JPS60207597A - 固定化酵素を用いた生体成分の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は固定化酵素を用いた生体成分の定量法に関する
。

（従来技術） 生体成分２例えば血清中に微量に存在する胆汁酸などを
定量する際に、生体成分が螢光光度計などの検出器によ
って直接検出することが困難な場合がある。このような
場合には上記生体成分と酵素の存在下で酵素反応を行い
うる反応成分をあらかじめ添加した試料溶液を酵素が固
定化された担体が充填されたカラム（固定化酵素カラム
）に導き、そこで生体成分と反応成分とを反応させ、生
成物を検出器により検出する方法が有効である。

例えば米国特許第４．１５３．５１３号公報には血清に
含まれる生体成分を定量する方法の開示がある。それに
よれば、生体成分を含有する試料溶液は測定時に妨害成
分となりうる高分子成分があらかじめ透析器により除去
されていなければならない。しかもこの試料溶液は、固
定化酵素カラム内で酵素反応をうけて後比色計により測
定され系外へ排出される糸路と、比色計により測定され
て復線固定化酵素カラムを通って系外へ排出されるブラ
ンク用糸路との２種の糸路を通りうる。この方法では、
透析装置が不可欠であるとともに。

透析と固定化酵素カラム内での酵素反応とが定常状態に
入り検出器による検出値が安定しなければ生体成分の測
定が正確になされ得ない。そのため生体成分の定量に時
間がかかるうえに、多量の試料溶液が必要となる。また
、上記いずれの糸路に切り換えても試料溶液が固定化酵
素カラムを通過しなければならないため、固定化酵素は
試料溶液に含まれる生体成分により早期に失活する。

（発明の目的） 本発明の目的は、固定化酵素を用いて少量の試料溶液中
の生体成分を短時間で正確に測定しうる方法を提供する
ことにある。本発明の他の目的は。

固定化酵素を長期間にわたって失活させることなく使用
できる生体成分の定量法を提供することにある。本発明
のさらに他の目的は、透析器を用いないにもかかわらず
妨害成分の影響を受けずに生体成分を正確に測定しうる
方法を提供することにある。

（発明の構成） 本発明は、生体成分とこれと反応しうる反応成分とを含
む試料溶液を酵素の固定されていないカラムに通しその
ブランク値を測定する一方、同量の同試料溶液を固定化
酵素カラムに通しそこで生ずる酵素反応生成物質を測定
すれば、測定値とブランク値とから生体成分を高精度で
定量できるとの発明者の知見により完成された。それゆ
え本発明の固定化酵素を用いた生体成分の定量法は（１
１生体成分を含む一定量の試料溶液を固定化酵素の充填
された単数もしくは複数の固定化酵素カラムに導く工程
、（２）該固定化酵素カラムから流出する酵素反応生成
物を含有する試料溶液を測定する工程。

（３）前記酵素の担持されていない担体のみが充填され
たコントロールカラムに、前記工程（１）の試料溶液と
同種でかつ同量の試料溶液を導く工程、（４）該コント
ロールカラムから流出する試料溶液を測定する工程、お
よび（５）該固定化酵素カラムからの流出試料溶液と該
コントロールカラムからの流出試料溶液との測定値の差
を算出する工程を包含し。

そのことにより上記目的が達成される。次に本発明の定
量法は９例えば、第１図に示される定量装置により具体
化される。

この装置は、第１図および第２図に示すように。

緩衝液を収容する緩衝液槽１が定流量ポンプ２を介して
注入器３に連結されている。注入器３は六方パルプ４を
介してコントロールカラム５および固定化酵素カラム６
に連結されている。これらカラム５および６はさらにこ
の六方パルプ４を介して検出器である螢光光度計７に連
結されている。

螢光光度計７は記録計９に連結され、その測定型光度が
表示される。

上記緩衝液には酵素の作用により測定すべき生体成分と
反応しろる反応成分１例えば胆汁酸を定量する場合のニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ”″）な
どが含有される。この緩衝液は定流量ポンプ２によりカ
ラム５および６に供給される。生体成分を含む試料は注
入器３に供給される上記緩衝液で試料溶液に調製され、
同じくカラム５および６に供給される。固定化酵素カラ
ム６には、適当な担体に固定化された所望の酵素が充填
されている。酵素としては２例えば、３α−胆汁酸を定
量する場合には、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼ（３α−Ｈ３Ｄ）が用いられる。　３α−Ｈ３
Ｄの触媒作用により３α−胆汁酸と大過剰に存在するＮ
ＡＤ”とが反応しＮＡＤ”は還元されてＮＡＤＩ（にな
る。生成ＮＡＤＨのモル数は３α−胆汁酸のモル数に相
当する。

このＮＡＤＨは強い螢光を発する。この螢光度が螢光光
度計７により測定され記録計９に表示される。カラム６
を出た溶液は廃液槽８へ導かれる。

上記担体の材質には特に制限はないがセルロースなどの
ように試料溶液中の物質との間で何らの相互作用も生じ
ない物質を用いることが測定時間を短くしうる点で好ま
しい。試料溶液に含まれる複数の生体成分を測定する場
合には、逆に相互作用をもつ適当な担体を選択すること
により、複数成分を分離溶出させることが可能となる。

コントロールカラム５には、酵素を担持していない担体
のみが充填されている。六方バルブ４の切り替えにより
、試料溶液を固定化酵素カラム６に代えてこのコントロ
ールカラム５に導くことにより、試料溶液の螢光量のブ
ランク値を知ることができる。記録計９に記録されるブ
ランクのピークは試料溶液に最初から存在するＮＡＤＨ
，血清中のアルブミンなどの螢光物質を示す。固定化酵
素カラム６を経て得られる記録計９のピーク面積′　か
らコントロールカラム５を経て得られる記録計９のピー
ク面積を差しひいて得られる値が酵素反応に起因するＮ
ＡＤＨに相当する。この値をあらかじめ作成された検量
線に適用し所望の生体成分。

この場合は３α−胆汁酸、の定量値を得ることができる
。試料溶液を各カラムに導くときには特に順序はなく、
固定化酵素カラムが先であってもコントロールカラムが
先であってもよい。

同一生体試料に存在する複数成分を測定する場合には、
第３図〜第５図もしくは第６図に示すように、複数の固
定化酵素カラムが並列に設けられる。例えば血清に含有
される胆汁酸のうち３α−胆汁酸と３β−胆汁酸の各々
の定量を行うときには、第３図のように、３α−Ｈ３Ｄ
の充填された固定化酵素カラム１６と３β−Ｈ３Ｄの充
填された固定化酵素カラム１７が併設される。カラム１
５はコントロールカラムである。六方バルブ１３および
１４を順次切り替えることにより試料溶液は、第３図。

第４図および第５図に示すように、順次、カラム１５、
１６およびＩ７に導かれる。このようにして、複数個の
生体成分、この場合は３α−胆汁酸と３β−胆汁酸とが
順次定量されうる。

本発明におけるコントロールカラムは次のような機能を
果たす。

例えば試料が血清であるとき、この血清に食事により摂
取した油分が油滴として浮遊している場合がある。この
ような試料溶液をコントロールカラムを経ずに測定系内
に導入してブランク値を測定すると、この油滴がその形
状をくずすことな（そのままの状態で検出器に入る。他
方、固定化酵素カラムには、酵素を固定化した直径数十
μｍの充填剤が充填されている。試料溶液中の油滴は。

この直径数十μｍの充填剤の間を通り抜けていくうちに
くずれて、さらに直径の小さな油滴となって検出器に入
る。検出器として螢光光度針が用いられる場合には、励
起光が照射されると。

油滴の大きさによって励起光の散乱のされ方が異なる。

油滴に由来する散乱光、言いかえれば迷光もブランク測
定で相殺されるはずであるが、このように、乳濁した検
体では油滴の大きさが違うので測定誤差となって現れる
。

コントロールカラムを設けていないとブランク測定時に
は試料溶液は、配管により直接検出器に入るため、試料
液は検出器のセルを１０〜２０秒で通過する。他方、固
定化酵素カラムを通る測定時にはカラム間で試料溶液が
拡散するために、同量の試料溶液の通過時間は１〜２分
である。この結果。

記録計に記録されるそれぞれのピークは、前者が非常に
鋭いピークとなり、後者はなだらかなピークとなる。ピ
ークの大きさは含有される螢光量つまり生体成分含有量
に比例するから９本来２両者のピークは形状によらず酵
素反応寄与分を除いて面積は同じである。ところがピー
ク面積をマイクロコンピュータ−を応用した積分針で測
定すると。

両者のピークの形状が著しく違うため１本来等しいはず
の面積が等しく計算されに（い事態を生じる。これはマ
イクロコンピュータ−がピークの始点や終点を認識する
とき２つのピークで匂配の差がありすぎるため、読みと
り誤差を生じるからである。このようなピーク面積を正
確に測定するプログラムを組むのは困難である。このよ
うな理由からブランク値を測定するためのコントロール
カラムは重要な役目を果していることが理解できる。

このカラムが存在するため、乳濁した検体であっても正
確に生体成分が測定される。検出器通過時間の差による
ピーク形状の差異もなくなり、マイクロコンピュータ−
による読み取りの誤差もなくなる。

本発明方法は、胆汁酸の他に各種のステロイド類の定量
に広く利用されうる。検出方法も螢光分析法のほかに、
比色定量法など各生体成分に応じた種々の方法が適用さ
れる。

（実施例） 以下に本発明を実施例により説明する。

大隻炭よ 粒径約８０μｍのセルロース粒子５　ｍ　ｉｔを担体と
して用い、これにイオン交換水５ｍｌ、２Ｍ炭酸ナトリ
ウム水溶液１０ｍＪを加えて攪拌したのち。

あがらしめシアン化ブロマイド２ｇを溶解させたアセト
ニトリル１ｍβを加え、激しく攪拌しながら９０秒間反
応させた。このようにして活性化させたセルロース粒子
をすばや＜　０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）　、　
イオン交換水、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１
Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）で順次洗浄した。これにシ
ュードモナス・テストステロー二属細菌由来の１７β−
ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１７β−Ｈ３
Ｄ）４４■を溶解させた０、５Ｍの塩化ナトリウムを含
む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）　５　ｍ　ｊ！を
加え、室温で２時間攪拌して反応させ、　１７β−Ｈ３
Ｄを担体上に固定した。１７β−Ｈ３Ｄを固定化した担
体表面になお存在する活性点をブロックするため、　０
．０５％の２−メルカプトエタノールを含む０．ＩＭｌ
−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）を加えて４℃で２時
間反応させた。

このようにして得られた酵素固定化担体を０．５Ｍの塩
化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）
　、　イオン交換水、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む
０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）で順次、繰り返し洗
浄した。これを、長さ１００ｍ、内径４ｆｉのカラムに
充填し、１７β−Ｈ３Ｄ固定化酵素充填カラム（固定化
酵素カラム）６を得た。

他方、同質のセルロース粒子を０．５Ｍの塩化ナトリウ
ムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）　、イオン
交換水、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０，１Ｍ炭酸
緩衝液（ｐＨ９，５）で繰り返し洗浄したのち。

長さ１００鶴、内径４鶴のカラムに充填し、コントロー
ルカラム５を得た。

上記のようにして得た。コントロールカラムと固定化酵
素カラムとを第１図に示すように接続した。ｌｉ中にＮ
ＡＤ’″を１９９■含有する０、１Ｍピロリン酸緩衝液
（ｐＨ９，５）を緩衝液槽１に入れ。

バルブ４を、第１図の状態とした。定流量ポンプ２で、
１ｍ１１７分の流量で送液し、送液が安定した時点で、
健康人より採取した血清Ｑ、１ｍｎ！を注入器３により
注入し、緩衝液と混合させた。このようにして得られた
試料溶液は、第１図の矢印で示される流路でコントロー
ルカラム内を流れ、注入後２分間ですべての試料が螢光
光度計７を通過した。ただちに、バルブ４を切り替えて
、第２図に示される流路とした。同一の血清Ｑ、１ｍｆ
ｆ１を再び注入器３により注入した。この試料は固定化
酵素カラム６で酵素反応を行い、注入後２分ですべての
試料が螢光光度計７を通過した。螢光光度計７は、島津
製作所製ＲＦ−５３０型螢光光度針を用い、励起波長３
６０ｎａ＋、螢光波長４６０ｒｖで測定を行った。第７
図に示される螢光強度一時間曲線を得た。第７図のピー
クｂの面積とピークａの面積の差より、別にめた検量線
から、被検血清中のテストステロンを主成分とする１７
β−性ホルモンの濃度は、　０．７６βｇ／　ｍ　ｊ！
と算出された。

叉崖炭主 実施例１と同様の方法で１７β−Ｈ３Ｄの代わりに３α
−Ｈ３Ｄを用いて３α−Ｈ３Ｄ固定化酵素カラム１６を
調製した。さらに３β−Ｈ３Ｄを用いて３β−Ｈ３Ｄ固
定化酵素カラム１７を得た。実施例１と同様にコントロ
ールカラム１５を調製して得た。

上記の３種類のカラムを第３図に示すように接続した。

実施例１と同じ緩衝液を緩衝液槽１０に入れ、まずバル
ブ１３．１４をそれぞれ第３図の状態とし、定流量ポン
プ１１で、１ｍ１１７分の流量で送液した。送液が安定
した時点で、肝硬変患者より早朝空腹時に採取した血清
０．０１ｍｊ！を注入器１２により注入し、Ｉｌ衝液と
混合させた。このようにして得られた試料液は第３図の
矢印で示される流路でコントロールカラム内を流れ、注
入後２分間ですべての試料が螢光光度計化を通過した。

ただちにバルブ１４を第４図に示されるように切り替え
た。

同一の血清０．０１ｍＪを再び注入器１２により注入し
た。この試料は３α−Ｈ３Ｄ固定化酵素カラム１６で酵
素反応を行った後、再注入後、２分ですべての試料が螢
光光度計１８を通過した。ただちにバルブ１３および１
４を第５図に示されるように切り替えた。同一の血清０
．０１ｍｊｌを注入器１２により注入した。この試料は
３β−Ｈ３Ｄ固定化酵素カラム１７で酵素反応を行い注
入後、２分ですべての試料が螢光光度計１８を通過した
。螢光光度計１８による検出は、実施例１と同様の条件
で行い、第８図に示される螢光強度一時間曲線を得た。

第８図のピークＣがカラム１５を通過いたブランク値に
相当する。

ピークｄとピークＣおよびピークｅとピークＣのそれぞ
れの面積の差をめ、別に作成した検量線により、被検血
清中の３α−胆汁酸および３β−胆汁酸濃度は、それぞ
れ２８．２μモル／Ｌ　２．１μモル／ｌと算出された
。

実施■１ 実施例１と同様の方法で１７β−Ｈ３Ｄの代わりに３α
−Ｈ３Ｄを用いて３α−Ｈ３Ｄ固定化酵素カラム２６を
調製した。さらに１７β−Ｈ３Ｄの代わりに３β−Ｈ３
Ｄ、７α−Ｈ３Ｄを用いてそれぞれ３β−Ｈ３Ｄ固定化
酵素カラム２７および７α−固定化酵素カラム２８を得
た。別に実施例１と同様にコントロールカラム２５を調
製して得た。

上記の４種類のカラムを第６図に示すように接続した。

実施例１と同じ緩衝液を緩衝液槽２１に入れ２次にレオ
ダイン社製ロータリーバルブ２４を。

２４１の位置にして、定流量ポンプ２２で１　ｍ　ｊ！
　／分の流量で送液した。送液が安定した時点で肝外胆
汁うつ滞患者の早朝空腹時血清０．０１ｍ／を注入器２
３で注入し、緩衝液と混合させた。このようにして得ら
れた試料溶液はコントロールカラム２５内を流れ注入後
２分間ですべての試料が検出器２９を通過した。ただち
にバルブ２４を２４２の位置に切り替えて、同一の試料
０．０１ｍ　１２を注入器２３で注入した。

この試料は３α−Ｈ３Ｄ固定化酵素カラム２６で酵素反
応を行い、注入後２分間ですべての試料が検出器２９を
通過した。以下、上記と同様に順次、バルブ２４を２４
３．２４４の位置に切り替え、その都度同一試料を注入
し、固定化酵素カラム２７．２８内で反応を行わせた後
、検出器２９に導いたゆただし、７α−Ｈ３Ｄと反応す
る７α−胆汁酸は、血清中の濃度が極めて低いため、バ
ルブ２４を２４４の位置に切り替えた時には試料を０．
０２ｍ　ｌ！注入した。

検出器２９は、柳本製作所製のポルタンメトリー検出器
ＶＭＤ−１０１を用い電流強度一時間曲線を得た。これ
を螢光強度に変換し螢光強度一時間曲線との関係として
第９図に示す。第９図のピークｆがブランク測定に相当
する。ピークｇとピークｆ、ピークｈとピークｆならび
にピークｉＸ％とピークｆの、それぞれの面積の差をめ
た。別に作製した検量線から被検血清中の３α−胆汁酸
。

３β−胆汁酸および７α−胆汁酸濃度は、それぞれ１５
．３μモル／Ｉｔ、３．５μモル／！および１．４μモ
ル／ｌと算出された。

（発明の効果） 本発明のよれば、このように、固定化酵素を用い少量の
試料で短時間に正確な生体成分の定量が行われうる。試
料溶液が少量ですむため酵素が早期に失活することもな
い、透析などの手段によりあらかじめ試料を精製してお
かなくても測定時に妨害成分の影響を受けることがない
。さらに、酵素を固定していないカラムをブランク測定
時の流路に設けたため、乳濁した試料を用いても生体成
分が正確に測定されうる。記録計に現れたピークはマイ
クロコンピュータ−により正確に読み取られるため、測
定が効率よく行われうる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法を具体化するための１種類の生体
成分を定量する定量装置の一例を示すフローダイヤグラ
ム；第２図は第１図の装置の他の接続状態を示す要部フ
ローダイヤグラム；第３図〜第５図はそれぞれ本発明の
方法を具体化するための２種類の生体成分を定量する定
量装置の一例を示すフローダイヤグラムおよび第３図の
装置の他の接続状態を示す要部フローダイヤグラム；第
６図は本発明の方法を具体化するための３種類の生体成
分を定量する定量装置の一例を示すフローダイヤグラム
；第７図は上°記第１図および第２図の装置を用いて得
られた螢光強度一時間曲線；第８図は第３〜５図の装置
を用いて得られた螢光強度一時間曲線；第９図は第６図
の装置を用いて得られた螢光強度一時間曲線である。 以上 出願人　積水化学工業株式会社 第１図 第２図 第３図 １日 第４図 ６ 第５図 第６図 第７図 時間（合） 第８図 澗藺怜） 第９図 曲間（分）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ｉ１）生体成分を含む一定量の試料溶液を固定化酵素
   の充填された単数もしくは複数の固定化酵素カラムに導
   く工程。 （２）該固定化酵素カラムから流出する酵素反応生成物
   を含有する試料溶液を測定する工程。 （３）前記酵素の担持されていない担体のみが充填され
   たコントロールカラムに、前記工程（１）の試料溶液と
   同種でかつ同量の試料溶液を導く工程。 （４）該コントロールカラムから流出する試料溶液を測
   定する工程、および （５）該固定化酵素カラムからの流出試料溶液と該コン
   トロールカラムからの流出試料溶液との測定値の差を算
   出する工程。 を包含する固定化酵素を用いた生体成分の定量法。 ２、前記生体成分がステロイド化合物であり。 前記酵素がヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであ
   る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記ステロイド化合物が該酵素反応により生ずる一
   還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが螢光分
   析法で測定される特許請求の範囲第２項に記載の方法。