JPS60203187A - Ｓ‐テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、その製造法及び酵素酸化法 - Google Patents

Ｓ‐テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、その製造法及び酵素酸化法

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JPS60203187A
JPS60203187A JP60034713A JP3471385A JPS60203187A JP S60203187 A JPS60203187 A JP S60203187A JP 60034713 A JP60034713 A JP 60034713A JP 3471385 A JP3471385 A JP 3471385A JP S60203187 A JPS60203187 A JP S60203187A
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    • C12Y103/03—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with oxygen as acceptor (1.3.3)
    • C12Y103/03008—Tetrahydroberberine oxidase (1.3.3.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 超業上の利用分野 本発明はＳ−テトラヒドロゾロトペルベリンオキシダー
ゼ、その製造法及び酵素酸化法に関する。このオキシダ
ーゼは、酸素の存在でＳ−テトラヒドロプロトベルベリ
ン群並ヒに５−１−ベンジルイソキノリン群から選ばれ
る化合物の酸化を、相応するグロトベルベリン又は相応
−ｊる３、４−ジヒドロ−ベンジルイソキノリン及び過
酸化水素を形成して接触する。
本発明の課題は、Ｓ−テトラヒｒロノロトベルベリンオ
キシダーゼである。前記酵素は、次のパラメータによっ
て特注を有する二 ｆａｔ　分子ｚｉｏｏｏｏｏ±１Ｕ％（デ／ＪＪｉｌ過
によって測定）、 ｔｂｌ　等電点５．７、 ｉＣｌ　最適温度４０”Ｃ ｔｄｌ　最適−＝８．９ １ｅｔ　４１　’Ｑ及びｐＨ＝　８．９　テ（７）　Ｒ
、８−コｌｊ　ハルミンのＫＭ値１．６μモル、 ＋ｆｌ　励起波長４５０　ｎｍでの螢光放射スペクトル
５２０　ｎｍの最大強さ、 ＋ｇｌ　アセチルアセトン又はモリンの存在で完全でか
つ逆転する抑制、 由）補欠基フラビン。
Ｓ−テトラヒーロプロトベルベリンオキシダーゼは、バ
パベラカエ（Ｐａｐａｖｅｒａｃａｅ　）、ベルベリダ
セアエ（Ｂθｒｂθｒｉｄａｃｅａｅ　）＼　〆ニスペ
ルマセアエ（Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍａｃｅａｅ　）　、ア
ンノナセアエ（ＡｎｎＯｎａＣθａｅ　）及びランウン
クラセアエ（ＲｆｌｎｕｎＣｕｌａＣθａθ）の科から
選ばれる植物を抽出して得られる。
パパベラカエ（Ｐａｐａｖｅｒａｃａｅ　）科からの適
当な植物の１＋ＩＪは、アルダ９ノネ（Ａｒｇｅｍｏｎ
ｅ　）　、パパベル（Ｐａｐａｖｅｒ）及びエシュシオ
ルトチア（Ｅｅｃｈｓｃｈｏｌｔｚｉａ　）種である。
・特別の例は、アルｒノネ・プラチセラス（Ａｒｇｅｍ
ｏｎｅ　ｐｌａｔｙｃｅｒａｓ）及びエシュシオルトチ
ア・カリフオルニカ（Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｔｚｉａ　ｃ
ａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　）である。
ベルペリダセアｘ　（５ｅｒｂｅｒｉａａｃｅａｅ　）
科からの植物の例は、ベルベリス（１３θｒｂｅｒｉｅ
　）　−ｉｔ＆　テある。特別の例は、ベルベリス・ベ
アニアナ（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ　ｂｅａｎｉａｎａ　）ペ
ルベリス・ストロニフエラ（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ　５ｔｏ
ｌｏｎｉｆθｒａ　）ベルペリス・アリスタタ（Ｂｅｒ
ｂｅｒｉｓ　ａｒｉｓｔａｔ、ａ　）　ｌ’Ｌびベルベ
リス・ウイルソナエ・パル・スデカウリアラタ（Ｂｅｒ
ｂｅｒｉｓ　Ｗｉ１９０ｎａｅ　Ｖａｒ、　５ｕｂｃａ
ｕｌｉａｌａｔａ　）である。
メニスペルマセアエ（Ｍｅｎｉθｐｅｒ＋ｎａｃｅａｅ
　）科からの特別の例は、シサンペルス・ムクロナタ（
ＣｉＣ１５ｓａθ１ｕｓ　ｍｕｃｒｏｎａ　ｅａ　）で
あり、ランウンクラセアエ（ＲａｎｕｎｃｌｌｌａｅＧ
ａｅ　）科からの特別の例は、タリクトルム・ゲラウク
ム（Ｔｈａｌｉｃｒｔｒｕｍｇ］、ａｕｃｕｍ　）であ
る。
アンノナセアエ（Ａｎｎｏｎａｃｅａｅ）科からは例と
して、アユ／ノナ・レテイクラタ（Ａｎｎｏｎａ　ｒｅ
ｔｉｃｕｌａｔａ　）が挙げられる。
植物性物質としては、好ましくはＯｉＪ記植物の細胞培
４物を使用する。しかしながら不発明による酵素を製出
するためには、別の植物又は根を包言する植物の部分を
使用してもよい。
植物性物質の抽出は、既に従来酵素を植物から抽出する
ことのできた方法“によって行なう。
通常、先づ植物の細胞培養物又は・１目応する細胞培養
物を分解するようにして行なう。このためには、植物性
物ノＷを好ましくシま冷凍し、例えば液体窒素の温度で
場合により破砕し、最後にＰＨ６〜１０の水性調合物に
吸収させる。水性調合物としては、殊に前記−の範囲に
迩（−だ緩衝溶液、例えば燐酸塩緩衝溶１Ｗを使用する
。
場合により溶解しない植物を分離した後に、蛋白質の沈
澱は電解質（殊に鎖酸アンモニウム）の添加によって行
われるのに過ぎない。沈殿蛋白質は続いて緩衝浴液（ｐ
Ｈ＝　６〜１０）に吸収させ、ゲル濾過を施こす。ゲル
濾過によって、分子の大きさの割合により存在する蛋白
質混合物の脱塩並ひに分離が行われる。更に後処理する
ために、分子計＞　７０　ＬＪ　Ｌｌ　（Ｊの蛋白質を
含有するデル濾過からの溶離液ヲ使用する。他の積装工
程は、イオン父侯剤（例えばジエチルアミノエチルセル
ロース）での蛋白質混合物のクロマトグラフィーによる
分輔及び続く異なる濃度の塩化カリウム浴液での溶離で
ある。この場合浴雛液の選択は、常に酵素活性のＡ螢の
割合いによる。所望の場合には、他の又は付加的分離法
、例えば電気泳動その他を使用してもよい前記後処理法
は水浴液系、特にｐＨ６〜１０、殊に７〜９の緩衝浴液
中で温度４〜１５”Ｃで行・なう。
本発明方法によって、Ｓ−テトラヒドロプロトベルベリ
ンオキシダーゼの”８９に相応する酵素活性を有する水
溶液又は場合により冷凍乾燥の調合物が得られる。
それ数本発明の課題は、Ｓ−テトラヒドロプロトベルベ
リンオキシダーゼを含有する酵素活性組成物である。
本発明による酵素は、屡々倚利に固だ状態で使用するこ
とができる。このためにシよ、酩索馨公知方法で担持材
料に物理的に吸着させるか又は化学的に吸着させる。担
持材料のし１］は、アル４ｙｔｅ塩、官能基を有するア
がロース、セルロースポリアクリル樹脂（例えはオキシ
ラン基を有する）、ガラス、珪酸塩である。
本発明による酵素は、Ｓ−テトラヒドロフ０ロトベルベ
リン又は５−１−ベンジル−１，２゜６．４−テトラヒ
ドロイソキノリンの酸化を峻素の存在で接触し、その１
榮相応するテロトペルベリン又は３．４−ジヒドロ−ベ
ンジルイソキノリンが得られる。
それ故更に本発明の課題は、 一般式： 〔式中”１　ｒ　Ｒ２＋　Ｒ５＋　Ｒ６及びＲ７ｊよ水
素、ヒドロキシ基、アルキル示及びアルコキシノ、すを
表わし、Ｒ１＋Ｒ２並びにＲ５＋　Ｒ６；まメチレン基
１〜２個を有するジオキサ−アルキレン基ｙｅｔに成し
てもよ（、Ｒ３は水素又’１″！、ＯＨ基に表わし、Ｒ
４は水素を表わしＮ　ＲＱは水素反びＣ原子１〜３個を
有するアルキル基を表わし、史にＲ，十Ｒ８はメチレン
架橋を衣わしてもよい］のＳ−配置を有する化合物の酵
素酸化法であり、この方法は酸化を、Ｓ−テトラヒドロ
プロトベルベリンオキシダーゼの存在で行なうことを特
徴とする。
好ましくはＲ１＋　Ｒ２＋　Ｒ５＆びＲ６ｌ圭水素、Ｏ
Ｈ基、メチル−、エチル−、メトキシ−及びエトキシ基
である。Ｒ８は、珠に水木位びメチル基である。
本発明により酸化ずべぎ化合琶Ｊの例は、次のものであ
る： コリハルミン、コリタルミン、スナロビン、インコリパ
ルミン、コテミン、ステホリジン、ジスクレタミン、コ
リテンシリン、カバウリミン、コリダリン、レチクリン
、ノルレチクリン。
テトラヒＰロパパベリン、Ｎ−メチルテトラヒドロパパ
ペリン、オリエンタリン、イソオリエンタリン、ノルイ
ソオリエンタリン、ノルオリエンタリン、プロトジノメ
ニン、ノルデロトシ／ｌニン、カナジン、テトラヒｒロ
バルマチン、スクーレリン、コレキシミン、コクラウリ
ン：Ｎ−メチル−コクラウリン：ツルーコクラウリン。
１−ベンジル−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキ
ノリン。
１−ベンジル−６−ヒドロキシ−１，’２．３゜４−テ
トラ上１０−インキノリン。
１−ベンジル−６−メドキシー１．２，３．４−テトラ
ヒドロ−イソキノリン。
１−ベンジル−７−ヒドロキシ−１，２，３゜４−テト
ラヒドロ−イソキノリン。
１−ベンジル−７−メドキシー１．２．３．４−テトラ
ヒドロ−イソキノリン。
１−　（３’−ヒドロキシ−ベンジル）−１，２゜６．
４−テトラヒドロ−イソキノリン。
１−（３’−ヒドロキシ−ベンジル）−６−ヒドロキシ
−１，２，３，４−テトラヒドロ−・インキノリン。
１−　（３’−ヒドロキシ−ベンジル）−６−メドキシ
ー１＋２＋３＋１−テトラヒドロ−イソキノリン。
１−　（３’−ヒドロキシ−ベンジル）−７−ヒドロキ
シ−１，２１６，４−テトラヒｒローイソキノリン。
１−　（３’−ヒドロキシ−ベンジル）−７−メドキシ
ー１．２，３．４−テトラヒドロ−インキノリン。
１−　（３’　、　４’−ジヒｒロキシーベンジル）−
１，２，３，４−テトラヒドロ−インキノリン。
１−（５’、４’−ジヒげロキシーベンジル）−６−ヒ
ドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリ
ン。
１−（３’、４’−ジヒドロキシ−ベンジル）−６−メ
ドキシー１．２．３．４−テトラヒドロ−・イソキノリ
ン。
１−　（３’　、　４’−ジヒドロキシ−ペンシル）−
７−ヒーロキシー１．２，３．４−テトラヒドロ−イソ
キノリン。
１−　（３’　、　４’−ジヒーロキシーベンジル）−
７−メドキシー１．２．３．４−テトラヒドロ−イソキ
ノリン。
１’−（３’、５’−ジヒーロキシーベンゾル）−６−
ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドローインキハ
ン。
１−　（３’　、　５’−ジヒーロキシーベンジル）−
６−メドキシー１．２．３．４−テトラヒげローイソキ
ノリン。
１−　（３’　、　５’−ジヒドロキシ−ペンシル）−
７−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソ
キノリン。
１−（６′、５′−ジヒドロキシ−ベンジル）−７−メ
ドキシー１．２，３．４−テトラヒドローイソキハン。
１−（３’、４’−ジメトキシ−ベンジル）−１゜２．
３．４−テトラヒドロ−イソキノリン。
１−（３’、４’−ジメトキシ−ベンジル）−６−ヒー
ロキシー１．２．３．４−テトラヒーローイソキノリン
。
１−　（３’　、　４’−ジメトキシ−ペンシル）−７
−ヒ１０キシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキ
ノリン。
１−　（３’　、　４’−ジメトキシ−ベンジル）−６
−メドキシー１．２．３．４−テトラヒドロ−インキノ
リン。
１−（３’、４’−ジメトキシ−ベンジル）−７−メド
キシー１．２，３．４−テトラヒドロ−イソキノリン。
１−　（３’−メトキシ−４′−ヒドロキシ−ベンジル
）−１，２，３，４−テトラヒドロ−インキノリン。
１−　（３’−メトキシ−４′−ヒト０ロキシーペンシ
ル）−６−ヒドロキシ−１，２１６，４−テトラ上１０
−イソキノリン。
１−　（３’−メトキシ−４′−ヒドロキシーペンゾル
）−６−メドキシー１．２．５．４−テトラヒダローイ
ソキノリン。
１−（゛６′−メトキシー４′−ヒドロキシ−ベンジル
）−７−ヒｒロキシ−１，２１，６，４−テトラ上１０
−イソキノリン。
１−　（３’−メトキシ−４′−ヒげロキシーベンジル
）−７−メドキシー１．２．３．４−テトラヒドロ−イ
ソキノリン。
１−（３’　、　５’−ジメトキシ−ベンジル）−１゜
２．３．４−テトラヒドロー、インキノリン。
１−　（３’　、　５’−ジメトキシ−ベンジル）−６
−ヒドロキシ−１，２，５，４−テトラヒドロ−イソキ
ノリン。
１−　（３’　、　５’−ジメトキシ−ペンジル）−７
−ヒげワキシー１．２，３．４−テトラヒげローイソキ
ノリン。
１−（３’、５’−ジメトキシ−ベンジル）−６−メド
キシー１．２．３．４−テトラヒドロ−イソキノリン。
１−（３’、５’−ジメトキシ−ベンジル）−７−メド
キシー１．２．３．４−デトラヒドローイソキノリン。
ｉ　−（３’−ヒドロキシ−４′−メトキシ−ベンジル
）−１，２，３，４−デトラヒーローイソキノリン。
１−　（３’−ヒドロキシ−４′−メトキシ−ベンジル
）−６−ヒげロキシー１．２．５．４−テトラヒドロ−
イソキノリン。
１−　（３’−ヒドロキシ−４′−メトキ７−ベンジル
）−７−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−
インキノリン。
１−　（５’−ヒドロキシ−４′−メトキシ−ベンジル
）−６−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−
イソキノリン。
１−　（３’−ヒ＋ｙロキシー４′−メトキシーベンジ
ル）−７−ヒドロキシ−１，２，５，４−テトラヒドロ
−イソキノリン。
１−　（３’、　４’、　５’−）リヒドロキシーペン
ジル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン
。
１−　（３’　、　４’　、　５’−トリヒドロキシ−
ペンシル）−６−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラ
ヒーローイソキノリン。
１−　（３’、　４’、　５’−トリメトキシ−ベンシ
ル）−６−ヒ１０キシ−１，２，３，４−テトラヒダロ
ーイソキノリン。
１−　（３’、　４’、　５’−トリメトキシ−ベンシ
ル）−１，２，ろ、４−テトラヒトミ−イソキノリン。
１−　（３’、　Ａ’、　５’−）リメトキシーベンジ
ル）−６−メドキシー１．２，３．４−テトラヒドロ−
イソキノリン。、 反応温度は１０〜７０℃、殊ＶＣ３５〜４５℃である。
本発明方法は酸素の存在、殊に空気の存在で行なう。
好ましくはなお溶剤、例えばジメチルスルホキシド又は
メタノールその他を貧有していてもよいＰ）（６〜１０
．殊にｐＨ８〜９のＳ−テトラヒドロプロトベルベリン
スは８−ｉ−ベンジル−１，２，５，４−テトラヒドロ
−イソキノリンの調合物に、酵素調合物水静液又は酵素
が固定状態で存在する調合物ケ添加し、酸素、殊に空気
を添加しながら撹拌するようにして行なう。
基質の量に対して使用ずべき酵素のｉ：は乗璧ではない
。この量は、所望の生成物の変換車の割合によって使用
する。］小常は使用すべき基質１モルに対して、酵素の
量は１〜５０１１殊に１５〜２０ｇの範囲内で使用する
。
反応の進行は、例えば測光の調整によって行なう。
前記方法によって、選択的にテトラ上１２０デｑ　ｌ−
ベルベリン又は１−ベンジル−１，２，３，４−テトラ
ヒドロ−イソキノリンのＳ−形が酸化される。それ故こ
の方法は、エナンチオマー混合物を分離するか又はＳ−
形からＲ−形を裏山するのに適当である。この場合Ｂ　
−、ｊ；、＋７　（・ま侵されない。このＲ−型は、Ｓ
−型の酸化によって得られたプロトベルベリン又は６，
４−ジヒドロ−ペンシルイソキノリンから公知方法、例
えはクロマトグラフィーによって分離することができる
。
テトラヒドロプロトベルベリン又は１−ベンジル−１，
２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリンのエナンチオ
マー混合物を分Ｐｉｌｌ：する指示された方法では、Ｓ
−型の酸化物は内びＲ−型又はＲ／Ｓ−混合物を形成し
て還元して原料が得られる。還元剤としては、例えば硼
酸ナトリウムが役立つ。
好ましくはエナンチオマーを分胤又シまＳ−型からＲ−
型を製出する方法は、循環工程として実施する。この場
合好ましくは本発明による酵素は固定形で使用する。そ
れ故周期は、エナンチオマー混合物又はＳ−型から出発
して次の工程からなる二 ｌａｌ　原料のＲ−型を維持してのＳ−型の選択的酵素
酸化、 ｆｂｌ　Ｒ−型又はＲ／Ｓ−混合物を再製出しての酸化
生成物の還元、 ＩｃＩ　Ｒ／Ｓ−混合物の酸化工程への還流。
この循環工程を数回（り返して、実際に純粋なＲ−型の
テトラヒドロプロトベルベリン又は１−ベンジル−１，
２，６，４−テトラヒドロ−イソキノリンが得られる。
工業上Ｎ要なのはＲ−型のいくつかのテトラヒドロプロ
トベルベリンであり、これハナかんずく生理学上有効な
アルカロイドをＪＲ造する原料又は中間生成物として使
用する。
例えばレチクリン又はＳ−レチクリンのエナンチオマー
混合物又はノルレチクリン又はＳ−ノルレチクリンのエ
ナンチオマー混合物を、本発明によるエナンチオマー分
離法によって、Ｒ−レチクリン又＋ｉ　Ｒ−ノルレチタ
リンに変換することができ、これらはコディン又はモル
フインを合成するための重要な中曲生成物として役立つ
。
実施例 例　１ Ｓ−テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼの製造
。
液体室累で冷凍し、ベルベリス・ウイルソナエ・パル・
スプカウリアラタ（Ｂａｒｂθｒｉｓ　ｗｉｌｅｏｎａ
ｅ　ｖａｒ、　５ｕｂｃａｕｌｉａｌａｔａ　）からな
る細胞培養物２２０．！ｉ’を、ＫＨＰＯ４／ＫＨ２Ｐ
Ｏ４緩爾浴液（５０ミリモル、ｐ＋４＝７．４）４４０
ゴ中で２０分間攪拌した。生じた細胞の均−物を続いて
濾別し、遠心分離した。上澄みに固体硫ｎＲアンモニウ
ム２り６．！１１（７０％の飽和が得られるまで）を添
加した。その除虫じた蛋白質沈殿物を遠心分離して除き
、遠心分離物をＫＨＰＯ４／ＫＨ２Ｐ０４緩衝溶液（５
０ミリモル、ｐｉ−１＝７．４）２０ゴに吸収させた。
続いて得られた溶液に、ｒルイ慮過ＣＬＫＢ社のウルト
ラｒル（Ｕｌｔｒａｇｅｌ　）　Ａｃ八へ４−柱〕を施
こした。酵素活性を有する溶離散からのフラクション（
Ｓ−ノルレチクリンの１．２−ｆヒドロノルレチクリン
への呈色反応によって試験）を採取し、セファｏ−ゼ（
５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）分離柱〔マドレックス量ブルー
（Ｍａｔｒｅｘ　Ｂｌｕｅ　）　Ａ、アミコン（Ａｍ１
ＣＯｎ　）社製〕に装入した。未分別も離散をＤｇＡＥ
セルロースＫＭ層させ、欠いで蔦まる濃度の塩化カリウ
ム浴液（ＫＣＶ宮−縫０〜３３０ミ！７モル）で溶離し
た。
酵素活性フラクションを採取し、限外濾過によって濃縮
し、脱塩した。伶られた生成物シま、比活性度２．２　
ｎｋａｔ　／蛋白質１ｍσを有していた。
収率は４１．４％であった。
生成物を、なおポリアクリルアミドグ９ルの不連続的電
気泳動によって均一にした。使用したｒル系は、アクリ
ルアミド菩欲７．５貞−峡係で採集ゲルではｐＨＥ３．
３　、分離デルでシま、Ｈ９，５を有していた。砿極の
緩衝浴液のｐＨは８．６であった。
最後に酵素活性を有する分離デルの成分を、５０ミリモ
ルのＫＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４緩衝浴液で溶離した。
酵素の比活性度：　６．２　ｎｋａｔ　／蛋白質１η（
組成抽出物に対して１５５＠の（１ｇ　＜ＳＭにイｌ応
）。
１１５ン：率　二　２５　％　。
例　２ 固定Ｓ−テトラヒＰロゾロトベルベリンオキシダーゼの
装造。
Ｓ−テトラヒｒロプロトベルベリンオキシダーゼを、硼
１！！２／硼酸ナトリウム／　ＨＣ７緩衝浴液（０，１
モル、ｐＨ８，９）にとかし酵素活性度２．２ｎｋａｔ
／蛋白％　１＃＋９及び蛋白質含ｔ　１．１２　”９／
Ｍ／を有する酵素調合物６ｄを、５甫１η係のアルギン
酸塩水浴液５０ｍ１Ｋ攪拌しながら加えた。
続いて酊素宮有アルギン＃１．溶液を、５゛Ｃで攪拌し
ながら０．１モルの塩化カルシウム水浴液５００麻に滴
加した。
アルギン酸カルシウムでの固定酵素の球状生成物が得ら
れ、これをなお硼酸／硼酸す）　ＩＪウム／　ｌ−ＩＣ
１緩衝溶液で洗浄した。調合物は酵素活性度０．５５　
ｎｋａｔ　／蛋白質１ダを有していた。
例　６ Ｒ，Ｓ−ノルレチクリンの１．２−デヒドロノルレチク
リンへの酸化。
ＲＸＳ−ノルレチクリン１［ＪＯｎ＋９（３１６μモル
）乞、４ｊｌｌ戚／硼酸ナトリウム／　ＨＣＩ緩債浴液
（Ｕ−１モル、ｐＩ′Ｉ＝　８．９　）　Ｉ　Ｕ　（Ｊ
ｒｒｔｌにとかした水＝ａに、Ｓ−テトラヒドログロト
ベルベリンオキシダーゼ（２，１ｎｋａｔ　／ｒｒｑ　
；蛋白質０．１５ｍｙ／ＷＬｅ）の酵素調合物１０罰乞
添加した。反応温度は６７′Ｃであった。空気を偉人し
て１６時間撹拌した。反応の進行を、試料の取出しと測
光分析とで調整した。
１６時間後に、Ｓ−ノルレチクリンの１．２−デヒドロ
ノルレチクリンへの１０［Ｊ％のｆ撲率を確かめた。
例　４ Ｒ，８−コリパルミンのゾヤトロルリジンへの酸化。
Ｒ，Ｓ−コリパルミン５　ｒｌＱ　＜　１４．７μモル
）を、硼酸／硼ナトリウム／　ＨＣ１緩１１１ｉｉ浴液
（、Ｈ＝８．９．０．１モル）にとかした水Ｍ／ｆ１口
Ｌｌ罰に、Ｓ−テトラヒドロゾロトベルペリンオキシダ
ーゼ（２，１ｎｋａｔ　／Ｉｎ９及び蛋白質［Ｊ、１５
ｍｙ７ｒｒｔ）の酵素調合物１０罰を添加した。反応温
度は６７℃であった。空気を導入して２時間攪拌した。
反応の進行を、試料の取出しと測定光分析とで調整した
。
２時間後に、Ｓ−コリバルミンのジャトロルリジンへの
１［Ｊ［Ｊ％の変藻率を確かめた。Ｒ−コリバルミンは
変化しないで存在していた。
例　５ Ｓ−ノルレチクリンのＲ−ノルレチクリンへの変換。
ｌａｌ　例２のように酵素活性度０．２　ｎｋａｔを有
する固定Ｓ−テトラヒーロゾロトベルベリンオキシダー
ビのアルキル酸カルシウム５Ｕｇｖ、Ｓ−ノルレナクリ
ン３０　、’ｎ９を硼酸／硼酸ナトリウム／　ＨＣ１緩
衝溶液（１，１モル、ＰＨ＝　８．９　）　１０１ｄと
とかしたｍ液中で温度３　［３−Ｃで空気を導入し、て
１５０時間振盪した。測光分析によって、Ｓ−ノルレチ
クリンの１．２−ｆヒドロノルレチクリンへの完全な反
応を確かめた。
仄いでＶ−別し、ｄ−ｉＴ＆に少；にづつボラン化ナト
リウム２０　ｕｖを添加した。最初の黄色の浴液を直ち
に脱色した。Ｓ−ノルレチクリンとＲ−ノルレチクリン
との１＝１の混曾物が得られた。
ｌｂｌ　ｔａｌによって得られたＳ／Ｒ−ノルレチクリ
ン混合物を、０．１モル−塩酸を添ｖＩ′ｌシてＰＨ８
゜９にし、１ａ）に記載の方法によって酵：Ｉｒ、酸化
を施こした。
還元後に、Ｒ−ノルレチクリンろ部及びＳ−ノルレチク
リン１部を官有する混合・吻が得られた。
例　６ ＲＸＳ−カナジンのベルベリンへのｊ１１！２化。
例４による方法を、ＲＸＳ−コリバルミンの代りに、Ｒ
，Ｓ−カナジン５　ｆ？　（１４，７ｍモル）を使用す
る別法でくり返した。
２時間後に、Ｓ−カナジンのベルベリンへの１００％の
反応を確かめに。Ｒ−カナジンは変化しないで存在して
いた。
例　７ Ｒ）　５−（１−（３’、５’−ジヒにロキシーペンジ
ル）−６−メドキシー１，２１ろ、４−テトラヒドロ−
イソキノリン〕のば化。
例６による方法ｉ、Ｒ，Ｓ−ノルレチクリンの代りに、
Ｒ、Ｓ　−（ｉ　−（３’　、　ｂ’−ジヒドロキシ−
ベンジル）−６−メドキシー１．２．３．４−テトラヒ
ドロ−イソキノリン’１１００１ｖを使用する別法でく
り返した。
１６時間後に、Ｓ−（１−（３’、　５’−ジヒドロキ
シ−ベンジル）−６−メドキシー１．２゜６．４−テト
ラヒドロ−イソキノリン〕の１−（３’　、　５’−ジ
ヒドロキシ−ベンジル）−６−メドキシー６．４−ジヒ
ドロ−イソキノリンへの１００チの反応を確かめた。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 ｉ　Ｓ−テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ。 ２、　次のパラメータ： ｔａｌ　分子量１００口００±１０　％　（’Ｉ’ｌｌ
    ）、Ｍ過によって測定）、 ｌｂｌ　等電点５．７、 ＩｃＩ　最適温度４０°Ｃ （山　最適ｐＨ＝８．９ Ｉｅ１４０″Ｃ及びｐＨ＝８．９でのＲ，Ｓ−コリパル
    ミンのＫＭ値１．３μモル１ １ｆ＋　励起波長４５０　ｎｍでの螢光放射スペクトル
    ５２０　ｎｍの最大強さ、 ｔｇｌ　アセチルアセトン又はモリンの存在で′完全で
    かつ逆転する抑制、 （ムｌ）補欠基フラビン を有する、特許請求の範囲第１項記載のＳ−テトラヒド
    ロプロトベルベリンオキシダーゼ３、　１ＲｙＲベラカ
    ニ（ｐａｐａｖｅｒａｃａｅ　）　、、ベルベリダセア
    エ（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ　）　、メニスペルマ
    セアエ（Ｍｅｎｉｅｐｅｒｍａｃｅａｅ　）　、アンノ
    ナセアエ（Ａｎｎｏｎａｃｅａｅ　）及びランウンクラ
    セアエ（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ　）の科からの植
    物から抽出して得られた特許請求の範囲比１項記載のＳ
    −テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ。 ４、特許請求の範囲第１項記載のＳ−テトラヒドロプロ
    トベルベリンオキシダーゼを貧有する酵素活性組成物。 ５・ノクパベラカエ（ｐａｐａｖｅｒａｃａｅ　）　、
    ベルベリダセアエ（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ　）、
    メニスペルマセアｘ　（Ｍｅｎｉｅｐｅｒｍａｃｅａｅ
    ）、アンノナセアエ（ＡｎｎＯｎａＣｅａｅ　）及びラ
    ンウンクラセアエ（Ｒａｎｕｎｃｕ’１ａｃｅａｅ　）
    の科からなる植物乞抽出することヲ特徴とするＳ−テト
    ラヒド口ゾロトベルベリンオキシダーゼの製造法。 ６．一般式： 〔式中Ｒ１＋　Ｒ２＋　Ｒ５＋　Ｒ６及びＲ）は水素、
    ヒドロキシ基、アルキル基及びアルコキシ基を表わし、
    Ｒ１＋Ｒ２並びにＲ５＋　Ｒ６はメチレン基１〜２個を
    有するジオキサ−アルキレン基を形成してもよく、Ｒ３
    は水素又はＯＨ基を表わし、Ｒ４は水素を表わし、Ｒ８
    は水素及びＣ原子１〜６個を有するアルキル基を表わし
    、史にＲ４＋　Ｒ８はメチレン架橋を表わしてもよい〕
    のＳ−配置を有する化合物乞酵素酸化する方法において
    、酸化を、Ｓ−テトラヒげロゾロトベルベリンオキシダ
    ーゼの存在で行な５ことを特漱とする酵素酸化法。
JP60034713A 1984-02-24 1985-02-25 Ｓ‐テトラヒドロプロトベルベリンオキシダーゼ、その製造法及び酵素酸化法 Granted JPS60203187A (ja)

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DE3406774.4 1984-02-24

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DE3482836D1 (de) 1990-09-06
JPS6351675B2 (ja) 1988-10-14
US4657861A (en) 1987-04-14
EP0154035A2 (de) 1985-09-11
DE3406774A1 (de) 1985-08-29
ATE54939T1 (de) 1990-08-15
EP0154035B1 (de) 1990-07-25

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