JPS60210998A - 無機リン酸塩の酵素学的測定用試験組成物、試験具及び試験方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は一般的には試験組成物の技術分野に関するもの
であり、更に詳しくは、尿若しくは血液（血清若しくは
血漿）のような液体中の無機リン酸塩の測定に有用な試
験組成物に関する。

従来技術 無機リン酸塩、ＨＰＯ４”−及びＨ，Ｐ０４″″の試験
は診断用の手段として特に有用である。例えば、血清無
機リン酸塩濃度は骨折の治癒過程、上皮小体機能低下（
不全）症及びベージェット病並びに末端巨大症及び脱水
症において上昇しビタミンＤ欠乏症、吸収不良症及び高
インシュリン血病並びにアステオマラシア（Ａｓｔｅｏ
ｍａｌａｃｉａ　）、副甲伏線機能光進症及びその低回
種類の症状時に低下する。

生物学的液体中の無機リン酸塩（Ｐｉ）を測定するため
の従来の方法は、二つのカテゴリー、スなわち１化学的
方法及び酵素的方法に分類することができる。

全ての化学的方法は強酸性条件下で行われることを要す
る。また生物学的液体中に存在する不安定な有機リン酸
塩の加水分解は、無機リン酸塩について誤って高い値を
与える原因となる。

無機リン酸塩の酵素的測定法がいくつか提案されている
。シュルツ、ディー・ダブル（Ｓｃｈｕｌｚ。

Ｄ、Ｗ、）等は、アナリティヵル・バイオケミストリー
（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ、）第１９巻、第３００頁（１
９６７年発行）にホスホリラーゼ、グルコースリン酸ム
ターゼ（ホスホグルコムターゼ）及びグルコース−６−
リン酸塩デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）の使用を基礎
とする無機リン酸塩の酵素的測定方法を提案している。

還元型のニコチンアデニンヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が
形成される。この形成されたＮ　Ａ　Ｄ　Ｉ（は紫外領
域で分光光学的に監視されるが、これは、試料中の無機
リン酸塩濃度に直接的に比例している。スコープス、ア
ール・ケイ（Ｓｃｏｐｅｓ、　Ｒ１，Ｋ、　）はＡｎａ
ｌ、　ｌ３ｉｏｃｈｅｎｎ、第４９巻、第８８頁（１９
７２年発行）に、リン酸塩試験がグリセルアルデヒド−
３−リン酸デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）の使用に基
づくもう一つの酵素的経路の使用を提案している。この
試験法においても１スペクトルの紫外領域におけるＮＡ
ＤＨの監視が必要であった。

無機リン酸塩試験に関する第三の酵素的経路は、ピルビ
ン酸オキシダーゼの使用を基礎とする米国特許第４．２
４６．３４２号において、ミサヵ（Ｍｉｓａｋａ）等に
より提案された。発生した過酸化水素は、トリンダー型
（Ｔｒｉｎｄｅｒ　ｔｙｐｅ）指示薬系、４−アミノ７
エナゾン及び置換型アニリンを用いることにより、可視
領域において監視された。

ダブル、アイ、ワング（Ｗ、　１．　Ｈｗａｎｇ　）等
は、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　、第５５巻、第３７
９頁（１９７３年発行）において、無機リン酸塩の別の
酵素的測定法を提案した。

ここにおいて、生成した尿酸は、紫外スペクトル領域の
２９０ナノメータ（ｎｍ　）において監視される。しか
しながら、この方法は、生物学的試料には適用されなか
ったが、その場合、多量の内因性の尿酸の存在はブラン
ク試料を必要としたであろう。

クレーベｅアール・ジエイ（Ｋｌｅｂｅ　ｎ、　Ｊ、　
）等はバイオケミカル・ジエネテイツクス（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。

Ｑ６ｎｅｔｉｃｓ）、第１９巻、第９２１頁（１９８１
年発行）において、ワンプの反応機序を利用し色原体と
してニトロブルーテトラゾリウムを用いることによりリ
ン酸塩を発生する酵素のゲル電気泳動バンドを可視化し
ている。この方法は、無機リン酸塩を遊離させるアイソ
ザイムの定性的な検出手段として用いられた。

マチダ、ワイ（Ｍａｃｈｉｄａ、　Ｙ）等は、アグリカ
ルチャラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー　
（Ａｇｒｉ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）第４６巻、
第８０７頁（１９８２年発行）において、無機リン酸塩
試験のためにワンプの反応機序を利用した。エンテロバ
クタ−クロアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌ
ｏａ−ｃｅａｅ）カ得られた特定のキサンチンオキシダ
ーゼを試験に用いた場合には、Ｐｉ濃度はトリンダー指
示薬系、４−アミノアンチピリン及びフェノールを用い
て過酸化水素の生成を追跡することにより可視領域で測
定することができた。マチダ（Ｍａ−ｃｈｉｄａ）は可
視領域における定量試験はミルクキサンチンオキシダー
ゼを使用した場合にはなし得なかったと述べている。牛
乳キサンチンオキシダーゼは市販されている噌−のキサ
ンチンオキシダーゼ源である。

これらの酵素的方法の一つとして市販されている物質を
用いて無機リン酸塩を鋭敏且つ精密でしかも便利に検出
する試験法を提供するものはない。

発明のｉ要 本発明は、無機リン酢塩の、敏感で正確且つ再現性ある
試験法を提供するものである。本発明の試験法は容易に
入手しうる市販材料を用い、かつスペクトルの可視領域
において監視されるので日常的な臨床上の用途に便利で
ある。尿や血液（血清若しくは血漿）のような体液をは
じめとする液体試料中の無機リン酸塩の酵素学的分析を
可能とする試験用組成物、試験具及び試験方法が開示さ
れる。

本発明の組成物はイノシン、プリン−ヌクレオシドホス
ホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ及びテトラゾリウ
ム塩からなる。

本発明は、下記の説明及び特許請求の範囲の記載を考慮
することによって、一層十分な理解が得られるであろう
。

試験組成物は、イノシン、プリン−ヌクレオシドホスホ
リラーゼ、キサンチンオキシダーゼ及びテトラゾリウム
塩を含む。さらに、約５〜１２の範囲のｐＨを与える緩
衝剤が存在しなければならない。この緩衝剤は試験組成
物中に包含せしめてもよいし、あるいは、リン酸塩含量
の試験に先がけて試料中に加えてもよい。試験組成物は
、さらに電子メディエータ（ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｅｄ
ｉａｔｏｒ）をも含有していることが好ましい。安定剤
、界面活性剤若しくは分散剤のような他の成分を本発明
の特許請求の範囲から逸脱しない範囲で加えることがで
きる。

形成されたホルマザンの濃度はいかなる所定時間におい
てもリン酸塩濃度に比例し、そのため、終点法若しくは
速度試験法のいずれかを用い得る。

無機リン酸塩の測定は下記の反応機序に従って行われる
。

全ての試験組成物の成分は市販されているいかなるキサ
ンチンオキシダーゼでも利用することができるが特に好
ましいキサンチンオキシダーゼは牛乳から得られたもの
である。

テトラゾリウム塩は１．２．３．４−テトラゾールの２
．３．５位−芳香族置換誘導体か、あるいは二個のテト
ラゾリウム環が芳香族の基により連結されたジテトラゾ
リウム化合物のいずれであってもよい。有用なテトラゾ
リウム塩の具体例は、３−（４’、５’−ジメチル−２
−チアゾリル）　−２，４−ジフェニル−２Ｈ−テトラ
ゾリウムプロミド（ＮＴＴ若しくはチアゾリル・ブルー
）及び２−（１）−ヨードフェニル）−３−（ｐ−二ト
ロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムク
ロリド（Ｉ　Ｎ　’Ｉ’　）、３．３’−（３，３’−
ジメトキシ−４，４’−ジフェニレン）−ビス−（２−
Ｐ−ニトロフェニル−５−フェニル）−２Ｈ−テトラソ
リウムクロリドにトロブルー・テトラゾリウム若しくは
ＮＢ　’］”　）及び３．３’−（ジメトキシ−４，４
′−ジフェニレン）−ビス−（２，５−ｐ−ニトロフェ
ニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（テトラニトロ
ブルー・テトラゾリウム若しくはＴＮＢＴ）である。

上記のテトラゾリウム塩のうち３−（４’、５’−ジメ
チル−２−チアゾリル）　−２，４−ジフェニル−２Ｈ
−テトラゾリウムプロミド（ＭＴＴ若しくはチアゾリル
・ブルー）が特に好ましい。

テトラゾリウム塩指示薬によるホルマザンの発色は電子
メディエータを添加することにより促進することができ
る。７エナジンメトスル７エイト及び１−メトキシフェ
ナジンメトスル７エイトのようなフェナジン塩、８−ジ
メチル−アミノ−２゜３−ベンゾフェノキサジン（スル
ドラ・ブルー（Ｍｅｌｄｏｌａ　Ｂｌｕｅ　）　）、７
−アミノ−３−イミノ−３Ｈ″−フェノチアジン（チオ
ニン）若しくはテトラメチルアミドフェノチアジンクロ
リド（メチレンブルー）のような他の化合物を電子メデ
ィエータとして使用することがでとる。好ましい電子メ
ディエータは１−メトキシ−フェナジンメトスルフエイ
トである。試験組成物に包含し若しくは試験前に試料中
に加えるために適切な緩衝剤としては、トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタンＮ−Ｚ−ヒドロキシエチルピ
ペラジン−Ｎ’−２−エチルスルホン酸、３−（Ｎ−モ
ルホリノ）プロパンスルホン酸、Ｎ、Ｎ’−ビス（２−
ヒドロキシエチル）−２−アミノエチルスルホン酸、Ｎ
−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタ
ンスルホン酸、Ｎ−２−ヒト日キシエチルピペラジンプ
ロパンスルホン酸及びジェタノールアミン等が挙げられ
る。上記の全ての緩衝剤は、約５〜１２の範囲のｐＨを
与えることができる。好ましい実施例におけるｐＨは６
．θ〜１１．０の範囲内である。

実施可能であり且つ好ましい濃度範囲を以下に示す。

イノシン　０．０１−１０　ｒｒ＋ＭＯ，１−２ｒｒ＋
Ｍキサンチンオキシダーゼ　０．１−１５００ＩＪＪ、
／Ｌ　１−１００１．Ｕ、／Ｌテトラゾリウム塩　０．
０５−３０　ｍＭ　Ｏ，１−５ｍＭ電子メディエータ　
０−１０００　μＭ　１−２００　μＭ緩術剤のｐｌ−
１５，０−１２，０８，０−１１，０緩衝剤の溶積モル
濃度　１０−１０００ｍＭ　３０−３００　ｍＭ界面活
性剤　０−１０％（ｗ／ｖ）　０．１−３％（ｗ／ｖ　
）単位：　ｍＭ　（ミリモル）、μＭ（マイクロモル）
、％ｗ／ｖ　（体積当りの重量％） Ｉ、Ｕは酵素活性の国際単位である。ＩＩ。

Ｕ、は特定のｐＨ及び温度条件下で分間当りの１マイク
ロモルの基質の転化に触媒として働くために必要とされ
る酵素活性である。プリン−ヌクレオシド−ホスホリラ
ーゼに関する上記のＩ、Ｕ、はｐＨ７４及び湿度２５℃
の条件下で基質イノシンについて測定される。キサンチ
ンオキシダーゼに関する上記の１．Ｕは、ｐＨ’Ｚ　６
及び温度２５℃の条件下で基質ヒボキサンチンについて
測定される。リットル当りの１国際軍位（Ｉ。

Ｕ、／Ｌ）は保存溶液１リツトル（Ｌ）当りの酵素活性
の１国際軍位である。

試験組成物は、水、生理溶液のような溶媒若しくは水と
メタノールのような有機溶媒との混合物を用いて調製さ
れた水溶液の形で使用することができる。

試薬は、キット形式、例えば、１又はそれ以上の上記成
分を含有している一組のピンで供給されるか、溶液、若
しくはあらかじめ混合された凍結乾燥粉体あるいは単一
試薬溶液として使用するために再構成できる錠剤の形で
供給することかできる。キットには、所望ならば、適当
なリン酸塩標準物質を含有せしめることができる。

あるいはまた、試験用組成物を担体マトリック・スに含
有せしめて乾燥試験具を提供することもできる。いずれ
の場合においても、この試験は無機リン酸塩を含有する
試料を試験用組成物に接触させ、さらにホルマザン染料
により形成された色を測定することにより行われる。色
の形成は、通常、可視領域、一般的には５００　ｎｍと
６００　ｎｍ間で比色計若しくは可視光度計を使用する
ことにより機器分析により測定される。発色は、いかな
る時点でも、リン酸塩濃度に比例することから、終点法
あるいは速度検定法のいずれを使用してもよい。

あるいはまた、色の形成は適切なカラーチャートが提供
されるならば、目視のみにより測定が可能で、この場合
、半定量試験を行なうことができる。

本出願において用いられる「担体マトリックス」なる用
語は、特定量の試験用組成物を含有せしめるに適したも
のならばいかなる手段をも指す。数多くのそのような担
体マトリックスが知られている。具体的には、とりわけ
米国特許第３．８４６．２４７号、第３．５２２．９２
８号、第４．０４６．５１３号及び第４．０４６．５１
４号、フランス特許第２．１７０．３９７号、英国特許
第１．３６９．１３９号及び第１．３４０゜６２３号を
参照。従って、本発明の試験具の製造に当っては、他の
ものと同様にこのような担体マトリックスの全ての概念
を使用することに考えを致すべきである。マトリックス
には、水溶液と接触して破裂する高分子マイクロカプセ
ルのような、これらのいかなる成分をもあるいは全ての
成分を物理的に閉じ込める系が含まれる。しかしながら
、現在のところ乾式試験具の現在好ましいとされる調製
方法はろ紙のような多孔性の担体マトリックスに試験組
成物を含浸させ、次いで、含浸されたマトリックスを支
持部材に貼りつける方法である。

含浸は単に一片のろ紙を試験用組成物の溶液に浸すこと
により行うことができる。乾燥は含浸された組成物に害
を及ぼさない全ての方法により行うことかできるが、通
常はエアーオープンによる乾燥方法を使用する。乾燥さ
れた紙は、その後切断され且つ支持部材、例えば硬質若
しくは硬質のポリスチレンフィルム片、の一端に固定す
ることかできる。支持部材片上への紙の固定は登録商標
■ ＤＯＵＢＬＥ　５ＴＩＣＫ　として３Ｍ社（３ＭＣｏ、
）から市販されているような両面接着テープを使用して
行うことかできる。試験具は、瞬間的に試料に浸すか、
さもなくば、試料を担体マトリックスに導入することに
よりｆｆｆｉ便に使用することが可能であり、この試験
具の使用によって、無機リン酸塩が存在する場合には検
出可能な変化（例えば、色の変化）が起こる。

下記の実施例Ｉ及び■は溶液の形の本発明の試験組成物
を使用して行なわれた無機リン酸塩の試験について記載
する。実施例■］は試験具の調製の手順を説明する。こ
れらの実施例は本発明を説明するために役立つものでは
あるが、それらは、特許請求の範囲によってのみ限定さ
れる本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでは
ない。当業者ならば、組成物中の成分及び活性成分並び
に反応のパラメータを所望のものに変形、置換若しくは
変更することかできる。

実施例１ 試験用組成物、溶液 試験用組成物は下記の組成に従って水溶液として調製さ
れた。使用された化学薬品及び酵素は市販されているも
のを利用することかできる。本発明の試験はリン酸塩の
測定を目的とするために、全ての試薬類には本質的にリ
ン酸塩は含まれていなかった。

試験組成物 イノシン　０４５　ｍＭ プリン−ヌクレオシドリン酸塩　９０１．Ｕ、／Ｌキサ
ンチン　オキシダーゼ　９　１．Ｕ、／Ｌ１−メトキシ
−フェナジンメトスルフエイト　３０　μＭ表面活性剤
（トリトン（’ｌ”ｒｉｔｏｎ■）Ｘ−１００）　０．
３％ｗ／ｖ一連のリン酸塩標準液を調製した。上記の試
験用組成物２．０ミリリツトル（ｙｔｌ　）を各々のリ
ン酸塩標準液の少量（α０２ｄ）に加え、１５分後に５
７８ナノメーター（ｒｌｍ）（光路長１センチメートル
）における吸光度を測定した。試験の吸光度のブランク
を試験吸光度から差し引くと、真の吸光度を与えた。与
えられた値をプロット（デシリットル（売）あたりのミ
リグラムＣ■）で表わされたリン酸塩濃度に対する吸光
度）して、標準曲線を得た。

リン酸塩標準液の吸光度はリン酸塩濃度に対して一次比
例した（第１表参照）。

第　１　表 リン酸塩Ｃ■／ｄ（／　）　吸　光　度２．５　α２６
３ ５．０　０５２６ ７５　０７８５ １０．０　１．０５０ １５．５　１．５７９ 体液試料を同様な方法で試験した。

試料のリン酸塩濃度はそのサンプルの真の吸光度値を標
準曲線に対比させて決定した。

実施例２ 率 既知量のリン酸塩を、あらかじめリン酸塩試験を行った
血清又は血清のプールに添加−し、同数百分率（測定さ
れたリン酸塩の総量から最初に測定されたリン酸塩を差
し引いたものを、加えられたリン酸塩のパーセントとし
て表わされた値）の平均値は１０α４％であった（第２
表参照）。

第　２　表 血清プールに添加された無機リン酸塩の同数百分率 加えられたリン酸の量（”Ｑ／ｄρ）１ｇｌ収百分率１
．２５　９９．５ ２．５０　１００．０ ５．００　１０１０ ８．００　９９．０ １１００　１０２．０ １５．００　１０１．０ 平均値　１００．４ 上記回収率は、本発明の試験用組成物が溶液中における
リン酸塩の定量的測定を可能とすることを表わしている
。

試験具の調製 無機リン酸塩の酵素学的測定に用いる試験具は実施例１
の試験組成物を担体マトリックスに包含せしめることに
より調製される。例えば、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ
の登録商標）１７番のろ紙を、試験組成物を含有する溶
液に浸漬し、さらにエアーオーブン中６０℃で乾燥させ
て調製することができる。２．５Ｘ２．５センチメート
ル四方の乾燥含浸紙を両面接着テープを用いてポリスチ
レン片に貼着し試験具を作成した。

本発明の試験具は、液体試料に瞬間的に浸すか、あるい
は、試料な担体マトリックスに尋人することにより簡便
に使用される。

検出筒ｆｆ１２な色の変化は無機リン酸塩が存在する場
合に起る。発色は無機リン酸塩濃度に依存するために、
半定量試験は適切なカラーチャートがあると可能である
。また、定量試験は適切な反射率を読みとる装置を使用
すれば可能である。

錠剤若しくは試薬マトリックスを初めとする他の形態も
試験具の調製に使用することができる。

本発明の精神及び範囲を逸脱しない限りにおいて、本発
明に関し、他の多くの修正及び変形を行うことができる
ことは明らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　イノシン、プリン−ヌクレオシドホスホリラーゼ
   、キサンチンオキシダーゼ及びテトラゾリウム塩からな
   ることを特徴とする液体試料中の無機リン酸塩の酵素学
   的測定用組成物。 ２、　キサンチンオキシダーゼが牛乳から得られたもの
   である特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ａ　電子メディエータをさらに含む特許請求の範囲第１
   項記載の組成物。 生　約５．０〜１２．０の範囲のｐＨを与え得る緩衝剤
   をさらに含む特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ５、　イノシン、プリン−ヌクレオシドホスホリラーゼ
   、牛乳から得られたキサンチンオキシダーゼ、テトラゾ
   リウム塩、電子メディエータ及び約６．０〜１１．０の
   範囲のｐＨな与え得る緩衝剤からなる特許請求の範囲第
   １項記載の組成物。 ０　イソシン、プリン−ヌクレオシドホスホリラーゼ、
   キサンチンオキシダーゼ及びテトラゾリウム塩からなる
   組成物を包含した担体マトリックスからなることを特徴
   とする無機リン酸塩の酵素学的測定用試験具。 ７　イノシン、プリン−ヌクレオシドホスホリラーゼ、
   牛乳から得られたキサンチンオキシダーゼ、テトラゾリ
   ウム塩、電子メディエータ及び約６．０〜１１．０の範
   囲のｐＨを与え得る緩衝剤からなる組成物を包含せしめ
   た担体マトリックスからなる特許請求の範囲第６項記載
   の試験具。 ８、　約５．０〜１２．０の範囲のｐＨを与え得る緩衝
   物質、イノシン、プリン−ヌクレオシド、ホスホリラー
   ゼ、キサンチンオキシダーゼ及びテトラゾリウム塩から
   なる組成物に試料を接触させ且つ検出可能ないか々る応
   答をも観察することを特徴とする無機リン酸塩の酵素学
   的測定方法。 ９、　キサンチンオキシダーゼが牛乳から得られたもの
   である特許請求の範囲第８項記載の測定方法。 ｌα　電子メディエータをさらに含む特許請求の範囲第
   ８項記載の測定方法。 １１、約５．０〜１２．０の範囲のｐＨを与える緩衝剤
   をさらに含む組成物に試料を接触させる特許請求の範囲
   第８項記載の測定方法。 １２、イノシン、プリン−ヌクレオシドホスホリラーゼ
   、牛乳から得られたキサンチンオキシダーゼ、テトラゾ
   リウム塩電子メディエータ及び約６．０〜１１．０の範
   囲のｐＨを与え得る緩衝剤からなる組成物に試料を接触
   させる特許請求の範囲第８項記載の測定方法。 １ａ　緩衝剤、イソシン、プリン−ヌクレオシドホスホ
   リラーゼ、キサンチンオキシダーゼ及びテトラゾリウム
   塩からなる組成物を包含せしめた担体マトリックスから
   なる試験具を試料に接触させ、且ついかなる検出可能な
   応答をも観察することを特徴とする無機リン酸塩の酵素
   学的測定方法。 １４、キサンチンオキシダーゼが牛乳から得られたもの
   であり、さらに、電子メディエータ及び約６．０〜１１
   ．０の範囲のｐＨを与え得る緩衝剤からなる組成物を□
   担体マトリックスに包含せしめてなる試験具に試料を接
   触させる特許請求の範囲第１３項記載の測定方法。