JPS60199384A

JPS60199384A - グルタチオン−ｓ−トランスフエラ−ゼ

Info

Publication number: JPS60199384A
Application number: JP59056974A
Authority: JP
Inventors: Kiyomi Sato; 清美佐藤
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-03-24
Filing date: 1984-03-24
Publication date: 1985-10-08
Also published as: JPH031950B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、これまでに見いだされたグルタチオン−３−
トランスフェラーゼとは全く別の新規な物理化学的特徴
を有する新グルタチオン−３−）ランスフェラーゼに関
するものである。

グルタチオン−８−トランスフェラーゼ（以下ｒＧＳＴ
Ｊと略記する。）は、酵素番号を、ＥＣ２，５，１，１
８とする公知の酵素である。

グルタチオンは、哺乳動物等の肝臓に存在する物質であ
つて、末端部位にメルカプト基を有するペプチドとして
その化学構造も既知の物質である。このものは、生体内
に侵入した異物を体外に排泄する作用に関与し、医薬品
としても今日の医療に貢献しつつある周知かつ有用なる
物質である。

その作用機作も研究が進んでおり、生体内に異物が侵入
した場合に、グルタチオンはその自己のメルカプト基に
異物を結合させてグルタチオン抱合体を形成させて脂溶
性を増大せしめ、これによって胆汁中への分泌を促進し
て異物体外排泄作用を営むことが知られている。

ＧＳＴは、上記したグルタチオンの反応を触媒する作用
を有する酵素である。

ＧＳＴはこれまで、グルタチオン−３−アルキルトラン
スフェラーゼ、グルタチオン−Ｓ−了り−ルトランスフ
エラーゼ、グルタチオン−８−アラルキルトランスフェ
ラーゼ、グルタチオンエポキサイドトランスフェラーゼ
、Ｓ−（ヒドロキシアルキル）グルタチオンリアーゼ等
と呼ばれていたが、これらはいずれもその解毒作用の対
象物（即ちその機能）の相違によって種々の呼び名を認
められていたもので、酵素としては同一のものである。

ＧＳＴは現在、等電点の異なる少なくとも６種の多形性
（アイソザイムＩｓｏｚｙｍｅ）が知られている。

これらは、そのサブユニットの構造、カイネティソク、
免疫学的性質等によって識別することができる。ＧＳＴ
というときは、これらの６種の型の総称を意味する。

これらは、Ａ２型、ＡＣ型及びＣ２型の３ｆｔ（以前は
、それぞれＡ型、Ｃ型及びＤ型と呼ばれていたものであ
る。）からなるＡＣグループと、Ｂ２型、ＢＬ型、及び
Ｂ２型の３種（以前はそれぞれ、リガンデイン（ｌｉｇ
ａｎｄｉｎ）　、Ｂ型及びＡＡ型と呼ばれていたもので
ある。、）からなるＢＬグループの、２グループに大別
することができる。これらと、Ｙａ　、Ｙｂ　−、Ｙｂ
’、及びＹｃと呼ばれる４つのサブユニットとの関係を
以下に図示する。

サブユニット　Ｑ＝￥ａ、口＝Ｙｂ。

■＝ｙｂ’、八−ＹＣ％ＢＬグループは等電点が９〜１０を示し、ＡＣグループ
は等電点が８〜９を示す点で明研に相違する。

更にＢＬグループのひとつ（例えばＢ２型）のＧＳＴに
ついて発生する抗体は同グループ内の他のひとつ（例え
ばＢＬ型）にも反応するが、ＡＣグループのＧＳＴ　（
例えばＡ２型）には反応しないというように、２つのグ
ループには免疫学上の明らかな相違が見られる。

図示したように、それぞれの型は同じ大きさの各２つの
サブユニットから構成される。Ｙｂ′は、ｙｂよりも酸
性である。

本発明者は、上記種々の知見に基づいてこれまでこのＧ
ＳＴの医薬上の有用な用途等について種々の研究を続け
て来たが、上記したこれまでに判明しているＧＳＴのい
ずれにも属することのない全く新規なＧＳＴの存在を碑
認するとともに、この新規なＧＳＴが発癌部位に特異的
に存在することをも見いだし、更にこのＧＳＴ特異の抗
体と抗癌物質との結合体が癌部位に特異的に作用するこ
とができることに想到し、本発明に到達し、たちのであ
る。

以下、本発明について詳述する。

本発明に係る物質は、ＧＳＴの一種であって、本発明者
によって初めてう７）胎盤から精製取得することができ
たものである。この新規なＧＳＴ（以下ｒＧＳＴ−ＰＪ
と称する。）は、中性であり、かつ上記した２つのグル
ープとは免疫学的に全く異なるものであり、新規物質で
あることに間違いがない。

本発明に係るＧＳＴ−Ｐは、以下のようにして精製取得
することができる。

妊娠１５日口のラット胎盤から取ったサイトソール（ｃ
ｙｔｏｓｏｌ　）　（細胞質）を、ＣＭ−セファデック
スＣ−５０にかけ、以下、ハイドロキシアパタイトカラ
ム、グルタチオンアフィニティーカラムを用いた連続的
なりロマトグラフィーによって精製し、その後、わずか
に混入しているＡＣグループ及びＢＬグループのＧＳＴ
を、抗ＧＳＴ−ＡＣ抗体及び抗ＧＳＴ−ＢＬ抗体とカッ
プルさせたイミュノアフィニティーカラムを用いて除去
することにより、本発明に係るＧＳＴ−Ｐを得ることが
できた。

上記の精製方法における各種の手法については既に確立
されたものであり、当該技術分野においては既に行われ
ているものであって、本発明者はこれらの手法を組合せ
ることによって本発明に到達することができたものであ
る。その詳細については本発明者は更に説明することが
できる。

上記のようにして得られたＧＳＴ−Ｐは、５ＤＳ（ソデ
ィウムドデシルサルフェート）ポリアクリルアミドゲル
電気泳動によれば、均一の分子量を示すものであったが
、二次元ゲル電気泳動では、等電点が、６．７．６．３
及び６．０の三つのポリペプチドに分離されることが判
った。

ＧＳＴ−Ｐは、他のＧＳＴと同様にサブユニット（Ｙｐ
と称する）から構成されることが判明している。

このものの分子量は、Ｙａ、Ｙｂ（又はＹｂ’）及びＹ
ｃが、それぞれ、２６．５．２７．５及び２８．５キロ
ダルトンであるときに、ｙｐは２６．０キロダルトンで
あった。これらの分子量測定に当たっては、その使用す
るマーカープロティンによって誤差の生じることは一般
に知られている。他のマーカープロティンによれば、Ｙ
ａ、Ｙｂ（又はＹｂ’）及びＹｃがそれぞれ、２２．０
．２３．５及び２５．０キロダルトンを示したときに、
〆ｐは、２１．５キロダルトンであった。

これらの事実は、本発明に係る物質が公知のＧＳＴに比
べてその分子量が小さく、またその等電点が公知のＧＳ
Ｔよりも酸性に偏っていることを示している。

上記知見に基づいて、本発明者はＧＳＴ−Ｐの抗体（以
下「抗ＧＳＴ−Ｐ抗体」と称する）を得ることを企図し
、以下のようにして得ることができた。

上記に詳述したＣ３Ｔ−Ｐｏ、５ｍｇを、家兎に、週に
１回、計３回、コンプリートフロインドアジュバントと
ともに皮下注射し、その後０．５ｍｇのＧＳＴ−Ｐを追
加投与した。

その後、当該家兎の血清を採取することによって本発明
に係る抗ＧＳＴ−Ｐ抗体を含有する血清を取得すること
ができた。

これらの方法における複数の手法については既に確立さ
れたものであり、個々の技術は当該技術分野においては
既に行われているものであって、本発明者はこれらを組
合せることによって目的を達成することに想到したもの
である。

これらの手法の詳細については本発明者は更に説明する
ことができるものである。

しかしながら、上記の方法によって抗ＧＳＴ−Ｐ抗体を
作成するためには、家兎に投与すべきＧＳＴ−Ｐは純度
の高いものでなければならず、要するに、前記したよう
な純粋なＧ　Ｓ　Ｔ　−Ｐを得ることができなければ、
本発明の抗ＧＳＴ−Ｐ抗体を得ることができないことは
明白である。

本発明の要旨の他のひとつは、本発明に係るＧＳＴ−Ｐ
が、化学発癌動物（ラット）の癌部位（肝臓）に特異的
に見いだすことができる点にある。

ジエチルニトロソアミンを単回投与（２００ｍｇ／ｋｇ
体重）して後、２〜４週間　Ｎ−２−フルオレニルアセ
トアミドを投与（食餌中０．０２％）し、肝副除して、
ひきおこされたγ−グルクミルトランスペプチダーゼ陽
性の病巣や、肥大性結節をもつ肝では、二次元ゲル電気
泳動で検出可能な複数のポリペプチドが存在することが
判明した。

本発明者は、それらのポリペプチドが、５２に／６．７
．３６ｋ　／６．７．２６ｋ　／　６．７と６．３（そ
れぞれ分子量／等電点を表わす。）であることを確認し
、これらのうち２６に／６．７　（主）と２６に／　６
．３　（従）のポリペプチドが、二次元ゲル電気泳動と
抗ＧＳＴ−Ｐ抗体を用いたイミュノアフィニティクロマ
トグラフィーにおいてＧＳＴ−Ｐのチャージを有するこ
とを確認した。

また、病巣や結節をもった肝においては、ＧＳＴ−Ａ２
の増加が示された。

これらの事実は、上記のようにして病巣や結節をもった
肝においては、本発明に係るＧＳＴ−Ｐが局在している
ことを示すものである。

本発明者は更に研究を続け、ベルオキシダーゼー抗ペル
オキシダーゼ法（以下ｒＰＡＰ法」という。）によって
、Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ陽性の病巣と肥
大性結節をもつ肝においては本発明に係るＧＳＴ−Ｐが
著しく増加しており、そこにこのＧＳＴ−Ｐが局在する
事実を見いだした。これらの事実は、本発明者によって
初めて知見されたものである。

以下、ＰＡＰ法について説明する。

上記のように化学発癌された肝の切片を用意し、上記し
たウサギ血清に含有された本発明に係るＧＳＴ−Ｐを処
理すると、このものは、ＧＳＴ−Ｐがあるときにはこの
ＧＳＴ−Ｐに抗原抗体反応により反応し結合する。ここ
にさらに、ヒツジ由来のＩｇＧ　（イミュノグロブリン
）抗体を処理すると、ウサギとヒツジの種が実なること
に起因する抗原抗体反応によりこのものが先の抗Ｇ　Ｓ
　Ｔ　−Ｐ抗体に結合する。

本発明者は、上記ヒツジ由来のＩｇＧ抗体がペルオキシ
ダーゼとも抗原抗体反応を有するものであるものを使用
することにより、効率的なＰＡＰ法を行うことができる
ことを応用したものである。

ＰＡＰ法と呼ばれるもののひとつは、ここに使用するＩ
ｇＧ抗体がペルオキシダーゼとは化学結合しかすること
ができないものもあるが、この方法では本発明を有効に
活用することができない。

上記の方法において、抗ＧＳＴ−Ｐ抗体を含有しない家
兎血清を用いた場合には、ＧＳＴ−Ｐ陽性の部位はなか
った。また、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ陽性
の病巣も、ＧＳＴ−Ｐ陽性の病巣も、どちらも正常なラ
ット肝では殆ど検出することができない。

同じ肝ではＴ−グルクミルトランスペプチダーゼ陽性の
病巣とＧＳＴ−Ｐ陽性の病巣の数又は面積に有意の差が
ないことが判明している。

ＧＳＴ−Ｌ２やＧＳＴ−Ａ２は、Ｎ−２−フルオレニル
アセトアミド、３′−メチル−４−ジメチルアミノアゾ
ベンゼン、フエノバルビタール、ブチル化ヒドロキシア
ニソールなどの多くの薬物の短期間投与によって誘発さ
れるが、本発明に係るＧＳＴ−Ｐには、そのような性質
はない。

ＧＳＴ−Ｐはまた、ジエチルニトロソアミンとＮ−２−
フルオレニルアセトアミドによって誘発される分化の良
好な肝癌では増加するが、ＧＳＴ−Ａ２とＧＳＴ−Ｌ２
と同じように３′−メチル−４−ジメチルアミノアゾベ
ンゼンによって誘発される分化の乏しい肝癌では減少す
る傾向にある。

これらの事実は、ＧＳＴ−Ｐ及びそのサブユニットであ
るｙｐが肝の前癌病巣、過形成結節、分化良好な肝癌に
特Ｗ的なマーカープロティンであることを物語るもので
ある。

本発明者は、これまでに知られている多くのＧＳＴとは
全く異なる新規なＧＳＴを胎盤から取得したが、このＧ
ＳＴ−Ｐは胎盤のみに存在するとは限らない。

本発明は、新規物質であるＧＳＴ−Ｐを見いだしたこと
、この新規物質を初めて精製することができたこと、化
学発癌動物の肝癌部位にこの新規物質が特異的に局在す
る事実を見いだしたこと、等をその要旨とするものであ
り、これらの結果から、癌の診断にこの新規物質を応用
することができることに想到したことに、本発明の重要
な要旨がある。

本発明によれば、癌の早期診断に応用することができる
。例えば、血液や生検組織片などを材料として、この中
のＧＳＴ−Ｐの増加の有無を調べることで癌の診断に応
用することができる。

更に、本発明に係る抗ＧＳＴ−Ｐ抗体は、発癌部位に局
在するＧＳＴ−Ｐと特異的に結合することから、この抗
ＧＳＴ−Ｐ抗体と化学療法剤とを結合させて投与するこ
とによって、化学療法剤を発癌部位のみに局在せしめる
ことができる。このような化学療法剤としては、今日用
いられている化学療法剤のすべてを利用することができ
、例えば、５−ＦＵ、マイトマイシンＣ、ドキソルビシ
ン、プレオマイシン、シスジアミンジクロロプラチナ等
を挙げることができる。

以上のように、本発明は癌治療上極めて有用な発明であ
る。

出願人　佐　藤　清　美代理人　弁理士　土居三部

Claims

【特許請求の範囲】以下の物理化学的性質を有するグルタチオン−８−トラ
ンスフェラーゼ。 ■二次元電気泳動で、６．７．６．３及び６．０の三つ
の等電点を示す。 ■公知グルタチオンー３−）ランスフェラーゼのサブユ
ニットＹａ、Ｙｂ及びＹｃがそれぞれ２６．５．２７．
５及び２８．５キロダルトンであるときに２６．０キロ
ダルトンの分子量を示し、かつＹａ、Ｙｂ及びＹｃがそ
れぞれ２２．０．２３．５及び２５．０キロダルトンを
示すときに２１．５キロダルトンを示すサプユニソ）Ｙ
ｐで構成されている。 ■化学発癌動物の病巣部位に特異的に局在している。