JPS60217898A - 異種タンパス質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は生化学工学の分野に属す。さらに詳しくはこ
の発明は異種タン・ぞり質の収量を改良する為に異種タ
ンパク質−生産性組換体細胞を培養する為の方法に関す
るものである。

〔従来の技術〕

微生物を培養する為の合成的に及び化学的に定義された
培地は良く知られている。異種ポリペシタイドを生成す
る事ができる組換体細菌を増殖せしめる為に、細菌を培
養する常用の栄養培地が使用されている。たとえばヨー
ロッノ４特許出願８１３０１２２７．５（１９８１年９
月３０日に第００３６７７６号として公表された）を参
照のこと。

培養期間を通して、そのような栄養培地の中にはカザミ
ノ酸が含まれている。

エタノールはＥ、コライ（＆ｃｏｌｉ）の物質交代に色
々な効果を持つ事が知られている。Ｉｎｇｒａｍ　。

〔問題点を解決するための手段〕

この発明は、炭素原子数１〜４個の水溶性アルカノール
の有効量及び／又は培養の終期部分において細菌の増殖
を助けるアミノ酸の混合物の有効量でもって培地を補充
する事をなどを含んでいる液体栄養培地の中において組
換体細菌を培養する事によりて生成される異種タンパク
質の収量を改良する方法に関するものである。

〔具体的な説明〕

この明細書において１異種”という語は野生型細菌によ
って生成されないポリペブタイドと解釈する。この発明
の方法によって作られる異種ポリペシタイドは典型的に
は産業的な、農業的なまた健康管理上の用途を有するで
あろう。はとんどの場合、このポリペブタイドは真核細
胞タン／４り質またはビールスタン・ぐり質と実質的に
同一なアミノ酸配列を持つ非細菌性４リペゾタイドであ
ろう。

これに関し、′実質的に同一”という語は次のような事
を意味する。すなわち微生物によって生成される合成ポ
リベグタイドのアミノ酸配列及び天然のポリペブタイド
のアミノ酸配列が同一であるかあるいは前記合成４リペ
ゾタイドとその天然の対応物との間に不都合な機械的相
違を惹起しない１個又は複数個のアミノ酸の変化（すな
わち欠失、付加、置換）によって異なっていることを意
味する。ヒトーリンフォカイン活性［たとえばＩＦＮ−
α活性、ＩＦＮ−β活性、ＩＦＮ−ｒ活性、コロニイ刺
激因子（Ｃ８Ｆ）活性、腫瘍壊死因子活性、インターリ
ョキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、もしくはＩＬ−３）活性
、リンクオドキシン活性］を持つ分子量１５〜３０　ｋ
ｄの疎水性ポリペブタイドに特に関心が持たれる。便宜
上、この明細書においては、そのようなポリペシタイド
は、それらが化学的に天然のポリベグタイドと同一であ
るかどうかに関係なく、それらの生来の名称（たとえば
ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β）によって記載されている。

この発明の中で使用される組換体細菌は匣技法によって
作ることができる。この方法は、典型的には次のような
事を含んでいる；（１）異種ポリペツタイドをコードす
る合成構造遺伝子又はゲノム起原の構造遺伝子を適当な
グラスミド又はウィルス性発現ベクター中に、その発現
を可能にする部位（スなわちプロモーター−オペレータ
ー、転写されたｍＲＮＡの翻訳の為のり？シーム結合部
位及びその構造遺伝子と同じ翻訳リーディングフレーム
の翻訳開始コドンによって制御される部位）においてク
ローン化しく２）ベクターをコンピテント細菌に導入し
並びに（３）プラスミドマーカー機能または異種ポリペ
ブタイドを生成する為のそれらの能力によって組換細胞
（形質転換体とも称する）を選択する。Ｅ、コライ又は
Ｅ、コライと類似する代謝を有するグラム陰性細菌が好
ましい。異種ポリペブタイドは一般的にＥ、コライ形質
転換体の細胞質ゾルの中に不解溶集積物として存在する
（すなわち、それは非分泌ポリペシタイドである）。

異種ポリベグタイドを生成する形質転換体は液体栄養培
地の中で培養される。その培地は細菌の細胞増殖要件を
満足させる常用の栄養物質を過剰に含んでおシ、これに
よって細菌が増殖しそしてあらかじめ定められた細胞濃
度に増加することが可能となる。そのような物質は、細
胞構成分の合成及びエネルギーの為の炭素源及び窒素源
、並びに硫黄（ｓｏ４”　）、リン酸（ＰＯ４’−）　
＋　Ｍｇ”　’に＋、　Ｃｕ”　、　Ｚｎ”　、　Ｍｎ
２＋、　Ｆｅ２＋　のような鉱物イオンを包含する。一
つまたそれよシ多くのアミノ酸を最初に培地へ加えるこ
とができるが、収量を増加させるのに使用されるタン・
ぐり質加水分解物は最初には存在させない。また酸素も
培地へ供給されるであろう。最大の細胞濃度を得る為に
、培養は一般的に酸素−液体接触の面積を増すような態
様で行なわれるだろう。

この発明方法によって達成される収量増加は、培養にお
いて低接種濃度が使用される場合に特に顕著である。こ
れに関し、接種濃度は典型的には０、１−１０　ｍ９／
１３の範囲であり、よシ一般的には０．１〜１■ηであ
ろう。発酵培地の最終体積に対する接種体積で表わすと
、接種濃度は０．１から１０　ｖ／ｖ　％であシ、なお
一般的には０．１〜１　ｖ／ｖ係であろう−０ 培養に影響を及はす重要な環境要因は−と温度である。

温度は最小増殖温度及び最大増殖温度の間に調整される
だろう。はとんどの細菌は、相当の狭い温度範囲にわた
って最大増殖を示す。Ｅ。

コライのような中温性（ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ　）細菌
にとって、最適温度範囲は約り５℃〜約４２℃であシ、
約３７℃が好ましい。はとんどの生物は数−ユニットに
わたる水素イオン濃度に耐えられるだろう。

Ｅ、コライのような病原性菌にとって耐えられる−は６
〜８の範囲で、だいたい６．８ぐらいが好まし〜１゜ 異種ポリペブタイドをコードしている遺伝子の発現が抑
制的発現制御配列（ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　）の
もとにあシ、そして予定された増殖レベルが達成される
まで、この遺伝子の発現を抑制する事を望むなら、栄養
培地はさらに適切なリグレッサーを含むだろう。たとえ
ばもし発現がトリプトファン（ｔｒｐ）７’ロモーター
ーオペレーターの支配下にあるならば、培地へ）　ＩＪ
ノドファンを加える事によって発現な制御することがで
きる。最初に過剰のトリシトファンを加え、そして所望
の細胞増殖レベルが達成されたときに培地からそれを除
去することができる。これに代わる方法として、栄養培
地の体積及び所望の増殖レベルにおける細胞物質の体積
中に理論上存在するであろうトリシトファンのおよその
量に関連する、あらかじめ定められた量において、トリ
プトファンを加える。好ましい炭素源、例えばグルコー
スの過剰の存在下においては細菌は細胞タン・９り質の
生成において使用するためにトリットファンを自ら生成
するのではなく、むしろ培地中のトリットファンを使用
するであろう。

添加されたトリットファンが存在する間、細菌はｔｒｐ
ｆロモーターーオペレーターの制御のもとて異種ポリペ
ブタイドの発現を抑制する。培地へ適量のトリプトファ
ンを最初に加える事によって、細菌はｔｒｐオペレータ
ーが抑制された状態であらかじめ定められた細胞濃度に
増殖する。この量を決定する為に、培地の体積が知られ
または決定されなげればならず、細菌タン／４り質の単
位乾燥重量に対するトリシトファン量が実験的にまたは
出版物（Ｅ、コライについては、エクリシア、コライに
おける生合成の研究、　Ｒｏｂｅｒｔｓ、ａｔ　ａｌ。

Ｃａｒｎｅｇｉｅ　Ｉｎ５ｔｌｔｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗ
ａｓｈｉｎｇｔｏｎＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　６０７　
（１９５５）　、　Ｐ２８’を参照のこと）によって決
定され、そして所望の細胞濃度が選ばれる。

アルカノール及び／又はアミノ酸混合物が培養の終期部
分において栄養培地へ加えられる。これらの物質が加え
られる培養中の正確な時点は臨界ではない。細菌増殖の
程度で表現すれば、アルカノール及び／又はアミノ酸混
合物は一般的に細胞濃度（分光光度計によ’）　６８０
　ｎｍにおいて測定される光学濃度（ＯＤ　）単位）が
少なくとも２０Ｄユニツトであシ、好ましくは少なくと
も１００Ｄ単位である時に添加されるであろう。ポリペ
ブタイドをコードしている遺伝子の発現が抑制されてい
る場合には、培養の発現期間（リグレッサーの消耗によ
る排除を通してのオペレーターの抑制解除に続く期間）
の間にアルカノール及び／又はアミノ酸混合物を加える
事が好ましい。アルカノール／アミノ酸混合物が加えら
れた後の増殖期間の継続時間は特定の細菌、異種ポＩＪ
−（’シタイド、及び培養条件によって変化するかもし
れない。その継続期間は普通１〜５時間の範囲であるだ
ろう。収得期での細胞濃度は一般的には１０〜４００Ｄ
単位の範囲であシ、さらに一般的には２０〜４００Ｄユ
ニツトの範囲の中にあるだろう。

この発明の方法において使用されるアルカノールは水性
栄養培地に可溶性であシ、そしてそれらが培地に添加さ
れる濃度において細菌にとって有毒でない。これらのア
ルカノールは１〜４個の炭素原子を含有し、そして分枝
鎖であってもよく直鎖であってもよい。好ましいアルカ
ノールは直鎖（メタノール、エタノール、ｎ−グロノノ
ール、ｎ−シタノール）である０エタノールが特に好ま
しい。加えられるアルコールの量は典型的には０．５チ
から５％（ｖ／ｖ　）であシ、好ましくは１〜３チであ
ろう。細菌増殖培地に補充するのに使用されるアミノ酸
混合物は商業的に入手可能である。

これらの混合物は典型的にはタンパク質加水分解物であ
って、このものは天然のタン・ぐり性物質、たとえばカ
ゼイン、大豆粉、乳アルブミン、動物組織、ゼラチンな
どを酸または酵素で消化する事によって生成される。上
記の方法に代ってアミノ酸の混合物は純粋なアミノ酸原
料から生成することができる。遺伝子の発現がｔｒｐプ
ロモーター−オペレーターの制御のもとにある場合には
、アミノ酸の混合物はトリプトファンを欠いていなけれ
ばならない。酸で加水分解されたカゼインはトリプトフ
ァンを欠いておシ、したがって上記のような系の為に好
ましい。栄養培地へ加えられるアミノ酸混合物の量は普
通０．５〜５チ（ｗ／ｖ）であシ、１〜３％の範囲が好
ましいだろう。アルカノールとアミノ酸は栄養培地へ別
々にまたは一緒に加えられる。

収得の後、細胞は異種ポリベグタイドを再生する為に処
理される。この処理線一般的に細胞の破壊、一つまたは
それ以上の抽出処理による細菌タン・９り質からの粗異
種４リペプタイドの分離、ポリペシタイドの可溶化（そ
の疎水溶性に依存して）及びグル濾過、高速液体クロマ
トグラフィ、又は他のタンパク質精製法によるポリペブ
タイドの一層の精製を含む。組換細菌によりて作られる
ＩＦＮ−β及びＩＬ−２のようなヒトーリンフォカイン
は好ましくは、還元状態において細胞物質から回収され
、そして次にその本来の配置に酸化される。

次の例はこの発明の実施において用いられる材料及び技
法をさらに詳しく説明している。

性上二μ夏プ、ｕＬ圭莢に斜土ゑ五１土１土１−ルの効
果 ＩＦＮ−β　は、アミノ酸位置１７のシスティｅｒ１７ ン残基がセリン残基に置き換えられている微生物的に作
られるＩＦＮ−βのミュウティン（ｍｕｔｓｉｎ　）で
ある。ＩＦＮ−β　は、２つの維持されているａｒ１７ システィン残基な有し、一方は３１位にあシそして他方
は１４１位にある。天然のＩＦＮ−βにおｔ・ては３１
位のシスティンと１４１位のシスティンは相互に作用し
てジサルファイド橋を形成する。典型的なＩＦＮ−β　
シュウティンは１９８３年ｅｒｉ７ １１月１８日付でＡＴＣＣＡ　３９５１７　としてＡｍ
ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎに寄託されている。

ＩＦＮ−β　を作るＥ、コライを下記の培地で増５ｅｒ
１７　□ 殖せしめた。

構成要素　初期濃度 Ｎａｓサイドレー）−２Ｈ２０３ｍＭ ＫＨ２Ｐ０４３０　ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４７４ＩＴＩＭ ＭｇＦ３０＜　、７Ｈ２０３ｍＭ ＭｎＳＯ４，Ｈ２Ｏ４６ｐＭ ＺｎＳＯ４，７Ｈ２０４６μＭ ＣｕＳＯ４＋　５Ｈ２０１−２μＭ Ｌ−トリプトファン　５０へ４ Ｆｅ８０４．７Ｈ２０７４μＭ サイアミン、ＨＣＡ　Ｏ，００２チ グルコース　０，３　チ 指数増殖後期にお〜・てこの培養物からの接種物（４チ
）を同様の培地からトリプトファンが除かれてお）、そ
して色々な量のエチルアルコールを含んでいる新しいフ
ラスコへ移した。増殖の終点（濁度の読みによって判断
する）においてサンプルを採取し標準細胞変性効果（Ｃ
ＰＥ　）分析を用いてＩＦＮ−β活性の測定を行った。

図１はこれらのテストの結果を示している。図によると
３チエチルアルコールの添加がＩＦＮ−β活性を約１．
５　Ｌｏｇユニット増している。

工Ｌ−２１１４１ｒ　１２５は、アミノ酸位置０１２５
のシスティン残基がセリン残基で置き換えられている微
生物的に作られるヒ）　−ＩＬ−２のミュウティンであ
る。典型的なＩＬ−２ｓｏｒ、２５　ミュウティンは、
１９８３年１１月１８日付でＡＴＣＣＡ　３９５１６と
してＡｍｅｒｌｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託されて〜）る。

５０■／ＩＩＬ−トリプトファン及び５〜／ノテトラサ
イクリンを含むゾレインハート　インフユージ冒ンシー
ド（Ｂｒａｉｎ　Ｈｅａｒｔ　１ｎｆｕｓｉｏｎ　５ｅ
ｅｄ）培地で１〜２のＯＤユニットに増殖したＩＬ−２
生産性Ｅ、コライ及び工Ｌ−２ｓｅｒ　１２５生産性Ｅ
、コライ菌株の凍結チューブを解凍し、そしてこれを用
〜１て１％〔φ）レベルで種母培地のフラスコへ接種し
た。種母培地の組成は次のようにした。

種母培地 ＮＨＣＬ　１０　ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４２１，９ｍＭ Ｎａ　２ＨＰ０４２８．１　ｍＭ Ｋ２ＳＯ４９ｒｎＭ ＭｇＳＯ４０，２ｒｒＭ ＴＫ−９”　０．１　ｒｄ／１１ 無菌の付加物 ５０チグルコース　４ａｌ／ｌ＝　２９／Ｉ１１　％　
サ４７　ミニ／ＨＣ１１ｄ／ｌ　＝１０ｍｇ／Ｊ０．５
−Ｉ、−）リゾトファン　１ｔｕｄ／１ｏｏｍｌ＝５ｏ
ｍｙ／１４　ｒｎＭｉ　Ｆｅ　８０　＋　０．２５ｍ１
／１００ｒｎｌ＝１０μｍｅＩｂテトラサイクリｙ　５
０μＡ！／１００＃Ｌ７！＝　５１１９／Ａ！”　ＴＫ
−９：　３０　ｒｎＭ’　Ｚｎ８０４３０　ｒｎｂ／ｉ
　Ｍｎ８０４ １　ｎＩＢＩＩＣｕＳＯ４ 種母培養物は、３７℃で０Ｄ６８ｏが０．５〜１．５に
達するまで（約６時間）振られた。これらの種母培養物
を１０リツターの発酵容器中の次のような培養培地に接
種した。

培養培地 （Ｎｌ（４）２８０４１５０　ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４２１，６ｍＭ Ｎａｇ　Ｃ１ｔｒａｔｅ　１．５　ｍＭＴＫ−９２ｔｎ
ｌ／ｌ ＮａＯＨＩ／Ｃよシーを６．５に調整し容量を８．５ノ
にしそして殺菌する。

無菌の付加物 加えられた体積　濃　度 ５０チグルコース　１００ａ４　５シ１１チサイアミ７
ＨＣ１２０１１ｊ　２０ＷＩＯ１５チＬ−）リプトファ
ン　１４０ｍＪ　７０■／１Ｏ１２Ｍ　Ｆｅ８０４５１
７　１００　ｆｉＭｏ、５　Ｍ　Ｍｇ８０４６０ｍ　３
　ｍＭ１チテトラサイクリン＊５ｍ１５■／ＩＩ（無菌
の付加物はそれぞれ別々に加える。）声コントロール＝
５規定水酸化カリウム（５０チグルコーヌとともＫ） １テトラサイクリンは１００％エタノールの中で新たに
調製したもの。

接種の直前に−を６．８に調整し、そして実験の間５規
定の水酸化カリウムを使用して−を一定に保った。５０
％グルコース溶液は、残留グルコースを約５〜１０ｖｌ
に維持する為にアルカリと同時に加えた。培養菌の酸素
要求は次のようにして充足させた：溶存酸素を約４０％
の空気飽和に維持する為に空気の吹込みを伴わない３５
０　ｒｐｍの初期状態から、回転数をまず１２０　Ｑ　
ｒｐｍまでの範囲にしそして次に空気流量を５リツタ一
／分増加し、次に酸素を吹き込んだ。

加えられたトリットファンの量は、８〜１０の０Ｄ６Ｂ
ＤユニツトまでＩＬ−２の生産を抑制するのに十分な量
とした。培養菌の増殖速度は０．６〜０．７／１１でら
りた。この後高い遺伝子発現が始まシ、そして細胞は低
下した速度（０，４〜０．５／ｈ　）で増殖し続けた。

０Ｄ６８ｏが４０〜５ｏに達した時、２０１／１１　（
２６７ｎｌ／発酵容器）のエタノールを加えた。細胞は
、エタノール添加の後３時間（一般的に培養の１９〜２
０時間後）で収得した。

培養培地へエタノールを加えない対照発酵と比較して、
エタノールの添加はＩＬ−２または■Ｌ−２８ｅｒ　１
２５の生成を約２倍に増加させた。発酵から収得したサ
ンゾルの分析によ、６ｉｏｚ発酵ｉ当シの平均収量はＩ
Ｌ−２が８．３ｇであ）そしてＩＬ−２ｓｅｒ１２５　
が５．６Ｉであるコトが示すレタ。

工Ｌ−２ｓｅｒ　１２５を生成するＥ、フライ（例２）
の凍結チューブを解凍しそして下記の発酵培地を収容し
た４本の発酵槽（Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ）に２ｒｖ細胞乾燥重
量／ｌのレベルになるように直接接種した。

以下余白 （ＮＨ４）４ＳＯ４１５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４２１−６ｍＭ Ｎａ３　Ｃ１ｔｒａｔｅ　１５．ＯｍＭＴＫ９　２１１
１１／１１ 声はオートクレーブ殺菌した２、５Ｎの水酸化ナトリウ
ムにより６．５に調整した。

０ Ｍｇ　ＳＯ４−７Ｈ２０３ｒｎＭ Ｆｅ　８０４１００μＭ Ｌ−）リットファン　１４〜／ノ サイアミンＨＣ１２０Ｗｖ１ グルコース　５１７ノ テトラサイクリン　５１１１ｆ／／１３発酵槽の運転−
は、５Ｎの水酸化カリウムで６．８に維持した。５０％
グルコースの供給は塩基の添加の要求によって開始した
。発酵槽中の残留グルコースは５〜１０ＶＩの間に維持
した。発酵槽中の溶存酸素は最大１２００ｒｐｍで攪拌
し、そして最大２１／分の空気吹込みによって４０チに
維持した。次に４メン分まで酸素の吹込を行った。

ＣＡＡ　（オー　）　／レーツ殺菌されたアミノ酸、の
２０％貯蔵溶液）は濁度が約１０００に等しくなった時
発酵槽へ加えた。１０Ｄから１００Ｄの間の増殖速度は
典型的には約ｕ　＝０．６０−０．７０／ｈ　テある。

１４１Ｒｖ′Ａ！）リットファンを伴って十分な誘導が
１〜２のＯＤの付近で生じる。ＣＡＡが発酵槽へ加えら
れる時までに、ＩＬ−２，。４，２５の発現は十分にタ
ーンオンされた。

１チのＣＡＡをＡへ加えた。残ｆｉＢ、Ｃ，Ｄへは２チ
のＣＡＡを加えた。ＡへもＢへもエタノールを加えなか
った。Ｃへ２ｑＩＩのエタノールを加え、モしてＤへは
３チのエタノールを加えた。

発酵の種々の段階で光学濃度、活性、及びＩＬ−２タン
・臂り質の測定を行った。培養タン・９り質は光学的濃
度から算定し、そしてＩＬ−２メン・臂り質は粗抽出物
のダルスキャンから算定した。

Ｉ　Ｌ−２の比活性はダルスキャンと活性データを組合
せることによって計算した。比較のため、ＣＡＡを添加
しなかった発酵から採取したサンプルをｒル上で同時に
移動させた。

これらの測定を表１に示す。

以下余白 一寸 一、ｄ 　− 一へ 一　ヨ　。

〜 Ｌ３′！　票　１　円　１　円　−９曽　９　づ［Ｆ］
ト　ロ　へト唖００ω　哨 Ｌ：！　枳　Ｉ　Ｆ’ｊ　＋・ｉ　票　１　冑　−末φ
ω　凶　の口Ｑロロ　の ｍ− 攬　υ寸−へｏト 〜　−ｅＱ　ｙ−ｉ　７　７　、＋ｉ 〜へ　−一へへへへ ロ　・＾ 表のデータによって示されるように、ＣＡＡの添加が総
タンパク質量を３．６チから７．６チへ（２％ＣＡＡ　
）　、そして６％へ（１％ＣＡＡ　）増大させた。

定性的には、２チのＣＡＡは１ｑｂのＣＡＡよシも有意
に多くのＩＬ−２をもたらす。またエタノールの添加（
Ｃ，Ｄ）は、エタノール無しの発酵（Ａ、Ｂ）を越えて
ＩＬ−２の生産性を改良する。

図２は４種類の発酵の増殖動力学を示している。

例４　：　ＩＦＮ−α生成に対するエタノールの効果Ｉ
ＦＮ−α６Ｌは、組換体Ｅ、コライによって作られｂヒ
ト−αインターフェロンである。このものはヨーロッ・
臂特許出願公開Ａ　ＥＰＯ２０７０の対象である。

ＩＦＮ−α６Ｌを生成する組換体Ｅ、フライをエチルア
ルコール無しでの培養と同様の方法を用いて、培養培地
ＩＩｌ当９３０ｇのレベルでエタノールを補充した培養
培地中で増殖せしめた。エタノールの添加はＩＦＮ−α
６Ｌの収量をＬ〜ｌ　Ｌｏｇ増加させま た。

ＩＦＮ−βｇｅｒ１７を生産するＥ、コライのサングル
及ヒエＬ−２１１８ｒ　１２５を生成するＥ、フライの
サンプルはＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）。

１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｋｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２　ＵＳＡに寄託されてい
る。これらのサングルの為の寄託臼及び受託番号を下に
示す。

生産されるタン・やり質　寄託臼　受託番号ＩＦＮ−β
ｓ、、　１．　１１／１８／８３　３９５１７■Ｌ−２
ｍｅｒ　１２５　１１／１８／８３　３９５１６エＬ−
２’５ｅｒ１２５”　９／２６／８３　３９４５２ＩＬ
−２ｇｅｒ　１２５”　３／６／８４　３９６２６４　
このタン・母り質は天然のタン・母り質の最初のアラニ
ンを欠いている。

例１から３に記載されている組換体細菌における。ＩＦ
Ｎ−β　、　ＩＬ−２及びＩＬ−２１１ｅｒ　１２５を
コ８１１ｒ　１７ −ドする遺伝子の発現はｔｒｐ　７’ロモーターーオペ
レーターの制御のもとにある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、例１に記載した実験の結果を示す。 エタノール（チ）対ＩＦＮ−β活性のグラフである。 第２図は、例３に記載した発酵についての時間経過に対
する０Ｄ６８ｏのグラフである。 特許出願人 シタス　コーポレイション 特許出願代理人 弁理士　宮　木　朗 弁理士　西舘和之 弁理士　福　本　積 弁理士　山　口　昭　之 弁理士　西山雅也 ％ＥｔＯＮ 第１頁の続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体培地中で組換体細菌を培養する事によって生成
   される異種タン・ダク質の収量を改良する方法であって
   、炭素原子数１〜４個の水溶性アルカノールの有効量、
   及び／又は細菌の増殖を支持するアミノ酸の混合物の有
   効量を培養の終期部分において培地に補充することを特
   徴とする方法。 ２、前記タン・臂り質がヒトーリンフォカイン活性を有
   する疎水性非分泌タンパク質であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、・前記タンパク質がＩＦＮ−α、　ＩＦＮ−／又は
   ＩＬ−２である事を特徴とする特許請求の範囲第１項又
   は第２項に記載の方法。 ４、前記細菌がグラム陰性細菌である事を特徴とする特
   許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の方
   法。 ５、前記アルカノールがエタノールである事を特徴とす
   る特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方
   法。 ６、前記アミノ酸の混合物がタン・千り負加水分解物で
   ある事を特徴とする特許請求の範囲第１項〜等５項のい
   ずれか１項に記載の方法。 ７、接種濃度が０．１〜１０　ｖ／ｖチである事を特徴
   とする特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に
   記載の方法。 ８、前記アルカノール及び／又はアミノ酸混合物を、培
   養物の光学的濃度が少なくとも２である時に培地へ加え
   る事を特徴とする特許請求の範囲第１項〜第７項のいず
   れか１項に記載の方法。 ９、前記異種タン・臂り質がＩＦＮ−β５ｅｒ１７であ
   シ、前記組換体細菌がＥ、コライであシ、ＩＦＮ−βｌ
   ｌ、ｒ、。 をコードする遺伝子の発現がｔｒｐオペレーター−プロ
   モーターの制御のもとにあシ、接種濃度が０．１〜ｌ　
   ｖ／ｖ％であり、前記アルカノールがエタノールであり
   、エタノールの量が１〜３　ｖ／ｖ　％であシ、前記ア
   ミノ酸の混合物がカゼインの酸加水分解物でアシ、アミ
   ノ酸の量は１〜３　ｖ／ｖ％であル、そしてエタノール
   及び／又はカゼインの酸加水分解物を培養菌の光学濃度
   が少なくとも１０である時加えることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 １０、前記異種タン・り質がＩＬ−２，。７，２５であ
   シ、前記組換体細菌がＥ、コライでｈ　Ｄ　ＩＬ−２，
   、１２５をコードする遺伝子の発現がｔｒｐオペレータ
   ー−プロモーター制御のもとにあシ、接″種濃度が０．
   １〜１　ｖ／ｖ　’％でちゃ、前記アルカノールがエタ
   ノールであシ、エタノールの量が１〜３　ｖ／ｖ−チで
   あシ、前記アミノ酸の混合物がカゼインの酸加水分解物
   であり、そしてアミノ酸の量が１〜３　ｖ／ｖ　ｆｂで
   あシそして、エタノール及び／又はカゼインの酸加水分
   解物を培養菌の光学的濃度が少なくとも１０である時加
   えることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法
   。