JPS60222500A - 新規ハイブリツドインタ−フエロン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は興味ある抗ウィルス活性および抗腫瘍活性を示
す新規アルファーインターフェロン型蛋白質に関する。

この蛋白質は新規アルファーインターフェロン型蛋白質
をコードする発現可能な組み換えＤＮＡを含む生物を培
養することによって産生ずることができる。

各種のインターフェロンの抗ウィルスおよび抗腫瘍活性
は広く探究されつつある。最近、自然界には本来存在し
ないハイブリッドインターフェロンが作られた。例えば
、１９８３年１１月８日付米国特許第４４１４１５０号
を参照されたい。

しかしながら、この棟のハイブリッドインターフェロン
は欠失のない天然インターフェロン配列の全部分を含み
、こうして−緒に結合されるセグメントは各部を完全に
備えて（・る。

本発明は、新規アルファーインターフェロン型蛋白質が
短縮または切断されたセグメントもしくは配列（すなわ
ち、天然アルファーインターフェロンのパサブセグメン
ト”が他のアルファーインターフェロンからのセグメン
トまたは配列に結合したもの）を含むという点で進歩を
もたらし、しかもこの新規アルファーインターフェロン
型蛋白質は驚くべきことに増大した活性を示す。

我々は、この新規ハイブリッドが切断されたアルファー
２セグメントおよびアルファー１セグメントに特定的に
一致して形成される場合、得られたインターフェロン物
質が非常に望ましい生物学的プロフィールを示すことを
見出した。

当技術分野でよく知られるように、・コドンＡＴＧは開
始コドンとしての特異な意味を有し、すなわちアミノ酸
鎖からなる蛋白質の第１番目のアミノ酸としてのメチオ
ニンをコードする。この蛋白質を産生（例えば組み換え
ＤＮＡ技術により）する宿主は時々蛋白質からこのアミ
ノ末端メチオニンを切り離し、また時々は切り離さない
でおくだろう。こうして２種の密接に関係のある物質が
産生される。本発明によれば、アミン末端でメチオニン
を欠く物質は１６１個のアミノ酸を有しそグルタミンか
ら出発するだろう。またアミン末端がメチオニンから出
発する物質は１６２個のアミノ酸を有するだろう。

本発明の新規インターフェロン物質はアルファ−１配列
から誘導されたＣＢａ１ＴＩ）アルファー１と定義され
るセグメントに結合された、アルファ−２配列から誘導
されたデルタ−４アルフアー２ＣＢｒｙｌ　ｌｌ−１）
と定義される“′サブセグメント”を特徴とする。これ
は驚くべきことに高められた抗ウィルスおよび抗腫瘍活
性を示す。

本発明の蛋白質は少なくともｌＸｌ０’単位／ｍ９の抗
ウィルス活性を示すことが確認され、これは標準として
ＮＩＨ／ＷＨＯ未クローン化白血球のインターフェロン
標品６９／１９を使用し、本質的にＦ“αｍ１ｌｌｅｔ
ｔｉらの刊行物（文献１）に記載のごと〈実施されたＥ
ＭＣウィルスおよびヒト包皮細胞（１，Ｓ−７１）を用
いての細胞変性作用−阻害検定法によってホ１１定され
た。更に、本発明の新規なインターフェロンは治療薬用
量において、おおむね非毒性である。

新規アルファーインターフェロン型蛋白質をコードする
遺伝子は、成熟ヒトアルファー１インターフエロン遺伝
子中のただ１つのＢｇｔ　ｕ部位以下の完全なカルボキ
シ末端ヌクレオチドコード配列に結合された、成熟ヒト
アルファ−２インターフエロン遺伝子中の第１のＢｇｌ
　１１部位まで（それ故に”Ｂｇｌｌｌ−１”という専
門用語が用いられる）のアミノ末端ヌクレオチドコード
配列の一部分から構成される。本発明インターフェロン
をコードする遺伝子を作製するのに用いられるヒトアル
ファー２インターフエロン遺伝子のその部分は、成熟ヒ
トアルファー２インターフエロンをコードする配列中に
通常見出される最初の１２個のヌクレオチドを欠失して
おり、それ故に最初の４個のアミノ末端アミノ酸（ＣＹ
Ｓ−ＡＳＰ−ＬＥＵ−ＰＲｏ）をコードする予定の遺伝
情報を含まず、このことから我々はこのサブセグメント
の特徴を反映させて“デルタ−４”という専門用語を使
用する。

本発明インターフェロンをコードする遺伝子を作製する
のに用いられるヒトアルファー１イ゛ンターフエロン遺
伝子の部分は、成熟ヒトアルファー１インターフェロン
コード配列中に見出される唯一のＢＵｌｎ部位から下流
にある全ヌクレオチドから構成され、それ故に”ＣＢｇ
ｌ■）アルファー１”という専門用語が用いられる。

こうして、我々は本発明インターフェロンをコードする
遺伝子を作製するのに用いられた成熟ヒトアルファー２
インターフエロン遺伝子からのヌクレオチドコード配列
を説明するのに“デルタ−４アルフアー２　ＣＢｑｌ　
ｌｌ−１）”という専門用語を使用し、また本発明イン
ターフェロンをコードする遺伝子を作製するのに用いら
れた成熟ヒトアルファー１インターフエロン遺伝子から
のヌクレオチドコード配列を説明するのに’（Ｂｇｊｎ
）アルファー１”という専門用語を使用する。さらに、
我々はこの専門用語を用いてその蛋白質サブセグメント
および蛋白質セグメントをも定義する。

成熟ヒトアルファー１インターフエロンは以下に示すア
ミノ酸配列を有すると定義される。

ＣＹＳ　ＡＳＰ　ＬＥＵ　ＰＲＯＧＬＵ　ｉ’Ｈ１ｌ　
Ｈｌｓ　５ＥＮＬＥＵ　ＡＳＰ　ＡＳＮ　ＡＲＧ　ＡＲ
Ｇ　ＴＨＲＬＥＵＭＥＴＬＥＵ　ＬＥＵ　ＡＬＡ　ＧＬ
Ｎ　ＭＥＴ　ＳＥＲＡＲＧ　ＩＬＥＳＥＲＰＭＯＳｌ！
；ＲＳＥＲＣＹＳ　ＬＥＵ　ＭＥＴＡＳＰＡＲＧ　ＨＩ
Ｓ　ＡＳＰ　ＰＨＥ　ＧＬＹ　ＰＨＥ　ＰＲＯＧＬＮＧ
ＬＵ　ＧＬＵ　ＰＨＥ　ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＡＳＮ　ＧＬ
Ｎ　ＰＨＥＧＬＮ　ＬＹＳ　ＡＬＡ　ＰＲＯＡＬＡ　Ｉ
ＬＥ　ＳＥＲＶＡＬＬＥＵ　Ｈｌｓ　ＧＬＵ　ＬＥＵ　
ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＧＬＵ　ＩＬＥＰＨＥ　ＡＳＮ　ＬＥ
Ｕ　ＰＨＥ　ＴＨＲＴＢＲＬＹＳ　ＡＳＰＳＥＲＳＥＲ
ＡＬＡ　ＡＬＡ　ＴＲＰ　ＡＳＰ　ＧＬＵ　ＡＳＰＬＥ
Ｕ　ＬＥＵ　ＡＳＰ　ＬＹＳ　ＦＥＥ　ＣＹＳ　ＴＨＲ
ＧＬＵＬＥＵ　ＴＹＲＧＬＮ　ＧＬＮ　ＬＥＵ　ＡＳＮ
　ＡＳＰ　ＬＥＵＧＬＵ　ＡＬＡ　ＣＹＳ　ＶＡＬ　Ｍ
Ｅ’ｌ’　ＧＬＮ　ＧＬＵ　ＧＬＵＡＲＧ　ＶＡＬ　Ｇ
ＬＹ　ＧＬＵ　ＴＨＲＰＲＯＬＥＵＭｈ；ＴＡＳＮ　Ａ
ＬＡ　ＡＳＰ　ＳＥＲＩＬＥ　ＬＥＵ　ＡＬＡ　ＶＡＬ
ＬＹＳ　ＬＹＳ　１’ＹＲＰＨＥ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　Ｉ
ＬＥ　１’ＨＲＬＥＵ　ＴＹＲＬＥＵ　Ｔｌ１ｌシ　Ｇ
ＬＵ　ＬＹＳ　ＬＹＳ　ＴＹＲ８ＥＲＰＨＯＣＹＳ　Ａ
ＬＡ　ＴＲＰ　ＧＬＵ　ＶＡＬ　ＶＡＬＡＲＧ　ＡＬＡ
　ＧＬＵ　ＩＬＥ　ＭＥＴ　ＡＲＧ　ＳＥＲＬＥＵＳＥ
ノｔＬＥＵＳｌシ゛Ｒ１’ＨＲＡＳＮＬＥＵＧＬＮＧＬ
ＵＡＲＧ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＡＥＧ　ＬＹＳ　ＧＬＵ成
熟ヒトアルファー２インターフェロンは以下に示すアミ
ノ酸配列を有す″る定義される。

ＣＹＳ　ＡＳＰ　Ｌル゛Ｕ　ＰＩビＯＧＬＮ　ＴＨＲＨ
ｌｓ　５ＥＲＬＥＵ　ＧＬＹ　Ｓｌ！；Ｅ　ＡＲＧ　Ａ
ＲＧ　’ｌ’ＨＲＬＥＵＭＥＴＬＥＵ　ＬＥＵ　ＡＬＡ
　ＧＬＮ　ＭＥＴ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　ＩＬＥＳＥＲＬＥ
Ｕ　ＰＨＥ　ＳＥＲＣＹＳ　ＬＥＵ　ＬＹＳ　ＡＳＰＡ
ＲＧ　Ｈｌｓ　ＡＳＰ　ＰＨＥ　ＧＬＹ　ＰＲＥ　ＰＲ
ＯＧＬＮＧＬＵ　ＧＬＵ　ＰＨＥ　ＧＬＹ　ＡＳＮ　Ｇ
ＬＮ　ＰＨＥ　ＧＬＮＬＹＳ′　ＡＬＡ　ＧＬＵ　ＴＨ
ＲＩＬＥ　Ｐノ＜（Ｊ　ＶＡＬ　ＬＥＵＨｌｓ　ＧＬＵ
　ＭＥ’ｌ’　ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＧＬＮ　ＩＬｇ　ＰＲ
ＥＡＳＮ　ＬＥＵ　ＰＨＥ　ＳＥＲＩ’ＨＲＬＹＳ　Ａ
ＳＰ　５ＥＲ８ＥＥ　ＡＬＡ　ＡＬＡ　ｉ’ＲＰ　ＡＳ
Ｐ　ＧＬＵ　ｉ’１ｉ）１！　ＬＥＵＬＥＵ　ＡＳＰ　
ＬＹＳ　ＰＨＥ　ｉ″ＹＲＴＨｆｔ　ＧＬＵ　ＬＥＵＴ
ＹＲＧＬＮ　ＧＬＮ　ＬＥＵ　ＡＳＮ　ＡＳＰ　ＬＥＵ
　ＧＬＵＡＬＡ　ＣＹＳ　ＶＡＬ　ＩＬＥ　ＧＬＮ　Ｇ
ＬＹ　ＶＡＬ　ＧＬＹＶＡＬ　ＴＨＲＧＬＵ　ＴＨＲＰ
ＲＯＬｌｉ、”Ｕ　ＭＥ’ｌ’　ＬＹＳＧＬＵ　ＡＳＰ
　５ＥＩＩ　ＩＬＥ　ＬＥＵ　ＡＬＡ　ＶＡＬ　ＡＲＧ
ＬＹＳ　ＴＹＲＰＲＥ　ＧＬＮ　ＡＲＧ’ｌＬＥ　ＴＨ
ＲＬＥＵＴＹＲＬＥＵ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＬＹＳ　ＬＹ
Ｓ　ｉ’ＹＲ５ＥｌｉＰＲＯＣＹＳ　ＡＬＡ　ＴＲＰ　
ＧＬＵ　ＶＡＬ　ＶＡＬ　ＡＲＧＡＬＡ　ＧＬＵ　ＩＬ
ＥＭＥＴ　ＡＲＧ　ＳＥＩイ　ＰｌｉＥ　Ｓｌ！；ＲＬ
ＥＵ　ＳＥＲＴｌ１ＲＡＳＮ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　ＧＬＵ
　ＳＥＩビＬＥＵ　ＡＲＧ　ＳＥＲＬＹＳ　ＧＬＵ本発
明はアルファ−１配列から誘導されたＣＢｇｌ　Ｉｆ）
アルファー１と称するセグメントに結合された、アルフ
ァ−２配列から誘導されたデルタ−４アルフアー２（Ｂ
ｇｌ［−１）と称する短縮セグメントすなわち”サブセ
グメント′を用いる新しい種類のインターフェロンまた
は蛋白質に関する。

“セグメント”という用語は、成熟分子の一端に見出さ
れる自然界に存在する配列によって一端が結合されてい
るインターフェロンアミノ酸鎖の一部分と定義づけられ
るだろう。

また、”短縮セグメント″′および″サブセグメント”
という用語は、成熟分子の両端に見出される自然界に存
在する配列のどちらによっても両端が結合されていない
インターフェロンアミノ酸鎖の一部分と定義づけられ、
それ放光に定義したインターフェロンの６セグメント”
の一端に通常見出されるアミノ酸が十分に補充されない
インターフェロンアミノ酸鎖の短縮された部分である。

さらに、本発明は以下に示す１６１個または１６２個の
アミノ酸を有する蛋白質を包含する。

（ＭＥ７１）工ＧＬＮ　’１’ＨＲＨＩＳ　ＳＥＲＬＥ
Ｕ　ＧＸＹＳＥＲＡＥＧ　ＡＲＧ　ＴＨＲＬＥＵ　ＭＥ
Ｔ　ＬＥＵ　ＬＥＵＡＬＡ　ＧＬＮ　ＭＥＴ　ＡＲＧ　
ＡＲＧ　ＩＬＥ　５ＥＲＬＥＵＰＲＥ　ＳＥＲＣＹＳ　
ＬＥＵ　ＬＹＳ　ＡＳＰ　ＡＲＧ　ＨｌｓＡＳＰ　ＰＨ
Ｅ　ＧＬＹ　ＰＲＥ　ＰＲＯＧＬＮ　ＧＬＵ　ＧＬＵＰ
ＨＥ　ＧＬＹ　ＡＳＮ　ＧＬＮ　ＰＲＥ　ＧＬＮ　ＬＹ
Ｓ　ＡＬＡＧＬＵ　ＴＨＲＩＬＥ　ＰＲＯＶＡＬ　ＬＥ
Ｕ　ＨＩＳ　ＧＬＵＭＥＴ　ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＧＬＮ　
ＩＬＥ　ＰＨＥ　ＡＳＮ　ＬＥＵＰＨＥ　ＴＨＲｉ’Ｈ
ＲＬＹＳ　ＡＳＰ　ＳＥＲ５ＥＲＡＬＡＡＬＡ　ＴＲＰ
　ＡＳＰ　ＧＬＵ　ＡＳＰ　ＬＥＵ　ＬＥＵ　ＡＳＰＬ
ＹＳ　ＰＨＥ　ＣＹＳ　ＴＨＲＧＬＵ　ＬＥＵ　ＴＹＲ
ＧＬＮＧＬＮ　ＬＥＵ　ＡＳ＃　ＡＳＰ　ＬＥＵ　ＧＬ
Ｕ　ＡＬＡ　ＣＹＳＶＡＬ　ＭＥＴ　ＧＬＮ　ＧＬＵ　
ＧＬＵ　ＡＲＧ　ＶＡＬ　ＧＬＹＧＬＵ　ＴＨＲＰＲＯ
ＬＥＵ　ＭＥＴ　ＡＳＮ　ＡＬＡ　ＡＳＰＳｌ！；ＲＩ
ＬＥ　ＬＥＵ　ＡＬＡ　ＶＡＬ　ＬＹＳ　ＬＹＳ　’１
’ＹＲＰＨＥ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　ＩＬＩ！、“　’Ｉ”
ＨＲＬＥＵ　ＴＹＲＬＥＵＴＨＲＧＬＵ　ＬＹＳ　ＬＹ
Ｓ　Ｔ”＃　ＳＥＩビ　ｐＲｏ　ｃｙｓＡＬＡ　ＴＲＰ
　ＧＬＵ　ＶＡＬ　ＶＡＬ　ＡＲＧ　ＡＬＡ　ＧＬＵＩ
ＬＥ　ＭＥＴ　ＡＲＧ　５ＥＩｉ　ＬＥＵ　ＳＥＲＬＥ
Ｕ　５ＥＲＴｆｉＲＡＳＮ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　ＧＬＵ　
ＡＲＧ　ＬＥＵ　ＡＲＧＡＲＧ　ＬＹＳ　ＧＬＵ （式中、ＸはＯまたは１である） 本発明はまたそれぞれ１６１個および１６２個のアミノ
酸を有するこれらの第１蛋白質および第２蛋白質の混合
物からなり、第１蛋白質はグルタミンから出発しており
、第２蛋白質は第１蛋白質のアミノ酸配列を有するがメ
チオニンが第１蛋白質の全アミノ酸配列の前に配置され
るという点で第１蛋白質と相違している。

上記蛋白質または蛋白質混合物は、標準としてＮＩＨ／
’ＷＨＯ未クローン化白血球のインターフェロン標品６
９／１９を使用して、本質的にｐａｍｉｌｌ−ｅｔｔｉ
らの刊行物（文献１）に記載のごと〈実施されたＥＭ、
Ｃウィルスおよびヒト包皮細胞ＣＦ’Ｓ−７１）を用い
ての細胞変性作用−阻害検定法によって測定して、少な
くとも１×１０７単位／ｍ９の抗ウィルス活性を有する
と確認された。

得られた蛋白質または蛋白質混合物は自然界に存在する
アルファーインターフェロンではない新し見・インター
フェロン物質である。

本発明はさらに上記蛋白質をコードし、好ましくは以下
に示す配列を有するＤＮＡ配列を包含する。

ＣＡＴＧ）ＣＡＡ　ＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＧ　ＧＧＴ
ＡＧＣＡＧＧ　ＡＣＣｉｏＴＧ　Ａ’ｌ’Ｇ　ＣＴＣＣ
ＴＧ　ＧＣＡＣＡＧ　Ａ１’Ｇ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＡＴ
Ｃ’ｌ’ｃｉ’　ＣＴＴＴＴＣＴＣＣ１’ＧＣ’ｌ’ｉ
’Ｇ　ＡＡＧ　ＧＡＣＡＧＡ　ＣＡｉ’　ＧＡＣ１’Ｔ
Ｔ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　ＣＣＣＣＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　
ｉ’ＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＧ　Ｉ°７’（、’　ＣＡＡ
　ＡＡＧ　ＧＣＴ　ＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣＣＴ　Ｇｉ’
ＣＣ１’ＣＣＡＴ　ＧＡＧ　Ａ’ｌ’ＧＡＴＣＣＡＧ　
ＣＡＧ　Ａｉ’Ｃｉ’Ｔｃ　ＡＡＣＣ１’Ｃｉ’ＴＴＡ
ＣＣＡＣＡＡＡＡＧＡＴ７゛ｃＡ７゛ｃＴＧｃ７１Ｇｃ
ＴＴＧＧ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＧＡＣＣ１’ＣＣ１”Ａ　
ＧＡＣＡＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＣＧＡＡ　Ｃ１’ＣＴＡ
ＣＣＡＧ　ＣＡＧＣＴＧ　ＡＡＴ　ＧＡＣｉ’ＴＧ　Ｇ
ＡＡ　ＧＣＣＴＧＴ　ＧＴＧＡＴＧ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　
ＧＡＧ　ＡＧＧ　Ｇｉ’Ｇ　ＧＧＡ　ＧＡＡＡＣ１’　
ＣＣＣＣＴＧ　Ａｉ’Ｇ　ＡＡ１’　ＧＣＧ　Ｃ；ＡＣ
ｉ’ｃｃＡＴＣＴ’ｌ’Ｇ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＡＡＧ　
ＡＡＡ　ＴＡＣｉ’ＴｃＣＧＡ　ＡＧＡ　Ａｉ’ＣＡＣ
７’　ＣＴＣ７’ＡＴ　Ｃ１’Ｇ　ＡＣＡＧＡＧ　ＡＡ
Ｇ　ＡＡＡ　１’ＡＣＡＧＣ（、：Ｃ１”　’１’Ｇ１
’　ＧＣＣＴＧＧ　ＧＡＧ　Ｇｉ’Ｔ　Ｇ’ｌ’ＣＡＧ
Ａ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　ＡＴＣＡＴＧ　ＡＧＡ　ＴＣＣＣ
ＴＣＴＣＴ　Ｔｉ’Ａ　ＴＣＡ　ＡＣＡＡＡＣＴ１’Ｇ
　ＣＡＡ　ＧＡＡ　ＡＧＡ　ＴＴＡ　ＡＧＧ　ＡＧＧＡ
ＡＧ　ＧＡＡ　〔ＴＡＡ〕 （式中、開始コドンＡＴＧは丸括弧の中に記載され、停
止コドンＴＡＡは角括弧の中に記載されるン本発明はさ
らに上記蛋白質をコードするが、遺伝コードの同義性に
従って上記配列とは異なるＤＮＡ配列をも包含する。

本発明はまた発現を制御する配列へ遺伝子操作して結合
された前述のＤＮＡ配列を含むクローニングベクター（
例えばプラスミド）を包含し、さらにこのクローニング
ベクターで形質転換された宿主（例えば細菌、酵母また
は動物細胞）を包含する。

上記の蛋白質または蛋白質混合物を用いての試験は、市
販の標準アルファー２インターフ王ロンと比較して、ウ
ィルスおよび）厘瘍に対して高活性を示した。特に興味
があるものとして、上記蛋白質または蛋白質混合物はア
デノウィルス（例えばアデノウィルス−１）および卵巣
ならびに子宮頚管の癌に対して有望な活性を示した。

本発明の蛋白質または蛋白質混合物は、成熟アルファー
２インターフエロンのサフセグメントをコードする配列
を成熟アルファー１インターフエロンのセグメントをコ
ードする配列と結合させることによって、２つの異なる
インターフェロンコード配列から遺伝子操作された。

これらの蛋白質の１６１（または１６２）アミノ酸鎖は
、理論的に２５位のシスティン残基と１３４位のシステ
ィン残基との間に硫黄−硫黄結合を有すると思われる。

（この番号づけにおいて、Ｘが１である時第１番目のア
ミノ酸として存在するメチオニン残基は０位として数え
た。）そして、本発明蛋白質の生物学的活性はこのジス
ルフィド結合に関係があると考えられ、またこれはアル
ファ＝１およびアルファ−２成熟コード配列からそれぞ
れ誘導されたセグメントおよびサフセグメントによって
もたらされる特異的に結合した配列の特性から生ずるの
かも卸れない。

この新規アルファーインターフェロン型蛋白質の一般的
製造方法は、このアルファーインターフェロン型蛋白質
をコードするノ・イブリッドインターフェロン遺伝子を
準備することであった。これはまず第一に成熟アルファ
−２インターフエロンコード配列の初めの部分へ翻訳開
始信号をもつ一群のプロモーターを結合させることであ
った。その後、プロモーターがアルファ−２アミン末端
コード配列（第１のＢｇｌＵ制限部制限部位へ結合され
たＤＮＡ断片は同定され、単離され、そして成熟アルフ
ァ−１コード配列に見出されるＢＱＩＲ部位のすぐ後に
続くアルファー１インターフエロン遺伝子のカルボキシ
末端コード配列へ結合された。

実際に行われる実験は６つの広い活動範囲に分けること
ができ、そして（１）アルファ−１インターフエロンプ
ラスミド誘導体、特に２個ではな′くただ１個のＥｃｏ
Ｒ１部位を有するプラスミドＨｉ　ｆ−２に（文献２）
の誘導体の作製；（２）ＡＴＧ翻訳開始コドンが末端に
ついておりかつ“５ｈｉｎｅ　−Ｄａ、Ｉｇａｒｎｏ”
配列とこの開始コドンとの間のヌクレオチド数を異にす
る一群（または−属）のプロモーター集成体；　（３）
アルファー２インターフエロン遺伝子のアミン末端コー
ド配列へのこの一群のプロモーターの結合；（４）アル
ファー２インターフエロン遺伝子のアミン末端コード配
列へ結合されたプロモーター領域を含む１）　Ｎ　Ａ　
ｌ”ｊ片の学離、（５）カルボキシ末端アルファ−１イ
ンターフエロンコード配列へのこれらのプロモーター含
有断片の結合；および（６）活性ハイブリッドインター
フェロン産生用の細菌クローンのスクリーニング；とい
う本発明の特徴を構成し、こうして適当な組み換え分子
を含む細菌クローンが単離される。

大腸菌を形質転換するために用いられた方法は本質的に
（文献１３）に記載された通りであった。

制限酵素Ｔ４　ＤＮＡリガーゼおよびニューイングラン
ド生物研究所（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ
ｓ　）おヨヒベテスダ・リサーチ研究所ＣＢｅｔｈｅｓ
ａａＲｅｇｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）か
ら入手できる他のＤＮＡ修飾酵素が一般に製造者の報告
に従って使用された。ゲルからＤＮＡを回収する方法は
り。

Ｇｒ　ｏ　ｓ　ｓｍａｎおよびに、　Ｍｏ１．ｄａｖｅ
編、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＋　Ｖ
ｏｌ、６　５　、　ｐｃＬｒｔ　１　、３７１〜３８０
（１９８０）、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、
Ｙ、　に　゛ゲ／Ｌ／からのＤＮＡの回収”と題してＨ
，Ｏ、Ｓｍｉ　ｔ７＋Ｊこより論評された方法に従った
。以下におし・て詳細暑こ記述されていない方法および
操作（または本質的に同等の代用方法）に関する記録は
多数の利用可能な′°笑験手引書”において見出すこと
ができ、例えば文献１２を参照されたい。上記のこれら
６つの活動範囲の各々は以下により詳細に記載される。

アルファー１インターフエロンコード配夕１１＆！２つ
のＥｃｏＲ１部位をもつ１１ｉｆ−２ｈＣ文献２）と称
するプラスミド内へ組み込まれる。このプラスミドＤＮ
Ａのアリコートはいくつかの部分消化産物を生ずること
が期待される条件のもとて制限エンドヌクレアーゼＥｃ
ｏＲＩで消化された。露出された末端はヌクレアーゼＳ
１で切断され、続いてＢａｍＨＩで完全に消化された。

非コード領域内の前方のＢ；ｃｏＲ１部位までのアルフ
ァー１インターフエロン遺伝子およびテトラサイクリン
耐性遺伝子のアミノ末端コード端を有する目的のＤＮＡ
断片が、既仰サイズの遺伝標識に対するアガロースゲル
上のその移動度によって同定されかつ単離された。これ
と並行して、ｐＢＲ３２２（文献３）ＤＮＡはｐｓｔ■
で消化され、続いてヌクレアーゼＳ１で処理され、最後
にｆｌａｍＨ’ｌて消化された。

この場合に、単離された断片はｐＢＲ３２２のための複
製開始点およびテトラサイクリン耐性遺伝子のためのカ
ルボキシ末端コード配列を有していた。上記２つの断片
はＴ４ＤＮｊ４’）ガーゼで酵素的に結合され、そして
この組み換えＤＮＡは大腸菌株２９４（文献４）を形質
転換するために用いられた。テトラサイタリン耐性組み
換え体からのプラスミドＤＮＡは制限酵素分析を行って
、その構造内にただ１つのＥｃｏＲ１部位がアルファ−
１インターフエロンコード配列の上流にあることを確か
めた。

配列・・・・・ＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴＡＣ
ＴＧＡＴＧＧＴＣＣ・・・（プラスミドＨｉｆ−２ｈ内
のアルファー１インターフエロン遺伝子の°゛リーダー
″コード配列ら得られた）から約３０塩基対上流に特異
なＥｃ　ｏ　Ｒ１制限部位を有するプラスミドが作製さ
れた。このプラスミドは７＞ＢＲ３２２のＨｉｎｄ　ｍ
およびＰｖｖ、　１１部位の間の約４０塩基対ＤＮＡ断
片（すなわちＨｉｆ　−２ｈのヒトアルファー１インタ
ーフエロン遺伝子のリーダー配列をコードする領域内に
見出されたＨａｅ■／ｐυｕｌｌ制限断片）′をＰｖｒ
ｔ　１１部位を再生させる配向でクローン化することに
より作られた。

このプラスミドＤ　Ｎ’　Ａのアリコートは最初に特異
なＥｃｏＲ１制限部位での酵素消化により直線状にされ
た。その後、この地点と上記（下線を施した）ＡＴＧコ
ドンとの間の異なる数のヌクレオチドが、エキソヌクレ
アーゼ■続℃・てヌクレアーゼＳ１を用いるいろいろな
程度のヌクレアーゼ消化Ｇこより除かれ、また他の実験
では発表された方法（例えば文献６および１２）および
／または製造者の勧告に太むね従いながらヌクレアーゼ
Ｅａｒ３１を用いて除かれた。これらの切断されたＤＮ
Ａ分子は、翻訳を開始させるための’　Ｓｈｉｎｅ−Ｄ
ａｌ−ｇａｒｎｏ　’″配列有するノミナＩＪ　−１２
５塩基対１ａｃＵＶ５プロモーター（ｐＫＢ２５２から
誘導された〔文献５〕）断片に結合された。このプロモ
ーター断片の配列は次の通りである。

５’−ＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＡＡ’ｌ
’ＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣ１’ＣＡ１’１”
ＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴ’ｌ’ＴＡＣＡＣ２’ｌ
’ＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡ’１１ＡＡＴＧ
’ｌ’ＧＴＧＧＡＡＴｉ’ＧＴＧＡＧＣＧＧＡ１’ＡＡ
ＣＡＡ’ｌ”ｌ’ＴｃＡｃＡｃＡＧＧＡＡＡｃＡＧ−３
’得られた組み換えＤＮＡ分子の集団は大腸菌株２９４
をアンピシリン４性に形質転換するため使用された。プ
ラスミドＤＮＡはこれらのアンピシリン耐性細菌の集団
から単離され、そしてプロモーター、オペレーターおよ
び５ｈｉｎｅ　−Ｄａ、ｌ　ｇａｒｎ。

配列を有しかつ翻訳開始コドンＡＴＧが末端についてい
る一属のｌａｃプロモーターを単離するために用いられ
た。この属の各プロモーターは５ｈｉｎｅ−Ｄａ　ｌ　
ｇａｒｎｏ配列とＡＴＧコドンとの間のヌクレオチド数
が互いに異なっており、それ故異なる翻訳開始効率（文
献４．６および７）をもつことが期待される。

非メチル化性大腸菌株から単離したこのＤＮＡ（ｌａｃ
プロモーター属を含む）のアリコート（５８μｇ）は２
５０μｌの反応容量において制限エンドヌクレアーゼＡ
υα■（これはヌクレオチド配列ＧＧＣＡ／Ｔ）ＣＣを
認識してＧ残基の間で各ＤＮＡ鎖を切断する）で消化し
た。この消化後、試′料を氷の中に入れ、１０．￥、Ｓ
’ｌ塩（１，５Ｍ　ＮａＣｌ３．０．５Ｍ酢酸ナトリウ
ムｐＨ’４．０．０．０６　Ｍ　Ｚｎ５（ｈ　）３０μ
ｍ３．５Ｍ　ＮａＣｌ３２０　ｔｉｌ１１オよびヌクレ
アーゼＳ　Ｉ　Ｃ８ｉｇｍａカタログＮ−５２５５）２
μｅ（２００単位）を加え、この混合物を１１℃で１０
分間インキュベートした。この反応混合物に（０，３Ｍ
酢酸ナトリウム、０．０１　Ｍ　ＥＤＴＡｌｏ、２　Ｍ
　）リスＭＣＩＩ　ｐＨ９，５）　０．５−を加え、そ
してエタノールの添加によりＤＮＡを沈殿させた。遠心
沈殿させたＤＮＡは適当な緩衝液に再懸濁し、ＥｃｏＥ
Ｉで消化した。この反応産物はアクリルアミドゲルで分
析し、プロモーターおよび翻訳開始配列を含むＤＮＡ断
片の集団は長さが（おおよそ）２１２５塩基対の幅広の
ＤＮＡバンドとして観察された。

この群の中に、一方の末端に切断されたＥｃｏＲ１部位
および他方の末端（フラッシュ端）に翻訳開始信号とし
て作用するＡＴＧコドンを有するＤＮＡ断片のコレクシ
ョンがあった。このＤＮＡ断片の全コレクションはアク
リルアミドから単離されて、以下に述べるごとく次の工
程でアルファー２インターフエロン遺伝子のアミン末端
コード端に結合された。

ミノ末端コード配列へのこの一群のプロモーターの結合 この工程で用いる出発物質はＨｉｎｄ　ｍ制限部位がヌ
クレオチド配列・・・・・・ＡＡＧＣＴ’７’ｑＴ・・
・・・を有する成熟アルファ−２コード配列の最初の部
分に配置されたアルファー２インターフエロン遺伝子を
含んでいた。下扉を施したコドン（ＴＧＴ）は成熟アル
ファー２インターフエロンの第１番目のアミノ酸である
システィンをコードする。この型の作製については文献
８（第９図、構造１−３）に記載さ扛ている。アルファ
ー２インターフエロン遺伝子を含むこのプラスミドはま
たこの特異なＨｉｎｄ■部位の上流に特異なＥｃｏＲ１
部位を有していた。

それ故、このＤＮＡのＨｉｎｄｍ、ヌクレアーゼＳ１お
よびＥｃｏＲＩでの段階的消化は、ｌａｃプロモーター
（上記工程２で調製されたンが予め決められた配向で結
合され得るベクターをもたぢす。

より詳細に述べると、アルファー２インターフエロン遺
伝子を営むこのプラスミド５０μＩは３５０μβの反応
容量においてＨｉｎｄ　Ｉｌｌで完全に消化された。こ
の試料を氷上に移してＩＯＸ、Ｓ’ｌ塩５０μｌｙ、　
５　Ｍ　ＮａＣ１１３５μｌＪおよびヌクレアーゼＳ１
２μ７（２００単位）を加えた。この混合物を１１℃で
１０分間インキュベートし、その後０．３Ｍ酢酸ナトリ
ウム、０．０１　Ｍ　ＥＤＴＡ　オ、Ｊ：び０．２Ｍト
リスＨＣＩＩ　ｐＨ９，５を含む溶液帆４１ｒｎｌを加
え、そして２．５容量のエタノールの添加によりＤＮＡ
を沈殿させた。このＤＮＡを再懸濁した後、それをＥｃ
ｏＲｌで消化し、その後この酵素を６５℃に加熱するこ
とにより不活化した。ＤＮＡは再びエタノールで沈殿さ
せ、最後に再懸濁して先に単離シタプロモーターのコレ
クションへ１’４ＤＮＡ’）ガーゼによって酵素的に結
合させた。その後、組み換えＤＮＡ分子は大腸菌株Ｄ１
２１０（文献９および１３）をアンピシリン耐性へ形質
転換するために用いられた。

屯成熟アルファー２インターフェロン遺伝子のアミン末
端コード配列へ結合されたプロモータ二人−ｌ−α−！
−ロー汚二ター）を！−むＤＮＡ＠片の単離プラスミド
ＤＮＡは工程３で得られたＤ１２１０のアンピシリン耐
性形質転換体の全集団から単離され、アリコート６０μ
ｓが制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ１およびＢｇｌｕ
で消化された。この反応産物は８５６ポリアクリルアミ
ドゲルの電気泳動にかけた。予期されるように、長さが
約３３０±２０塩基対の断片のぼやけた幅広バンドがあ
られれた。それ故、これらの断片はアルファー２インタ
ーフエロン遺伝子のアミン末端コード領域（第１のＢｇ
ｌｎ部位まで）へ融合されたｌａｃ転写および翻訳開始
信号を含むと期待された。この群の断片を包囲する幅広
バンドをゲルから単離した。

へ結合することによるアルファー２／アルフアー１ハイ
ブリツドインターフエロン遺伝子の形成アルファー１イ
ンターフエロン遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ（工程１
で作製された）のナリコートはｍｌＪ　限エンドヌクレ
アーゼＥｃｏＲ１およびＢｇＩＵで消化され、２つの断
片のうち大きい方（アルファー１インターフエロンのた
めのカルボキシ末端コード領域およびテトラサイクリン
耐性のための遺伝子をもつ）がアガロースゲル電気泳動
後に単離された。この大きい方のＤＮＡ断片はその後工
程４で単離されたｌａｃプロモーター断片の集団へ結合
された。

Ｇ　活性バイブ四ツドインターフエロン産生用の細菌ク
ローンをスクリーニングすることによる抗ウィルス活性
をもつハイブリッドインターフェロンを発現するクロー
ンの単離および性状決定工程５で形成された結合ＤＮＡ
分子（アルファー２／アルフアー１ハイフリツトインタ
ーフエロン遺伝子へ融合されたｌａｃ調節因子をもつべ
きである）は大腸菌株をテトラサイクリン耐性へ形質転
換させるために用いられた。個々のコロニーを暇り出し
て増殖させ、抽出物が調製された。これらの抽出物は本
質的に文献１および１０に記載の方法を用いてインター
フェロン活性の存在ニついて検定された。

プラスミドＩｐＮＡは最高水準の抗ウィルス活性を生ず
るクローンから単環された。その後、ｌａｃプロモータ
ーとこのハイブリッドインターフェロンコード配列のア
ミノ末端コード端との間の結合部をＤＮＡ配列分析にか
けた。これは予期に反して最初の４つのアミノ酸のコー
ド配列が前述の作製中に除かれたことを示しており、こ
のことは恐らく線状二本鎖ＤＮＡ分子の末端で一本鎖−
ヌクレアーゼＳｌと時々関連していることが知られてい
る゛はつれ（ｆｒａｙｉｎｇ　）　”活性によるのだろ
う。

（文献６）。この領域からの部分ヌクレオチド配列は次
のように表わされる。

（ｆｍｅｔ）　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅ
１４・・・ＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＣＴＧ　Ａ７″Ｇ　Ｃ
ＡＡ　ＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＧ・・・・・・ 本発明の他の特徴はここで定義した新規アルファーイン
ターフエロンをコードしかつ発現し得る遺伝子を含むプ
ラスミドの調製方法、ならびにこの棟のプラスミドで形
質転換された宿主の調製方法からなり、その方法は α）アルファー２インターフエロン遺伝子を含むプラス
ミドから、その遺伝子に先行する制限部位からその遺伝
子内のＰｖｕ　ＩＩ制限部位まで伸びる断片（約３００
塩基対以下の長さ）を単離すること； ｂ）この断片のコード鎖を合成オリゴヌクレオチド（例
えば約１５塩基対の長さであり得る）ヘアニーリングす
ること、この合成オリゴヌクレオチド配列は成熟アルフ
ァ−２インターフエロンコート配列の第５番目のコドン
の最初のヌクレオチド残基から出発する； Ｃ）非コード鎖を５′→３′の方向で埋めげ１ｌｌｉｎ
）　、かつコード鎖を３′→５′の方向で消費しくｅａ
ｔ　ａｗａｙ）、こうして得られた二本鎖ＤＮＡ断片を
ＢｇｌＵで消化すること； ｄ）　アルファー１インターフエロンのコード配列の上
流位置にただ１つのＥｃｏＲ１部位を有するアルファー
１インターフエロンプラスミドをＥｃ。

Ｒ１で消化し、それを埋め、そして、それをＢｇｌＨで
消化すること： ｅ）この第２プラスミドからの太ぎい万の断片を工程Ｃ
から誘導されたアルファー２インターフエロンＤＮＡの
アミノ末端コード領域へ結合すること（それによってＥ
ｃｏＲ１部位を作り直すこと）；ｆ）適当な宿主を形質
転換すること；およびｇ）その遺伝子を発現可能にする
ためにプラスミドを修飾すること； から成って℃・る。

工程ｆのための適当な宿主は大腸菌であり、これは培養
してプラスミドを増殖させることができるので工程ｇで
のその修飾工程がより容易になる。

■程ｇにおいて今や特異なＥｃｏＲ１部位を利用するこ
とができる。すなわち、そのプラスミドはＥｃｏＲＩで
消化され、両方の一本鎖末端は除かれ、てフラッシュ末
端が生成され、そして配列中にプロモーター、リポソー
ム結合部位および（その末端に）翻訳開始コドンを含む
フラッシュ末端の断片がハイブリッドアルファー２／ア
ルフアー１インターフエロン遺伝子に先行してかつそれ
を制御するためにその間げきに結合され、そしてそのプ
ラスミドは再び環状化される。

この方法は異なる遺伝調節配列の組み込みを可能にする
ので、ここで述べた最初の方法よりも適応性がある。好
適な実施態様を以下に述べる。

この作羨のための出発物質は、先に述べられかつ文献８
に記載されるように、成熟アルファ−２インターフエロ
ンコード配列の最初の部分にＨｉｎｄ■制限エンドヌク
レアーゼ部位ヲ有スる−７　ルファー２インターフェロ
ン遺伝子の誘導体および前述のＣＢｇｌＵ）アルファ−
１断片を含むのが好適である。その方法は興味ある領域
に及ぶと思われる（ノミナリー）２７６塩基対Ｈｉｎｄ
　Ｉｌｌ　／　Ｐｖｕ　ｎ断片をアルファー２インター
フエロン遺伝子を含むこのプラスミドから単離すること
から成る。その後、この断片は合成オリゴヌクレオチド
（商業的に注文合成され得る）、例えば次の配列： ５’−ＣＡＡＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣ２”Ｇ−３’で表わ
される１５ヌクレオチドとアニーリングされる。キナー
ゼ処理されたオリゴヌクレオチドが鋳型（成熟アルファ
ー２インターフエロン遺伝子のヌクレオチドコード配列
の一部を含む上記Ｈｉｎｄｍ／ＰｖｒｂＩＩＤＮＡ断片
を熱変性したもの）ヘアニーリングされるべきである。

合成オリゴヌクレオチドは成熟アルファ−２インターフ
エロンノ第５番目のアミノ酸のためのコドンの最初のヌ
クレオチドから出発する二本鎖ＤＮＡ構造を形成するだ
ろう。４種のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの
存在下での大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ
断片のポリメラーゼおよび３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性の共同作用、これに続りＢにＩｌ■での消化はア
ルファー２インターフエロンのアミノ末端（第１のＢｇ
ｌＵ部位まで）を放出させるが、これは最初の４つのア
ミノ酸のためのコドンを失うだろう。目的の断片は、例
えばオリゴヌクレオチドがガンマ−”Ｐ−ＡＴＰを用い
てキナーゼ処理されるならば、オートラジオグラフイニ
によって容易に視覚化される（文献１１）。

アルファ−１断片受容プラスミドはＥｃｏＲＩで消化さ
れ、次いで例えば４種のｄ　Ｎ　ｉ’　Ｐの存在下にＤ
ＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片で６埋められげ１
ｌｌｅｔｉ　ｉｎ）”、その後Ｂｇ＃で消化される。

次の工程でのバックグラウンドを低下させるために５′
−末端ホスフェートを除去することが推せんされる。こ
れらの操作によってつくられた大きい方の断片はその後
上記工程で単離されたアルファー２のアミン末端コード
領域へ結合される。それ故、適当な大腸菌宿主の形質転
換およびｔｅｔ　クローンの選択後に単離された組み換
えＤＮＡは、デルタ−４アルフアー２　ＣＢｇｌ　ｌｌ
−１／Ｂｇｌ　ＩＩ　）アルファー１インターフエロン
構造遺伝子の最初の部分のすぐ前方に１つのＥｃｏＲ１
部位を有する。

この遺伝子は多くの方法で発現させることができ、例え
ばこの分子を睨ｏＲＩで、次（・で多数の一本鎖特異的
ヌクレアーゼ（文献１２）のうちのどれかで消化してフ
ラッシュ末端を生成させ、これにプロモーターおよびリ
ポソーム結合部位を含みかつ翻訳開始コドンが末端につ
いているフラッシュ末端の断片を結合させることができ
る。産生力を有するクローンは調節因子が新規インター
フエロンのコード配列に関して正しい方向に配置されて
いるものであるだろう。

本発明はさら（・こ活性成分としての上記定義の新規蛋
白質または蛋白質混合物を製剤上の担体または賦形剤と
ともζこ含有してなる医薬組成物を包含する。

新規インターフェロンはヒトアルファー２インターフエ
ロンに用いられる方法および用量と同様に、好ましくは
非経口的（例えば静脈内、皮下、筋肉内）に患者へ投与
される。新規インターフェロンは局所的に適用される場
合（例えば、伝染性ウィルスの眼への感染を治療するた
めの角膜への適用）に有用であると思われる。

局所への投与量は１０５〜１０８Ｕ／Ｍ”体表面７日の
範囲が適当であるが、正しい用量は特定の患者および正
確な治療状態に応じて臨床医師が決定するだろう。次の
配合物は１９８３年６月２９日付欧州特許出願第８２４
８１号に記載のようにして調製される。

凍結乾燥用溶液（１０００バイアル、１−／バイアル）
配合 インターフェロン　７．５Ｘ１ｏ１０ＩＵグリシン、Ｕ
ＳＰ　２０．Ｏ９／１３ ヒトアルブミン、ＵＳＰ　１．０９／１注射用蒸留水、
ＵＳＰ　全量　１．Ｏｌ上記インターフェロンは本発明
０こよるハイブリッドインターフェロンまたはそれらの
インターフェロンの混合物である。

付録　：　文献 １、Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ、　Ｐｈ１ｌｉ’ｐ　Ｃ，＋
　５ａｒａ　Ｒｕｂｅｎｓ−ｔｅｉｎｒおよび５ｉｃｌ
ｎｅｙ　Ｐｅ５ｔｋａ　：Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇＩＢ　７８　：　３８７−３９４（１９８
１）、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｊｎｃ２、Ｍａ
ｎｔｅ’ｉ、Ｎ、、Ｍ’、Ｓｃｈｗａｒｚｓｔｅｉｎ、
Ｍ、５ｔｒｅ−ｕｌｉ、　Ｓ、　Ｐａｎｅｍ＋　Ｓ、Ｎ
ａ、ｇａｔａｒおよびＣ、Ｗｅ　−ｉ　８８ｍｎｎｎ　
：クローン化されたヒト白血球インターフェロンｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列。

Ｇｅｎｅ　１０：１−１０（１９８０）ａ　Ｂｏｌｉｖ
ａｒ＋Ｆ、ｒＲ，Ｌ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ＋Ｐ、Ｊ。

Ｇｒｅｅｔｙ　Ｍ、Ｃ、Ｂｅｔｌａｃｈ、　１１　、Ｌ
、Ｈｅｙｎｅｋｅｒ＋Ｈ，Ｗ、ＢｏｙｅｒＩＪ　、Ｈ，
Ｃｒｏｓａ＋およびＳ。

Ｆａｌｋｏｗ：新しいクローニングビヒクルの作製およ
び性状決定。■、多目的クローニングシステム。Ｇｅｎ
ｅ　２　：　９５　（１９７７）４　１３ａｃｋｍａｎ
、　Ｋ、および、Ｍ、　ｐｔａｓｈｎｅ　：インヒト」
こおける組み換えプラスミドの遺伝子発現の最大化。Ｃ
ｅ１ｌ　１３：６５−６５−７１（１９７８）ＦＬＢａ
ｃｋ、　Ｋ、　、　Ｍ、　ＰｔａｓｈｎｅおよびＷ、Ｇ
１１−ｂｅｒｔ　：バクテリオファージラムダのＣＩ遺
伝子をもつプラスミドの作ｆｉ。Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、７３：４１７４　４１７８（１９
７６） Ｇ　ノイｏｂｅｒｔｓ、　Ｉ’ｈｏｍａｓ　Ｍ、および
Ｇａ、ｉｌ　Ｄ。

Ｌａｕｅｒ　：インビトロにおける組み換えプラスミド
の遺伝子発現の最大化。Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ＋　６８　：　４７３−４８２、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃｐｒ（３ｓｓ　Ｊｎｃ、Ｃ１９７９）。

？　Ｒｏｂｅｒｔｓ＋１’ｈｏｍａｓＭ、＋Ｒａｙｔｎ
ｏｎｄＫａｃｉｃん。

およびＭαγｋ　Ｐｔα５ｈｎｅ：クローン化遺伝子の
発現を最大にするための一般方法。Ｐｒｏｃ。

Ｈａｔ　、　Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ、＋　Ｖｏ　ｌ　、
　７６、／１６２、ｐｐ。

７６０−７６４（１９７９） ＥＬ　Ｗｅｉｓｓｍｎｎ、　Ｃ，ニインターフェロンお
よび他のミスティクのクローニング：　Ｉｎｔｅｒｆｅ
υ０１１＋１９８１、Ｖｏｉ３、ｐｐ、１０１、Ｊｏｎ
　Ｇｒｅ−ｓｓｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ
　＋　Ｎ、Ｙ、　（１９７９）９、　５ａｄｌｅｒ＋Ｊ
、Ｒ９＋Ｍ、ｉ’ｅｃｋｌｅｎｂｕｒｇおよびＪ、Ｌ、
Ｂｅｔｚ：合成ラクトースオペレーターの多くのタンデ
ムコピーを含有するプラスミドＧｅｎｅ　８：２７９−
３００（１９８０）ＩＱ　Ｎａｇａｔａｒ　Ｓ、＋　Ｈ
，１’ａｉｒａ＋　Ａ、　Ｈａｌ　ｌ　、　Ｌ、　Ｊｏ
ｈｎ−ｓｒｕｄ、　Ｍ、　５ｔｒｅｒｂｌｉｒ　Ｊ、　
Ｅｃｓｏｄｉ、　Ｗ、　Ｈａｌｌ　。

Ｋ、Ｃａｎ　ｔ　ｅ　ｌ　ｌ　＋およびＣ、Ｗｅ　ｉ　
ｓ　ｓｍａｎｎ　：　ヒト白血球インターフェロン活性
を有するポリペプチドの大腸菌内での合成。Ｎαｔｕｒ
ｅ２８４：３１６−３２０（１９８０） １１、Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄａｖｉｄ　Ｖ、ｒＨ，Ｍｉ
ｃｈａｅｌ　５ｈｅｐａ−ｒｔＬ　Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ
　Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎｒ　Ｄａｖｉｄ　Ｌｅｕ−ｎｇ、
およびＲｏｂｅｒｔｏ　Ｃｒｅａ　：大腸菌によるヒト
線維芽細胞インターフェロンの合成。

ＮｒＬｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　Ｖｏｌ、
　８、／Ｉ６．１８、ｐｐ、４０５７−４０７４（１９
８０）１２、先に特定して記載されていない方法および
操作もしくは本質的に同等な代用方法に関する記録は多
数の利用再能な”実験手引書”中に見出すことができる
。例えば、７“、Ｍａｎｉα−ｔｉｓ、　Ｅ、Ｆ　、Ｆ
ｒ１ｔｓｃｈおよびＪ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ＋６モレキ
ユラークローニングー実験ｘマ＝ユアル＃（１９８２）
、ｔｈｅ　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ研究所
編、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｎ、Ｙ。

ｌａ　Ｄａｇｅｒｔ　、　Ｍ、およびＳ−Ｄ、Ｅｈｒｌ
ｉｃｈ：塩化カルシウム中での長期培養は大腸菌細胞の
受容能力を改善する。Ｇｅｎｅ　ｆＬ：　２３−２８（
外５名） 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理手続補正書（
方式） 昭和６０年５月１７日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、事件の表示　−μ 昭和５９年　特許　願第　２６８２２５号３、補正をす
る者　− 事件との関係　出　願　人 住所 名称　シュリング・コーポレーション ４代理人 ５、補正命令の日付　昭和６０年４月６０日（発送日）
６、補正の対象 凍結乾燥用溶液（１０００バイアル：１ｍｌ／）＜イア
ル）１釦 インターフェロン　７．５Ｘ　１０”　Ｉ　Ｕ燐酸水素
二ナトリウム無水、　２．２７ｇ／（ＩＵＳＰ（米国薬
局方）、試薬 燐酸水素二ナトリウムＵ　Ｓ　Ｐ　Ｏ，５５！？＃！グ
リシン、Ｕ　Ｓ　Ｐ　２０．Ｏｙ＃！ヒ）アルブミン、
Ｕ　Ｓ　Ｐ　１．Ｏｇ／／ｌ注射用蒸留水、ＵＳＰ　全
量　１．０１上記インターフエロンは本発明によるノ）
イブリ・ンドインターフェロンまたはそれらのインター
フェロンの混合物である。

住鋒り幼（ １，７アミレツチ　フィリップシー（Ｆａｍｉｌｌｅｔ
ｔｉ。

Ｐｈ＋ｌｉｐ　Ｃ，）＋サラ　ルベンスタイン（Ｓ　ａ
ｒａＲｕｂｅｎｓ　ｔｅ　ｉ　ｎ　）およびシトニー　
ペスカ（ＳｉｄｎｅｙＰ　ｅｓｔｋａ）：”酵素学にお
ける諸方法（ＭｅｔｈｏｄＳｉｎＥ　ｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）″、Ｌ影：３８７−３９４（１９８１）、アカデミ
ツクブレス社（Ａ　ｅａｃｌｅｍｉｃ　Ｐ　ｒｅｓｓ　
Ｉ　ｎｃ）２、マンティ　エヌ（Ｍａｎｔｅｉｖ　Ｎ、
　）＋エム　シュワルツスタイン（Ｍ　、Ｓ　ｃｈｗａ
ｒｚｓｔｅｉｎ）エム　ス）レウリ（Ｍ、　５ｔｒｅｕ
ｒｉ）、ニス　パネム（Ｓ　、　Ｐ　ａｎｅ、ｍ）菅ニ
ス　す〃り（Ｓ　、Ｎ　ａｇａｔａ）およびシー　ワイ
ズマン（ＣｌＷｅｉｓｓｍａｎｎ）：　Ｉ−クローン化
されたヒト白血球インターフェロンｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列」：“ジーン（Ｇｅ＋＋ｅ）”１０：１−１０
（１９８０）３、ポリバー　エフ（Ｂｏｌｉｖａｒ、Ｆ
、　）、アールエル　ロドリゲス（ＲｏＬ、　Ｒｏｄｒ
ｉｇｕｅｚ）＋ビージェー　グリーン（Ｐ、Ｊ、　Ｇｒ
ｅｅｎ）、　ｘム　シーベトラッハ＜Ｍ　、　Ｃ、Ｂ　
ｅｔｌａｃｌ＋）、　：ｒ−ツチ　ニルハイ冬フカ−（
Ｈ、Ｌ　、　Ｈｅｙｎｅｋｅｒ）＋　工ｙチ　ダブ’）
　ｘ　ホイ７　（Ｈ，Ｗ、Ｂｏｙｅｒ）＋　ジヱー　エ
ッチ　クローザ（Ｊ　、Ｈ，Ｃｒｏｓｎ）＋およびニス
　７Ｔルコツ（Ｓ　、　Ｆ　ａｌｋｏＩｌｌ）：　［新
しいクローニングビヒクルの作製および性状決定。■、
多目的クり−ニングシステム］：“シーン（Ｇｅｎｅ）
”Ｌ：９５（ｆ９７７） ４、ベックマン　ケー（Ｂ　ａｃｋｍａｎ、Ｋ　、　）
およびエム　プタシュネ（Ｍ　、　Ｐ　ｔ＋＋５ｈｎｅ
）：　ｒインビトロにおける組み換えプラスミドの遺伝
子発現の最大化Ｊ：″セル（Ｃｅｌｌ）″　１３：６５
−７Ｈ１９７８）５、ベックマン　ケ−（Ｂａｅｋｍａ
ｎ、に、　）、エムブタシュネ（Ｍ　、Ｐ　ｔａｓｈｎ
ｅ）およびグプリュ　ギルｔ＜　−）　（Ｗ、　Ｇ　１
ｌｂｅｒｔ）：　ｒバクテリオ７Ｔ−シラムダのＣＩ遺
伝子をもつプラスミドの作製］：ブロシーディングス　
オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンシス
（Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎ　ａｔ、　Ａ　ｃａｄ、Ｓｃｉ、）
、７３：４１７１−４１７８（１９７６）６、ロバート
　トーマス　エム（Ｒｏｂｃｒｔ＝＋、ＴＩ＋ｏｍａｓ
Ｍ、）およびゲイル　ディー　ロイア−（ＧａｉｌＤ、
　Ｌａｕｅｒ）：　ｒインビトロにおける組み換えプラ
スミドの遺伝子発現の最大化］二“酵素学における諸方
法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
”、　３Ｑ：４７３−４８２、アカデミツク　プレス社
（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉ　ｎｃ、　）（１
９７９）。

７、ロパート　トーマス　エム（ＲｏｂｅｒＬｒ、＋Ｔ
ｂｏｍａｓＭ、）、レイモンド　カチヒ（Ｒａｙｍｏｎ
ｄ　Ｋａｃｉｃｌ＋）＋およびマーク　ブタシュネ（Ｍ
ａｒｋ　Ｐｔａｓｂｎｃ）：　ｒクローン化遺伝子の発
現を最大にするための一般力法Ｊ：“プロシーディンゲ
ス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエン
シス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）、７６巻、Ｎｏ、
２、ｐｐ。

７６０−７６４（１９７９） ８、ワイズマン　シー（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ、Ｃ，）：
　ｒインターフェロンおよび他のミスティクのクローニ
ング」；“インターフェロン（Ｉ　ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ
）”、　１９８１．３巻、ｐｐ、１０１＋イオン　グレ
ーザー（ＩｏｎＧ　ｒｅｓｓｅｒ）ｉ！　％アカデミツ
クブレス社（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅＳｓ　）＋−ニー
ヨーク（Ｎ、　Ｙ、　）、（１９７９）９、サドラー　
ジェ−アール（Ｓ　ａｄｌｅｒ＝　Ｊ　、　Ｒ、）。

エム　テクレンプルグ（Ｍ　、　Ｔ　ｅｃｋｌｅｎｂｕ
ｒｌｌ）およびジエー　エル　ペッツ（Ｊ、Ｌ、Ｂｅｔ
ｚ）二ｒ今成フクトースオペレーターの多くのタンデム
コピーを含有するプラスミド」：“ジーン（Ｇｅｎｅ）
Ｌ：２７９−３００（１９８０） １０、す〃タ　ニス（Ｎ　ａｇａｔａ＋　Ｓ　、　Ｌ　
エッヂ　タイフ（Ｈ、Ｔ　ａｉｒａ）、　ニー　ハル（
Ａ、　Ｈａｌｌ）、　ｘル　ジａンスラッド（Ｌ　、Ｊ
　ｏｌ＋ｎ５ｒｕｄ）、　ｊ−Ａ　Ｘ）ロイリ（Ｍ、Ｓ
　ｔｒｅｕｌｉ）＋　ジーｘ、−ｘ９ソ９（Ｊ。

Ｅｃｓｏｄｉ）Ｉグブリュー　ポル（Ｗ、　Ｂｏｌｌ）
、ケイキャンチル（Ｋ、Ｃａｎｔｅｌｌ）、およびシー
　ワイズマン（Ｃ、Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ）：　ｒヒト白
血球インターフェロン活性を有するポリペプチドの大腸
菌内での合成」：“ネイチ＋　−（Ｎ　ａｔｕｒｅ）３
８４：３１６−３２０（１９８０） １１、ゴーデル　ディピッド　ブイ（Ｇ　ｏｅｄｄｅ　
ｌ　。

Ｄａｖｉｄ　Ｖ、　）、エッチ　ミッチェル　シェパー
ド（Ｈ、Ｍ　１ｃｈａｅｌ　Ｓ　ｈｅｐａｒｄＬ　エリ
ザベス　イエルベルトン（Ｅｌｉｚａｂｔｈ　Ｙｅｌｖ
ｅｒｔｏｎＬディピッド　ロイング（Ｄａｖｉｄ　Ｌｅ
ｕｎｇ＞＋　およびロバートクレア（Ｒｏｂｅｒｔｏ　
Ｃｒｅａ）：　［大腸菌１ご−よるヒト線維芽細胞イン
ターフェロンの合成］：“ヌクレイツク　アシッズ　リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　）、８
巻、Ｎｏ、　１８．　ｐｐ、　４０５７−４０７４（１
９８０） １２、先に特定して記載されていない方法および操作も
しくは本質的に同等な代用方法に関する記録は多数の利
用可能な“実験手引書”中に見出すことができる。例え
ば、ティー　マニアステイス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ
）、イー　エフ　７リツシ、（Ｅ。

Ｆ　、’　Ｆ　ｒｉｔｓｃｌ＋）およびジヱー　サムブ
ルーフ（Ｊ。

５ａｌＩｂｒｏｏｋ）ｌ″モにキュシークローニングー
実験室マニュアル”（１９８２）、ザコールド　スプリ
ング　ハーバ−（ｔｌ＋ｅ　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒ）研究新編、フールド　スプリング　ハーバ
−（Ｃｏｌｄ　Ｓ　ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ）＋　：　
ｘ−ヨーク（Ｎ。

Ｙ、） １３、グデート　エム（Ｄａｇｅｒｔ、Ｍ、　）お上（
７ｚス　ディー　エールリッヒ（Ｓ、Ｄ、Ｅｈｒｌｉｃ
ｌ＋Ｇ［塩化カルシウム中での長期培養は大腸菌細胞の
受容能力を改善する］：゛ジーン（Ｇ　ｅｎｅ）”Ｌ：
２３２８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　アルファーインターフェロンとして自然界に存
   在しないアミノ酸鎖からなる１６１個のアミノ酸配列、
   またはその配列の第１番目のアミノ酸へ結合されるメチ
   オニンの任意付加により１６２個のアミノ酸配列を有す
   る蛋白質であって、前記配列がＣＢＱｌｎ）アルファー
   １セグメントに先行するデルタ−４アルフアー２　ＣＢ
   ＱＩ　ＩＩ　−１）サブセグメントと定義されて簡略化
   された自然界に存在する２種の異なるアルファーインタ
   ーフェロンのそれぞれのサブ配列を結合させた、前記の
   ２種のアルファーインターフェロンの異なる部分を含む
   ことを特徴とする蛋白質。 （２）次の１６１個または１６２個のアミノ酸配列：Ｃ
   Ｍ’ＥＴ）、　ＧＬＮ　ＴＨＲＨ’ＩＳ　ＳＥＲＬＥＵ
   　ＧＬＹＳＥｆｌ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　ＴＨＲＬＥＵ　Ｍ
   ＥＴ　ＬＥＵ　ＬＥＵＡＬＡ　ＧＬＮ　ＭＥＴ　ＡＲＧ
   　ＡＲＧ　ＩＬＥ　５ＥＲＬｌ！；ＵＰＨＥ　ＳＥＲＣ
   ＹＳ　ＬＥＵ　ＬＹＳ　ＡＳＰ　ＡＲＧ　ＨＩＳＡＳＰ
   　ＰＨ’Ｅ　ＧＬＹ　’ＰＨＥ　ＰＲＯＧＬＮ　ＧＬＮ
   　ＧＬＵＰＨＥ　ＧＬＹ　ＡＳＮ　ＧＬＮ　ＰＨＥ　Ｇ
   ＬＮ　ＬＹＳ　ＡＬＡＧＬＵ　ＴＨＲＩＬＥ　ＰＲＯＶ
   ＡＬ　ＬＥＵ　ＨＩＳ　ＧＬＵＭＥＴ　ＩＬＥ　ＧＬＮ
   　ＧＬＮ　ＩＬＥ　ＰＨＥ　ＡＳＮ　ＬＥＵＰＲＥ　Ｔ
   ＨＲＴＨＲＬＹＳ　ＡＳＰ　ＳＥＲＳＥＲＡＬＡＡＬＡ
   　ＴＲＰ　ＡＳＰ　ＧＬＵ　ＡＳＰ　ＬＥＵ　ＬＥＵ　
   ＡＳＰＬＹＳ　ＰＨＥ　ＣＹＳ　ＴＨＲＧＬＵ　ＬＥＵ
   　ｉ’ＹＲＧＬＮＧＬＮ　ＬＥＵ　ＡＳＭ　ＡＳＰ　Ｌ
   ＥＵ　ＧＬＵ　ＡＬＡ　ＣＹＳＶＡＬ　Ｍ’ＥＴ　Ｇｌ
   、Ｎ　’ＧＬＵ　ＧＬＵ　ＡＩＩＧ　ＶＡＬ　ＧＬＹＧ
   ＬＵ　ＴＨＲＰＲＯＬＥＵ　ＭＥＴ　ＡＳＮ　ＡＬＡ　
   ＡＳＰＳＥＲＩＬＥ　Ｌ、ｌ！；Ｕ　ＡＬＡ　ＶＡＬ　
   ＬＹＳ　ＬＹＳ　ｉ’ＹＲＰＨＥ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　Ｉ
   ＬＥ　ＴＨＲＬＥＵ　ＴＹＲＬＥＵＴＨＥＧＬＵＬＹＳ
   ＬＹＳＴＹＲ８ｌし’ＲＰノン０ＣＹＳＡＬＡ　ＴＲＰ
   　ＧＬＵ　ＶＡＬ　ＶＡＬ　ＡＩｔＧ　ＡＬＡ　ＧＬＵ
   ＩＬＥ　Ｍｌ！；Ｔ　ＡＲＧ　５ｈＨＩ　ＬＥＵ　ＳＥ
   ＲＬ１２：Ｕ　ＳＩ！Ｊ′ＲＴＨＲＡＳＮ　ＬＥＵ　Ｇ
   ＬＮ　ＧＬＵ　ＡＲＧ　ＬＥＵ　ＡＲＧＡＲＧ　ＬＹＳ
   　ＧＬＵ （式中、ＸはＯまたは１である） からなり、細胞変性作用−阻害検定法で′／ｆ４＋＋定
   して少なくとも約１×１０７単位／ｌｎ９の抗ウィルス
   活性を有する蛋白質。 （３〕　特許請求の範囲第１項または第２項に記載の蛋
   白質の混合物。 （４）活性成分としての特許請求の範囲第１〜３項のい
   ずれかに記載の蛋白質または蛋白質混合物を製剤用の担
   体または賦形剤とともに含有してなる医薬組成物。 （５〕　特許請求の範囲第１項または第２項に記載の蛋
   白質をコードしかつ次の配列： ＣＡＴＧ）ＣＡＡ　ＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＧ　ＧＧＴ
   ＡＧＣＡＧＧ　ＡＧＧ　ＡＣＣ１’ＴＧ　Ａｉ”Ｇ　Ｃ
   ＴＣＣＴＧＧＣＡ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　
   ＡＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＣＴＣＣＴＧＣ１’ＴＧ　ＡＡ
   Ｇ　ＧＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＣＴＴＴ　ＧＧＡ　ＴＴＴ
   　ＣＣＣＣＡＧ　ＧＡＧＧＡＧＴＴＴ　ＧＧＣＡＡＣＣ
   ＡＧ　Ｔ１’ＣＣＡＡ　ＡＡＧＧＣＴＧＡＡ　ＡＣＣＡ
   ＴＣＣＣＴ　Ｇ７’ＣＣＴＣＣＡＴ′ＧＡＧＡＴＧ　Ａ
   ＴＣＣＡＧ　ＣＡＧ　ＡＴＣＴ’ｌ”ＣＡＡＣＣＴＣＴ
   ＴＴ　ＡＣＣＡＣＡ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＴＣＡ　ＴＣＴ
   ＧＣＴ　′ＧＣ１’　ＴＧＧ　ＧＡＩ’　ＧＡＧ　ＧＡ
   ＣＣ１’ＣＣ１’Ａ　ＧＡＣＡＡＡ　’ｌ’Ｔｃ　ＴＧ
   ＣＡＣＣＧＡＡ　ＣＴＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧ　ＣＴＧ　
   ＡＡＴ　ＧＡＣＴＴＧ　ＧＡＡ　ＧＣＣＴＧＴＧＴＧ　
   ＡＴＧ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＡＧＧ　Ｇｉ’Ｇ　
   ＧＧＡＧＡＡ　ＡＣＴ　ＣＣＣＣＴＧ　ＡＴＧ　ＡＡＴ
   　ＧＣＧ　ＧＡＣＴＣＣＡＴＣＴＴＧ　ＧＣＴ　ＧＴＧ
   　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＡＣ１’ＴＣＣＧＡ　ＡＧＡ　Ａ
   ＴＣＡＣＴ　ＣＴＣＴＡＴ　ＣＴＧＡＣＡ　ＧＡＧ　Ａ
   ＡＧ　ＡＡＡ　ＴＡＣＡＧＣＣＣＴ１’ＧＴＧＣＣＴＧ
   Ｇ　ＧＡＧ　ＧＴＴ　ＧＴＣＡＧＡ　ＧＣＡ　ＧＡＡＡ
   ＴＣＡＴＧ　ＡＧＡ　ＴＣＣＣＴＣ’Ｉ’ＣＴ　ＴＩ’
   Ａ　ＴＣＡＡＣＡ　ＡＡＣＴ１”Ｇ　ＣＡＡ　ＧＡＡ　
   ＡＧＡ　Ｔｉ’Ａ　ＡＧＧＡＧＧ　ＡＡＧ　ＧＡＡ　〔
   ７°ＡＡＩ（式中、開始コドンＡＴＧは丸括弧の中に記
   載され、停止コドンＴＡＡは角括弧の中に記載される）
   を有するＤＮＡ配列、ならびに特許請求の範囲第１項ま
   たは第２項に記載の蛋白質をコードするが遺伝コードの
   同義性により上記配列とは異なるＤＮＡ配列。 （６）　特許請求の範囲第５項記載のＤＮＡ配列を含み
   かつそのＤＮＡ配列を発現し得るベクター。 （７）特許請求の範囲第６項記載のベクターで形質転換
   された宿主。 （８）特許請求の範囲第６項記載のベクターまたは特許
   請求の範囲第７項記載の宿主の調製方法であって、 （ＣＬ）　ただ１つのＥｃｏＲ１部位を有するアルファ
   ー１インターフエロンプラスミドの誘導体を作製するこ
   と： ＜ｂ〕　ＡＴＧ翻訳開始コドンが末端についておりかつ
   ’　Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ”配列とこの開始コ
   ドンとの間のヌクレオチド数が異なる一群のプロモータ
   ーを作製すること； （Ｃ）　この一群のプロモーターをアルファー２インタ
   ーフエロン遺伝子のアミン末端コード配列へ結合させる
   こと； Ｃｄ）　アルファー２インターフエロン遺伝子のアミノ
   末端コード配列へ結合されたプロモーター領域を含むＩ
   ）ＮＡ断片を単離すること；（Ｃ）　これらのプロモー
   ター含有断片をカルボキシ末端アルファ−１インターフ
   エロンコート配列へ結合させること；２よび ω　得られたプラスミドで宿主を形質転換させ、活性ハ
   イブリッドインターフェロン産生用の宿主クローンをス
   クリーニングすること； かもなることを特徴とする上記調製方法。 （９）特許請求の範囲第１項または第２項に記載の新規
   アルファ型インターフェロンをコードする遺伝子を含み
   かつ前記インターフェロンを発現し得るプラスミド、ま
   たはこのようなプラスミドで形質転換された宿主の調製
   方法であって、（Ｇ）　アルファー２インターフエロン
   遺伝子を宮むプラスミドから、その遺伝子に先行する制
   限部位からその遺伝子内のＰｖｕ　ＩＩ制限部位逢で伸
   ひる断片を単離すること； （ｂ）　この断片のコード鎖を合成オリゴヌクレオチド
   ヘアニーリングすること（ただし、合成オリゴヌクレオ
   チド配列は成熟アルファ−２インターフエロンコード配
   列の第５番目のコドンの最初のヌクレオチド残基から出
   発する）。 （Ｃ）　その非コード＠ヲ５′→３′の方間で埋め、か
   つコード鎖を３′→５′の方間で消費し、こうして得ら
   れた二本鎖ＤＮＡ断片をＢｇｌｎで消化すること； （ｄ）　アルファー１インターフエロンのコード配列の
   上流位置にただ１つのＥｃｏＲ１部位を有するアルファ
   ー１インターフエロンプラスミドｆＥｃ。 Ｒ１で消化し、それを埋め、そしてそれをＢ（Ｉｌｍで
   消化すること； Ｃｅ）　この第２プラスミドからの犬ぎい方の断片を工
   程＜Ｃ）で得られたアルファー２インターフエロンのア
   ミノ末端コード領域へ結合すること：（イ）適当な宿主
   を形質転換すること；および（σ）その遺伝子を発現可
   能にすべくそのプラスミドを修飾すること； からなることを特徴とする上記調製方法。 （ト）特許請求の範囲第７項記載の宿主を培養すること
   からなる、特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載
   の新規インターフェロン型蛋白質′の産生方法。