｉ（８，Ｑ）に溶かしたりゾチーム溶
液水 （１０ｍｆ／ｍｌ） ｆ氷水中で７μ６加え混合し、沸
騰罹に４０秒秒間上た後す早く１２，０００回転、１ｏ
分間遠心した後、ペレットを取シ除いた。上澄液に冷イ
ングロビルアルコールを７５μ６加え、混合シて一２０
℃に１０分間放置した。次いで＋２，０００回転、７分
間遠心しＤＮＡ’ｉ沈殿させ上計液をできるだけ除去し
、減圧下でＤＮＡ１乾燥させた。続いて制限＃素Ｅａｍ
Ｈｌ 、 Ｈｉｎｄ （１１、Ｐｖｕ （１（宝酒造
■製）等で切断して、寒天平板ゲル電気泳動にかけ、分
離されるＤＮＡバンド数と泳動距離から、目的の複合プ
ラスミドＤＮＡを持った菌を選別した。制限酵素Ｂａｍ
Ｈ１は＋０ｍＭ）す、ｘ −Ｈｅｔ、 ｐＨ７，５，＋
ＯｍＭＭｙＣ１２，５０ｍＭＮａ０ｊ、 １ｍＭジチ
オスレイトール中で、Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ及びＰｖｕ ｌ
は１０ｍＭ）リス−ＨＣＩ、 ｐＨ７、５、６ｍＭＭｙ
ＣＡ２ 、 ６０ ｍＭＮａｏｔ、１ｍＭジテオスレイ
トール中で実施例１と同様の方法で行っこ。・電気泳動
の条件も実施例１の方法に準じた。目的とする複合プラ
スミドはＢａｍＨｌで切断すると３６ｘｂ（キロベース
）の位置にＴＫ遺伝子のバンドと約４゜９Ｋｂの位置に
、ｐＢＲ３２２にウィルスＤ’ＮＡのＣ断片が挿入され
たＤＮＡバンドが見られ、（第１０図（ａ））、またＨ
ｉｎｄ ｉｌｌで切断した場合は、約０５Ｋｔ）の位置
にウィルスＤＮＡのＣ断片ＤＮＡの心バンドが、７９Ｋ
ｂの位置にＴＫ遺伝子がｐＢＲ５２２に挿入されたＤＮ
Ａのバンドが見られる（第７０図（ｂ））。またＰｖｕ
■はｐＢＲ３２２に１ケ所、ＴＫ遺伝子上に２ケ所Ｂ
ＫウイルスＤＮＡのＣ断片上（Ｈｉｎｄｌｌｌ−０）に
１ケ所切断部位を持つので、この制限酵素で切断すると
ＴＫ遺伝子とＨｉｎｄ ｌ［ｌ −Ｃ断片ＤＮＡがｐＢ
Ｒ３２２に挿入された方向性の違いＶＣより切断されて
生ずるＤＮＡのサイズが違なる（第６図（イ）。
（ロ）、Ｈ）。従って寒天ゲル電気泳動にがけてＰｖｕ
…切断で生じるＤＮＡのサイズを調べることにより、挿
入されたＤＮＡの向きを決定することができた。第６図
の（イ）ではＰｖｕ １１切断により２．８，２．７゜
２．０，０．９Ｋｂのバンドを生じ、（第１０図（Ｃ）
）、（ロンでは２．７．２．５．２．０． ｔ４Ｋｂノ
ハンド灯第１０図（Ｃ））、（ハ）では２．３． ２．
２６． ２．０． １．８に１）のバンドを生じた。（
第１０図（ｅ））。
…切断で生じるＤＮＡのサイズを調べることにより、挿
入されたＤＮＡの向きを決定することができた。第６図
の（イ）ではＰｖｕ １１切断により２．８，２．７゜
２．０，０．９Ｋｂのバンドを生じ、（第１０図（Ｃ）
）、（ロンでは２．７．２．５．２．０． ｔ４Ｋｂノ
ハンド灯第１０図（Ｃ））、（ハ）では２．３． ２．
２６． ２．０． １．８に１）のバンドを生じた。（
第１０図（ｅ））。
以上の如（ＢａｍＨｌ 、 Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ及びＰｖ
ｕ ｌで切断して生じるＤＮＡ断片数とサイズから目的
とする複合プラスミドＤＮＡ（仮りにｐＢＫ５２５ Ｈ
ｉｎｄ Ｉ［ｌ−Ｍ −”ｎ、ｐＢＫ ｓ ２ ｓ Ｈ
ｉｎｄ ［１−ｉ−工賃及びｐＢＫ５２５Ｈｉｎｄｌｌ
−’ａ−撃１と名付ける）（第６図（イ）。
ｕ ｌで切断して生じるＤＮＡ断片数とサイズから目的
とする複合プラスミドＤＮＡ（仮りにｐＢＫ５２５ Ｈ
ｉｎｄ Ｉ［ｌ−Ｍ −”ｎ、ｐＢＫ ｓ ２ ｓ Ｈ
ｉｎｄ ［１−ｉ−工賃及びｐＢＫ５２５Ｈｉｎｄｌｌ
−’ａ−撃１と名付ける）（第６図（イ）。
（ロ）、（ハ））ｆ：保持する菌を選別できた。上記の
■〜■と同様な方法によりＷＴ５０１Ｈｉｎｄｌ［ｌ−
０。
■〜■と同様な方法によりＷＴ５０１Ｈｉｎｄｌ［ｌ−
０。
Ｐｍ４１＋Ｈ１ｎｄｌｌｌ−０及びＰｍ５２２Ｈｉｎｄ
［１−ＣＤＮＡ断片を各々含む複合プラスミド（ｐＢＫ
ｓｏ＋Ｈｉｎａｌ［−？・胃、 ｐＢＫ５０１Ｈｉｎａ
ｌｌｌ支−Ｔマ。
［１−ＣＤＮＡ断片を各々含む複合プラスミド（ｐＢＫ
ｓｏ＋Ｈｉｎａｌ［−？・胃、 ｐＢＫ５０１Ｈｉｎａ
ｌｌｌ支−Ｔマ。
ｐＢＫ５０１Ｈｉｎｄｌｌｌ−０・臂−、ｐＢＫ４１１
Ｈｉｎｄｌｌｌ −１・３１）ＢＩ３１ ＋ｎ１ｎａト
買陀ｐＢＫ４１１Ｈｉｎｄｌｌ−０−ＴＫ、 ｐＢＫ５
２２Ｈ１ｎｄｌｌｌ−Ｃ−ＴＫ。
Ｈｉｎｄｌｌｌ −１・３１）ＢＩ３１ ＋ｎ１ｎａト
買陀ｐＢＫ４１１Ｈｉｎｄｌｌ−０−ＴＫ、 ｐＢＫ５
２２Ｈ１ｎｄｌｌｌ−Ｃ−ＴＫ。
ｐ Ｂ Ｋ ５２２ Ｈｉｎｄ ｌ［−”Ｆｉ−Ｔｒ、
及びｐ ＢＩ５２２ Ｈｉｎｄ−７・早丁ン名付ける）
を作製した。（第７図（イ） 、 （ロ） 、 （ハ）
、 第 ８ 図（イ）、（ロ） 、 （ハ） 、 第
９ 図（イ） 、 （ロ）（ハ）） １）−■ 培養細胞へのＤＮＡ導入実験に用いる複培養
細胞に導入するのに使用する各複合プラスミドＤＮＡは
エチジウムブロマイドを含むセシウムクロリド密度勾配
超遠心法に従って調製した。（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、
Ｆ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、 Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
；Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｏｌｏｎｉｎｇ 、 ｐ８６．
Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂ、、ｔ
９ａ２） 現 受容細胞はラット線維芽細胞であるＦ２４０８（ＴＫ−
）とマウス線維芽細胞である’Ｌ（ＴＫ−）”ｉ用いた
。両細胞ともチミジンキナーゼ欠損株（ＴＫ”’）であ
り、アミノプテリンにより、チミジル酸合成酵素を阻害
すると増殖不能な細胞であるが、外部からＴＫ遺伝子を
取り込むと、サルベージ回路により培養液中のチミジン
からチくジン−１−リン酸→チミジンー５−リン酸を合
成し、アミノブチリン存在下でも増殖可能となる。従っ
てアミノプテリンを含むＨＡＴ培地イーグルＭＫＭ培地
）で培養することによシ、外部ＤＮＡであるＴＫ遺伝子
を含むプラスミドＤＮＡを取り込んだ細胞を選別できる
。具体的には次のように行なった。
及びｐ ＢＩ５２２ Ｈｉｎｄ−７・早丁ン名付ける）
を作製した。（第７図（イ） 、 （ロ） 、 （ハ）
、 第 ８ 図（イ）、（ロ） 、 （ハ） 、 第
９ 図（イ） 、 （ロ）（ハ）） １）−■ 培養細胞へのＤＮＡ導入実験に用いる複培養
細胞に導入するのに使用する各複合プラスミドＤＮＡは
エチジウムブロマイドを含むセシウムクロリド密度勾配
超遠心法に従って調製した。（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、
Ｆ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、 Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
；Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｏｌｏｎｉｎｇ 、 ｐ８６．
Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂ、、ｔ
９ａ２） 現 受容細胞はラット線維芽細胞であるＦ２４０８（ＴＫ−
）とマウス線維芽細胞である’Ｌ（ＴＫ−）”ｉ用いた
。両細胞ともチミジンキナーゼ欠損株（ＴＫ”’）であ
り、アミノプテリンにより、チミジル酸合成酵素を阻害
すると増殖不能な細胞であるが、外部からＴＫ遺伝子を
取り込むと、サルベージ回路により培養液中のチミジン
からチくジン−１−リン酸→チミジンー５−リン酸を合
成し、アミノブチリン存在下でも増殖可能となる。従っ
てアミノプテリンを含むＨＡＴ培地イーグルＭＫＭ培地
）で培養することによシ、外部ＤＮＡであるＴＫ遺伝子
を含むプラスミドＤＮＡを取り込んだ細胞を選別できる
。具体的には次のように行なった。
導入を実施する２４時間前に、直径６０閣の培養皿当９
２．５〜５．０Ｘ１０５ケの割合で細胞を調製した（培
養液組成、修生血清１０％含有イーグルＭＥＭ ）。更
に導入全実施する３〜５時間前に新鮮な同培養液にて置
換した。導入するＤＮＡは培養皿当り１〜とし、ＴＫ遺
伝子と転写促進配列の機能発成に影響を与えない部位で
切断開裂し、直鎖状にして用いた。キャリヤーＤＮＡは
使用しなかった。制限酵素はＳａｄ ｌ又は！３ａｃ
Ｉ （共に宝酌造■製）を用い条件はＳａｌ ｌでは実
施例１の方法の条件に準じた。Ｓａｃ ｌは６ｍＭトリ
ス−Ｈｃｔ、’ ｐＨｙ、 ４゜６．０ｍＭＭｙＣｔ２
． ２０ｍＭＮａＣ６，１ｍＭジチオスレイトールを用
いて同様に行なった。導入実験は２ツ）Ｆ２４０８（Ｔ
Ｋ−）およびマウスＬ（ＴＫ−）細胞について次の項目
を行なった。
２．５〜５．０Ｘ１０５ケの割合で細胞を調製した（培
養液組成、修生血清１０％含有イーグルＭＥＭ ）。更
に導入全実施する３〜５時間前に新鮮な同培養液にて置
換した。導入するＤＮＡは培養皿当り１〜とし、ＴＫ遺
伝子と転写促進配列の機能発成に影響を与えない部位で
切断開裂し、直鎖状にして用いた。キャリヤーＤＮＡは
使用しなかった。制限酵素はＳａｄ ｌ又は！３ａｃ
Ｉ （共に宝酌造■製）を用い条件はＳａｌ ｌでは実
施例１の方法の条件に準じた。Ｓａｃ ｌは６ｍＭトリ
ス−Ｈｃｔ、’ ｐＨｙ、 ４゜６．０ｍＭＭｙＣｔ２
． ２０ｍＭＮａＣ６，１ｍＭジチオスレイトールを用
いて同様に行なった。導入実験は２ツ）Ｆ２４０８（Ｔ
Ｋ−）およびマウスＬ（ＴＫ−）細胞について次の項目
を行なった。
（１） ラットＦ２４０８（ＴＫ−）細胞■ ウィルス
ＤＮＡのＨｉｎｄ １ｌｌ−ＣＤ Ｎ Ａ断片のみをｐ
ＢＲ３２２に組み込み、Ｓａｌ ｌで開裂したもの。こ
の場合、常にコロニーは生じなかったのでデータは省略
した。（ネガティブコントロール） ＠ ＴＫ遺伝子のみをｐＢＲ３３２に組み込み、Ｓａｌ
ｌで開裂したもの。（コントロール）（第１１図、（
ａ）） θ ＴＫ遺伝子のすぐ上流に、Ｈｉｎｄｌｌｌ−ＣＤＮ
Ａ断片のＶｐ側がＴＫ遺伝子に向うように組み込み、Ｓ
ａｌ ｌで開裂したもの。（第１１図、（ｂｌ）ＯＴＫ
遺伝子のすぐ上流に、Ｈｉｎｄ ｌ［−０Ｄ Ｎ Ａ断
片の’ｒ−Ａｙ側がＴＫ遺伝子に向うように組み込み、
５ａ１１で開裂したもの。（第１１図。
ＤＮＡのＨｉｎｄ １ｌｌ−ＣＤ Ｎ Ａ断片のみをｐ
ＢＲ３２２に組み込み、Ｓａｌ ｌで開裂したもの。こ
の場合、常にコロニーは生じなかったのでデータは省略
した。（ネガティブコントロール） ＠ ＴＫ遺伝子のみをｐＢＲ３３２に組み込み、Ｓａｌ
ｌで開裂したもの。（コントロール）（第１１図、（
ａ）） θ ＴＫ遺伝子のすぐ上流に、Ｈｉｎｄｌｌｌ−ＣＤＮ
Ａ断片のＶｐ側がＴＫ遺伝子に向うように組み込み、Ｓ
ａｌ ｌで開裂したもの。（第１１図、（ｂｌ）ＯＴＫ
遺伝子のすぐ上流に、Ｈｉｎｄ ｌ［−０Ｄ Ｎ Ａ断
片の’ｒ−Ａｙ側がＴＫ遺伝子に向うように組み込み、
５ａ１１で開裂したもの。（第１１図。
（Ｃ］）
の ＴＫ遺伝子の４ｋｌ）上流にＨｉｎｄ ｉｌｌ −
ＣＤ Ｎ Ａ断片のＶｐ側がＴＫ遺伝子に向うよう−組
み込み、５ａＣＩで開裂したもの。（第１１図、 （ｄ
） ）ＯＴＫ遺伝子の下流にＨｉｎｄ １ｌＩ−ＣＤ
Ｎ Ａ断片を組み込み、５ａｌｌで開裂したもの。（第
１１図。
ＣＤ Ｎ Ａ断片のＶｐ側がＴＫ遺伝子に向うよう−組
み込み、５ａＣＩで開裂したもの。（第１１図、 （ｄ
） ）ＯＴＫ遺伝子の下流にＨｉｎｄ １ｌＩ−ＣＤ
Ｎ Ａ断片を組み込み、５ａｌｌで開裂したもの。（第
１１図。
（ｅ））
（１１） マウスＬ （ＴＫ’−）細胞Ｆ２４０８（Ｔ
Ｋ−）細胞を用いて行なった実験のうち、■、＠、Ｏお
よびＯについてのみ実験を行なった。（第１１図、 （
ａ）、 （ｂ）、 （Ｃ）、■のデータは１）と同様省
略した。） 培養細胞への導入はｗｌｇｌｅｒ等の方法（Ｗｉｇｌｅ
ｒ。
Ｋ−）細胞を用いて行なった実験のうち、■、＠、Ｏお
よびＯについてのみ実験を行なった。（第１１図、 （
ａ）、 （ｂ）、 （Ｃ）、■のデータは１）と同様省
略した。） 培養細胞への導入はｗｌｇｌｅｒ等の方法（Ｗｉｇｌｅ
ｒ。
Ｍ、、 ５ｉ１ｖｅｒｅｔｅｉｎ、 Ｓ、、 Ｌｅｅ、
Ｌ、 Ｓ、、 Ｐｅ１ｌｉｃｅｒ、 Ａ、。
Ｌ、 Ｓ、、 Ｐｅ１ｌｉｃｅｒ、 Ａ、。
Ｏｈｅｎｇ、 Ｔ、Ｏ，＆ ＡＸｅｌ、 Ｒ，、Ｃｅ１
ｌ、 ＋ ＋ 、 ２２３゜＋９７７）に準じた。即ち
２５０Ｓの蒸留水に溶かしたＤＮＡ１１Ｉｙに２ Ｍ
０ａＣ１２を６１μｅ加えて混合し、これに２倍のＨＢ
Ｓ液（Ｎａ０６１．６５６？。
ｌ、 ＋ ＋ 、 ２２３゜＋９７７）に準じた。即ち
２５０Ｓの蒸留水に溶かしたＤＮＡ１１Ｉｙに２ Ｍ
０ａＣ１２を６１μｅ加えて混合し、これに２倍のＨＢ
Ｓ液（Ｎａ０６１．６５６？。
ヘペス（Ｈｅｐｅｓ ） １，１９１． Ｎａ２ＨＰＯ
４ｏ、 ０４ ？／１００ｍｇ、ｉＮのＮａＯＨ液でＰ
Ｉ（７，１０にして用いる）２５０μｉｆ徐々に滴下し
て加えた。室温に１５分間放置しｆｃ後、培養細胞の上
−面にふりンかけて３７℃で培養した。４時間後培養液
を除去し、イーグルのＭＥＭ培地で洗浄後、１５Ｘグリ
セリン溶液（グリセリン４５ｍ／、２倍のａＢｓｇ５０
ｍｌ、Ｈ，、Ｏｘｓｒｎｌ、） ｔｓ−加えて１〜１．
５分間処理した。次いでできるだけ液を除いて再び洗浄
し１０％仔牛修生を含むイーグルＭＥＭ培養液に置換し
て培養した。導入２日後、トリプ／ノで細胞をはがし、
各培養皿１枚を３枚の培養皿に再培養した。同時に培養
液はＨＡＴ培地に置換した。１〜２日毎にＨＡＴ培地を
交換して培養を続けると５日目頃からＴＫ−細胞のコロ
ニーが生じてくる。
４ｏ、 ０４ ？／１００ｍｇ、ｉＮのＮａＯＨ液でＰ
Ｉ（７，１０にして用いる）２５０μｉｆ徐々に滴下し
て加えた。室温に１５分間放置しｆｃ後、培養細胞の上
−面にふりンかけて３７℃で培養した。４時間後培養液
を除去し、イーグルのＭＥＭ培地で洗浄後、１５Ｘグリ
セリン溶液（グリセリン４５ｍ／、２倍のａＢｓｇ５０
ｍｌ、Ｈ，、Ｏｘｓｒｎｌ、） ｔｓ−加えて１〜１．
５分間処理した。次いでできるだけ液を除いて再び洗浄
し１０％仔牛修生を含むイーグルＭＥＭ培養液に置換し
て培養した。導入２日後、トリプ／ノで細胞をはがし、
各培養皿１枚を３枚の培養皿に再培養した。同時に培養
液はＨＡＴ培地に置換した。１〜２日毎にＨＡＴ培地を
交換して培養を続けると５日目頃からＴＫ−細胞のコロ
ニーが生じてくる。
導入２週間後にギムザ染色し、コロニー数を数えた。転
写促進配列の活性は、ｐＴＫに対する比活性で表示しｉ
。その結果ＷＴ５Ｄ ｉ 、 Ｐｍ４ ＋ Ｌ Ｐｍ５
２２およびＰｍ５２５ウイルスＤＮＡの各Ｈｉｎｄ １
１−Ｃ！ＤＮＡ断片はラットＦ２４０８（ＴＫ−）細胞
で転写促進活性をコントロールに対して７９〜２３．９
倍示した。（第２表（ａ） 、 （１）） 、 ＜Ｃ）
）更にこの活性は配列のどちら向きでも発現された。
写促進配列の活性は、ｐＴＫに対する比活性で表示しｉ
。その結果ＷＴ５Ｄ ｉ 、 Ｐｍ４ ＋ Ｌ Ｐｍ５
２２およびＰｍ５２５ウイルスＤＮＡの各Ｈｉｎｄ １
１−Ｃ！ＤＮＡ断片はラットＦ２４０８（ＴＫ−）細胞
で転写促進活性をコントロールに対して７９〜２３．９
倍示した。（第２表（ａ） 、 （１）） 、 ＜Ｃ）
）更にこの活性は配列のどちら向きでも発現された。
（第２表（ａ） 、 （ｂ） ）
またこの転写促進配列は目的遺伝子から４ｋｌ）離れて
も近傍にある場合の約７０％の活性を示しく第２表（ｄ
））かつ反対側（つまシ後ろ側）に組み込まれてもコン
トロールの１．８〜４．８倍の活性を示した。
も近傍にある場合の約７０％の活性を示しく第２表（ｄ
））かつ反対側（つまシ後ろ側）に組み込まれてもコン
トロールの１．８〜４．８倍の活性を示した。
上記のような転写促進活性はマウスＬ（ＴＫ−）細胞で
も同様に発現された。その結果は第６表に示す。
も同様に発現された。その結果は第６表に示す。
以上の実験によりＢＫウィルスＤＮＡよシ得られる転写
促進配列は各種真核細胞で機能を発揮し、Ｐ ｍ ４１
１ Ｈｉｎｄ １ｌｌ−ＣのラットＦ２４０８（ＴＫ−
）細胞およびマウスＬ（ＴＫ”−）細胞での活性の表わ
れ方よりみて明らかな如く真核細胞の種により親和性が
異なることが示唆された。
促進配列は各種真核細胞で機能を発揮し、Ｐ ｍ ４１
１ Ｈｉｎｄ １ｌｌ−ＣのラットＦ２４０８（ＴＫ−
）細胞およびマウスＬ（ＴＫ”−）細胞での活性の表わ
れ方よりみて明らかな如く真核細胞の種により親和性が
異なることが示唆された。
またＢＫウィルスＤＮＡウィルスより得られた転写促進
配列を有用物質生産遺伝子上連結させ真核細胞内で発現
させることにより目的遺伝子の産生量を数１０倍に増加
できることが証明された。
配列を有用物質生産遺伝子上連結させ真核細胞内で発現
させることにより目的遺伝子の産生量を数１０倍に増加
できることが証明された。
第１図は転写促進配列ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃをプラスミド
ｐＴＫに組み込む手順を示す。第２図はＰｍ５２５Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ−Ｃの塩基配列図を示す。第３図はＷＴ５０
１ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃの塩基配列図を示す。第４図はＰ
ｍ４１１ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃの塩基配列図を示す。第５
図はＰｍ５２２ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃの塩基配列図を示す
。第６図はＰｍ５２５ＨｉｎａＩＩＩ−ＣをｐＴＫに組
み込んだ複合グラスミドｐＢＫ５２５Ｈｉｎｄｌｌｌ−
Ｃ！ ’に示す。第７図はＷＴ５０１Ｈ１ｎｄｌｌｌ−
Ｃｆ ｐＴＫに組み込んだ複合プラスミドｐＢＫ５０１
Ｈ１ｎｄｌｌｌ−Ｏｆ示す。第８図はＰｍ４ ｉ １Ｈ
ｉｎｄ ［１−Ｃを組み込んだ複合プラスミドｐＢＫ４
１１Ｈｉｎｄ １ｌｌ−Ｃｆ示す。第９図はＰｍ５２２
Ｈｉｎｄ［ｌ−０（ｉ７組み込んだ複合プラスミドｐＢ
Ｋ ５２２ Ｈｉｎｄｌｌｌ −Ｃを示す。第１０図は
複合プラスミドｐＢＫ５２５Ｈｉｎｄ １ｌｌ−Ｃの制
限酵素切断後の電気泳動図 を示す。第１１図は真核細
胞の形質導入に用いる直鎖複合プラスミドを示す。 特許出願人 大正製薬株式会社 代理人 北 川 富 造 築１図 （イ）Ｐ、７．５２５ウイルスＤＮＡ （ハ）ｐＴＫ図
面の浄書（内容に変更なし） 挑 ５ も と ν ご ￥ ８ ≧ −減 ε−（ｊ
（ｆｆ ＋４１１−ヒト（ＣＬ哨（φくりＣくσ 第６図 第７図 ｐＢＫ５０１ ＨｉｎＣＩＩｌ−Ｃ−ＴＫ第８図 ｐＢＫ４１１Ｈｉｎｄｌ［［−Ｃ−ＴＫ第９図 ｐＢＫ５２２）−１ｉｎｄＩＩＩ−’ｆｆ１６図面の浄
書（内容に変更なし） 第１０図 ＨｉｎｄｌｌＥ−Ｃ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５９年特許願第４４４３７号 ２、発明の名称 ウィルス性転写促進配列 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所東京都豊島区高田３丁目２４番１号名称 （２８１
） 大正製薬株式会社 代表者 上原昭二 ４、代理人 住所〒１７１東京都豊島区高田３丁目２４番１号大正製
薬株式会社内 ５、補正命令の日付 昭和５９年５月９日 （発送日 昭和５９年５月２９日） ６、補正の対象 明細書及び図面 Ｚ補正の内容 （１）明細書の浄書 （内容に変更なし） （２）第２．３．４．５図及び第１０図の浄書（内容に
変更なし） ８添付書類の目録 （１）全文補正明細書 １通
ｐＴＫに組み込む手順を示す。第２図はＰｍ５２５Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ−Ｃの塩基配列図を示す。第３図はＷＴ５０
１ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃの塩基配列図を示す。第４図はＰ
ｍ４１１ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃの塩基配列図を示す。第５
図はＰｍ５２２ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃの塩基配列図を示す
。第６図はＰｍ５２５ＨｉｎａＩＩＩ−ＣをｐＴＫに組
み込んだ複合グラスミドｐＢＫ５２５Ｈｉｎｄｌｌｌ−
Ｃ！ ’に示す。第７図はＷＴ５０１Ｈ１ｎｄｌｌｌ−
Ｃｆ ｐＴＫに組み込んだ複合プラスミドｐＢＫ５０１
Ｈ１ｎｄｌｌｌ−Ｏｆ示す。第８図はＰｍ４ ｉ １Ｈ
ｉｎｄ ［１−Ｃを組み込んだ複合プラスミドｐＢＫ４
１１Ｈｉｎｄ １ｌｌ−Ｃｆ示す。第９図はＰｍ５２２
Ｈｉｎｄ［ｌ−０（ｉ７組み込んだ複合プラスミドｐＢ
Ｋ ５２２ Ｈｉｎｄｌｌｌ −Ｃを示す。第１０図は
複合プラスミドｐＢＫ５２５Ｈｉｎｄ １ｌｌ−Ｃの制
限酵素切断後の電気泳動図 を示す。第１１図は真核細
胞の形質導入に用いる直鎖複合プラスミドを示す。 特許出願人 大正製薬株式会社 代理人 北 川 富 造 築１図 （イ）Ｐ、７．５２５ウイルスＤＮＡ （ハ）ｐＴＫ図
面の浄書（内容に変更なし） 挑 ５ も と ν ご ￥ ８ ≧ −減 ε−（ｊ
（ｆｆ ＋４１１−ヒト（ＣＬ哨（φくりＣくσ 第６図 第７図 ｐＢＫ５０１ ＨｉｎＣＩＩｌ−Ｃ−ＴＫ第８図 ｐＢＫ４１１Ｈｉｎｄｌ［［−Ｃ−ＴＫ第９図 ｐＢＫ５２２）−１ｉｎｄＩＩＩ−’ｆｆ１６図面の浄
書（内容に変更なし） 第１０図 ＨｉｎｄｌｌＥ−Ｃ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５９年特許願第４４４３７号 ２、発明の名称 ウィルス性転写促進配列 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所東京都豊島区高田３丁目２４番１号名称 （２８１
） 大正製薬株式会社 代表者 上原昭二 ４、代理人 住所〒１７１東京都豊島区高田３丁目２４番１号大正製
薬株式会社内 ５、補正命令の日付 昭和５９年５月９日 （発送日 昭和５９年５月２９日） ６、補正の対象 明細書及び図面 Ｚ補正の内容 （１）明細書の浄書 （内容に変更なし） （２）第２．３．４．５図及び第１０図の浄書（内容に
変更なし） ８添付書類の目録 （１）全文補正明細書 １通
Claims (2)
- （１） ヒトＢＫウイルスＤＮＡより得られる遺伝子の
転写活性を増強せしめる転写促進配列。 - （２） ヒトＢＫウィルスＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩにより開裂して得られるＣ断片に存在する特許請求
の範囲第１項の転写促進配列。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59044437A JPH0789930B2 (ja) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | ウイルス性転写促進配列 |
| US06/709,281 US4722897A (en) | 1984-03-08 | 1985-03-07 | Viral enhancer DNA segments |
| EP85301617A EP0154566B1 (en) | 1984-03-08 | 1985-03-08 | Viral enhancer dna segments |
| DE8585301617T DE3577994D1 (de) | 1984-03-08 | 1985-03-08 | Vergroessernde virale dna-segmente. |
| AT85301617T ATE53237T1 (de) | 1984-03-08 | 1985-03-08 | Vergroessernde virale dna-segmente. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59044437A JPH0789930B2 (ja) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | ウイルス性転写促進配列 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60188075A true JPS60188075A (ja) | 1985-09-25 |
| JPH0789930B2 JPH0789930B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=12691462
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59044437A Expired - Lifetime JPH0789930B2 (ja) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | ウイルス性転写促進配列 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4722897A (ja) |
| EP (1) | EP0154566B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0789930B2 (ja) |
| AT (1) | ATE53237T1 (ja) |
| DE (1) | DE3577994D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6312296A (ja) * | 1986-04-09 | 1988-01-19 | イ−ライ・リリ−・アンド・カンパニ− | Ｂｋウイルスエンハンサ−を含有する真核生物性発現ベクタ−を用いる方法 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5017477A (en) * | 1985-10-25 | 1991-05-21 | Biotechnica International, Inc. | Enhancing DNA sequencies derived from the sacQ gene |
| AU582288B2 (en) * | 1986-03-07 | 1989-03-16 | Damon Biotech Inc. | Vector and method for achieving high level expression in eukaryotic cells |
| EP0237913A1 (en) * | 1986-03-21 | 1987-09-23 | Miles Inc. | Transcription effector sequences |
| EP0245949B1 (en) * | 1986-04-09 | 1997-10-29 | Eli Lilly And Company | A method of using eukaryotic expression vectors comprising the bk virus enhancer |
| US5550036A (en) | 1986-04-09 | 1996-08-27 | Eli Lilly And Company | Method for co-amplification of human protein C genes in human cells |
| JP2779192B2 (ja) * | 1987-09-17 | 1998-07-23 | マサチユセツツ・インスチチユート・オブ・テクノロジー | ヒト赤血球特異的転写エンハンサー |
| US5698390A (en) * | 1987-11-18 | 1997-12-16 | Chiron Corporation | Hepatitis C immunoassays |
| CA1332049C (en) * | 1988-10-07 | 1994-09-20 | Eli Lilly And Company | Eukaryotic expression |
-
1984
- 1984-03-08 JP JP59044437A patent/JPH0789930B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-03-07 US US06/709,281 patent/US4722897A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-03-08 DE DE8585301617T patent/DE3577994D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-08 AT AT85301617T patent/ATE53237T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-03-08 EP EP85301617A patent/EP0154566B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6312296A (ja) * | 1986-04-09 | 1988-01-19 | イ−ライ・リリ−・アンド・カンパニ− | Ｂｋウイルスエンハンサ−を含有する真核生物性発現ベクタ−を用いる方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0154566A2 (en) | 1985-09-11 |
| EP0154566A3 (en) | 1985-10-30 |
| US4722897A (en) | 1988-02-02 |
| ATE53237T1 (de) | 1990-06-15 |
| DE3577994D1 (de) | 1990-07-05 |
| JPH0789930B2 (ja) | 1995-10-04 |
| EP0154566B1 (en) | 1990-05-30 |
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