JPS60224497A - 高転換シロツプの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、高転換シロップの製造方法及び該方法に使用
する固定化α−アミラーゼに関する。

〔従来技術〕

高転換シロップは、グルコース及びマルトース分が特徴
的に高い。これらは大部分、菓子類（ソフトキャンディ
）、罐詰製造、ソフトドリンク、醸造及びパン焼きに使
用されるが、シロップは４℃以上で、乾燥物質（以下、
ＤＳと記す）８０〜８３％では結晶しないであろう。高
転換シロップの一般的組成範囲は、ＤＥ６０〜７０．３
９％（Ｄ　Ｓ）を越えないグルコース、２５〜３７％（
ＤＳ）のマルトース及び残部、ＤＰ３Ｐ２Ｏ６のである
。しばしば適用される更に精密な組成は、ＤＥ６２〜６
５、グルコース３５％±３％（Ｏ３）、マルトース３０
％±２％（ＤＳ）　、ＤＰ３１３％±３％（ＤＳ）　、
ＤＰ４＋　２２％±３％（ＤＳ）である。

高転換シロップは、従来、液化澱粉、通常酸液化澱粉を
酵素処理し、マルトース性（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ）ア
ミラーゼ及びグルコアミラーゼを組み合わせることによ
って製造された。この方法は制御しがたく、煩雑である
。高転換シロップに関して更に精密な組成を大量生産で
達成するのはむしろ困難である。

本発明の主な目的は、液化澱粉溶液から高転換シロップ
を製造する簡単な方法を提供することである。

〔発明の原理〕

高転換シロップを製造する最も簡単な方法は、もちろん
、液化澱粉溶液を１種又は複数種の適当な酵素の作用に
よって高転換シロップに転換する一工程反応である。液
化澱粉をグルコースシロップに糖化する、広く使用され
ているバッチ法と同様に、液状マルトース性酵素が液化
澱粉溶液バッチの高転換シロップへの転換を触媒するこ
とが期待される。

不幸にも、市場で得られるα−アミラーゼは、前記の方
法には不適当であり、経済的量で使用しない場合にも、
また、処理に許容しうる量で使用しない場合にも、高転
換シロップに相応しない澱粉加水分解スペクトルを生じ
る。

アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ
ｉｇｅｒ　）及び他の黒色アスペルギルス種は、耐熱性
であり、特にグルコアミラーゼも液化澱粉に添加した場
合に、有用な澱粉加水分解物スペクトルを生じる酸安定
性α−アミラーゼを生じる。

しかし、酸安定性α−アミラーゼ自体を可溶性形で使用
しても、高転換シロップを生じない。例えばバシラス・
リチェニフォーミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉ
ｆｏｒｍｉｓ　）及びバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）から得られる細菌性中性
α−アミラーゼ、例えば商標、ターマミル（Ｔｅｒｍａ
ｍｙ　Ｉ　）及びパン（ＢＡＮ　）の下に市販されてい
るものの可溶性形をそれぞれ使用することは、工業的応
用には適当でない。

文診は単独で、そのα−アミラーゼが固定化された形で
存在すれば、澱粉加水分解生成物を高転換シロップに転
換する反応を触媒することが意外にも判明した。

〔発明の詳細な説明〕

簡単に言えば、本発明方法は、液化澱粉溶液を担体物質
内部に共有結合により固定化されたα−アミラーゼ、例
えば酵素を含む顆粒の形で固定されたα−アミラーゼで
加水分解することを含む。

このような形のα−アミラーゼは、連続操作カラム反応
器の内部に充填床として使用するのに好適である。

加水分解は５５〜７０℃の範囲の温度で、ｐＨ３〜７で
実施する。

加水分解が比較的高い温度で実施されるので、α−アミ
ラーゼは加水分解を実施する条件下に充分に耐熱性でな
ければならない。９Ｎは好ましくは３〜５であり、液化
澱粉のＤＥは好ましくは１２〜５５、更に好ましくは３
０〜５５である。

本発明の好ましい実施態様では、担体中のα−アミラー
ゼは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）属
菌から誘導さ、１１．・フる酸安定性のα−アミラーゼ
製剤から固定化されたものであり、該製剤はトランスフ
ェラーゼ及びグルコアミラーゼ活性をほとんど有しない
ものである。酸安定性α−アミラーゼは、好ましくはア
スペルギルス・ニガーカラ誘導される。酸安定性α−ア
ミラーゼはアスペルギルス・ニガー０３Ｍ２７６１株か
ら誘導されうるものが最も好ましい。

更に好ましいα−アミラーゼはバシラス属菌、例えばバ
シラス・サチリス及びバシラス・リチェニフォーミスか
らの中性α−アミラーゼである。

本発明は、更に、担体物質内部に共有結合により固定化
されたα−アミラーゼを含む、特許請求の範囲に記載し
た方法による高転換シロップの製造用の固定化α−アミ
ラーゼ生成物を提供する。

以下／＝、白 〔発明の詳細〕 財 性α−アミラーゼ 液化澱粉溶液を高転換シロップに加水分解するため、ア
スペルギルス・ニガ一群のうち１種より多くのアスペル
ギルス種によって産生じた酸安定性酵素を使用すること
ができる。

酸安定性α−アミラーゼは、カナダ特許第６６３．２７
４号明細書及びＡｇｒ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、にお
ける若干の論文（ワイ・ミノダら著、Ａｇｒ、　Ｂｉｏ
ｌ。

Ｃｈｅｍ　、　２７巻Ｎａ１１．８０６〜８１１頁、１
９６３年；３２巻１１ｍ１．１０４〜１０９頁、１９６
８年及び３２巻Ｎｂ、　１．１１０〜Ｉ　１３頁、１９
６８年）。

酸安定性α−アミラーゼは、先行文献に記載されている
ように、種々の黒色アスペルギルス種、例えばアスペル
ギルス・ニガー、アスペルギルス・ウサミイ　（Ａ、　
ｕｓａｍｉｉ　）及びアスペルギルス・アワモリ（Ａ、
　ａｗａｍｏｒｉ）を、最初は酸性条件（ｐＨ２，５〜
４．５）で、次いで弱酸性条件（ｐＨ約５．５）で培養
するか、又は好ましい実施態様のため以下に記載するよ
うにして製造することができる。酸安定性α−アミラー
ゼの他に、酸に不安定なα−アミラーゼ（中性アミラー
ゼ）並びにグルコアミラーゼ及びトランスフェラーゼ活
性を有する酵素が野性株によって形成される。

本発明者が確認しうる限りでは、アスペルギルス・ニガ
一群の種類による酸安定性α−アミラーゼの変動は本発
明においては些細であり、酵素を産生ずるため文献に報
告されているもの以外のアスペルギルス種から作られた
酸安定性α−アミラーゼが、はぼ同一の酸安定性α−ア
ミラーゼであることが予測される。

アスペルギルスの野性株によって産生される酸安定性α
−アミラーゼ生成物は、不都合にも、不所望な副作用活
性、特にグルコアミラーゼ活性及びトランスフェラーゼ
活性の存在により、本発明の実施には適当でない。本発
明を実施するには、酸安定性アスペルギルスα−アミラ
ーゼ生成物はトランスフェラーゼ及びグルコアミラーゼ
活性をほとんど含むべきでなく、このような酸安定性α
−アミラーゼ生成物はもちろん、前記のカナダ特許及び
文献の教示により、硫酸アンモニウム、リハノール及び
アセトンを用いて分別結晶させること・によって製造さ
れ、この場合には、結晶形の酸安定性α−アミラーゼが
得られる。

本発明の実施に好ましい酸安定性アスペルギルスα−ア
ミラーゼ生成物は、不所望な活性を生じないように変異
させたアスペルギルス・ニガー株によってトランスフェ
ラーゼ及びグル゛コアミラーゼ活性をほとんど含まない
ように製造される。酸安定性α−アミラーゼの更に詳細
は、酸安定性α−アミラーゼの好ましい態様と共に本発
明の実施に関連して述べる。

本発明の好ましい実施態様においては、アスペルギルス
・ニガーの株を突然変異させて、アミログルコシダーゼ
及びトランスフェラーゼ活性を有する酵素の合成を阻止
し、酸安定性α−アミラーゼの合成能を充分に保有させ
た。アスペルギルス・ニガーのこのような突然変異株（
ＴＳＡ−１）の培養物は、西ドイツ・ゲッティンゲンの
ドイツ微生物寄託（Ｇｅｒｍａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ　ｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　（ＤＳＭ　）
　）に１９８３年９月２日に寄託され、参照番号ＤＳＭ
２７６１を付されている。

中性α−アミラーゼ 本発明の実施に更に適当なα〜アミラーゼは、ハシラス
・サチリス及びハシラス・リチェニフオーミスからの中
性α−アミラーゼ〔フォガーテイ（Ｗ、　Ｍ、　Ｆｏｒ
ｇａｒｔｙ）　、ミクロービアル・エンザイムス・アン
ド・パイロチクノロシイ　（ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｎｚ
ｙｍｅｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）　
”アプライド・サイエンス（Ａｐｐｌｉｅｄ　５ｃｉｅ
ｎｃｅ　）　、ロンドン、１９８３年、１〜９２頁、フ
ォガティ編集〕、例えば市場で入手しうる耐熱性ハシラ
ス・サチリスα−アミラーゼ、例えば商標パン（ＢＡＮ
）の下に市販されているもの及び市場で入手しうる耐熱
性ハシラス・リチェニフォーミスα−アミラー七、例え
ば商標ターマミル（ＴＥＲＭＡＭＹＬ）の下で市販され
ているもの〔両者ともに、デンマークのノボ・インダス
トリイ社（ＮＯＶＯＩｎｄｕｓｔｒｉ　Ａ／Ｓ　）　％
こよって供給される〕である。

高温の加水分解工程に使用するのに充分に耐熱性であれ
ば、本発明により他のα−アミラーゼ、例えばハシラス
・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅ
ａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　）からのα−アミラ
ーゼを使用することもできる。

酵素活性の測定 酸〜定性α−アミラーゼ 酸安定性α−アミラーゼ１単位（ＦＡＵ）は、標準状態
〔温度３７℃、ｐＨ４，７（０，ＯＩ　Ｍ酢酸塩緩衝液
）及び反応時間１時間〕で、澱粉５．２６　ｇ（乾燥物
質）〔メルク（Ｍｅｒｃｋ　）社製〕を加水分解し、加
水分解された澱粉が沃素−沃化カリウム（ＫＪ４．０４
ｇ／６及びＪｏ、０２２ｇ／ｊ！の添加によって僅かし
か着色しない可溶性酵素の量であり、ディライト・コン
ベアレータ・イルミネータ（ＤａｙｌｉＬｅ　Ｃｏｍｐ
ａｒａｔｏｒ　Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ）を使用して酵
素標準品と比較することによって試験する。

酸安定性α−アミラーゼは、中性アミラーゼが存在する
場合には、これを不活性化した後に、ｐＨ２，５の０．
１Ｍ　ＭＣＩと共に酸性静置によって測定することがで
きる。３７℃で３０分静置した後、ｐＨをＮａＯＨで４
．７に調節する。酸安定性α−アミラーゼがこの操作に
よって１００％の収率で得られる。

中性α−アミラーゼ １キロノボ中性α−アミラーゼ単位（Ｋ　Ｎ　Ｕ）は、
標準状態（温度３７℃、ｐＨ５，６，０，０００３ＭＣ
ａ＋＋）で１時間に澱粉５．２６ｇ（乾燥物質）を加水
分解し、前記のような沃素によって僅かしか着色しない
酵素の量と定義される。

酸安定性α−アミラーゼの製造 次に、酸安定性α−アミラーゼの製造を詳述する。

アスペルギルス・ニガー突然変Ｊ１株ＴｓＡ−１の胞子
を平板寒天から滅菌水に移し、同化可能の炭素及び窒素
源及び無機塩類を含む適当な培地を含む接種タンクに無
菌状態で移す。攪拌及び曝気を開始し、タンク中で良好
に成長するまで（又は約４８時間）、３０〜３６℃で培
養を実施する。

タンク内容物の一部を、同化可能の炭素及び窒素源及び
無機塩類を含む適当な培養培地を含む主培養タンク（２
０００Ｊ）に移す。ｐｎは約５．０〜６．５であり、曝
気及び攪拌を開始する。培養を約３０〜３６℃で実施し
、約２４時間培養した後、ｐＨを約３．２〜５．０に調
節する。合計培養時間は約１００〜２００時間である。

次に、培養液からｒ過及び遠心分離によって真菌菌糸体
を除去する。必要に応じて、液を蒸発により濃縮し、防
腐剤を添加することができる。

生じる酵素濃縮液は約５０〜３００ＦＡＵ／ｍｌの範囲
の活性を示すのが代表的である。

酵素濃縮液は、マルターゼ活性を殆ど示さない（マルト
ース１ｇ当たり酵素０．３２ＦＡＵを用いて、ＤＳ約２
５％のマルトースを７０℃で７０時間静”置した後、グ
ルコースの形成は認められなかった）。

也のα−アミラーゼの曹゛覧 ハシラス・サチリス及びハシラス・リチェニフォーミス
から誘導される中性α−アミラーゼの製造は、文献に周
知である。製剤が市販されていない場合には、酸安定性
α−アミラーゼについて、上記したようにして濃縮液を
製造することができる。

酵素化学的性質 酸　α−アミラーゼ 例１に記載したようにして製造した酸安定性α−アミラ
ーゼ濃縮液の活性の温度及びｐｕ依存性を、温度及びｐ
ｏを所定値に調節した反応混合物を使用して、前記の酸
安定性α−アミラーゼ活性の測定法によって測定した。

次に、図面に基づいて説明する。図面において、第１図
は、ＰＨ４，５で温度に対してプロットした相対的活性
を示すグラフであり、第２図及び第−ｉ図はそれぞれ３
７℃及び６０℃でｐＨ（酢酸塩及びクエン酸塩緩衝側で
調節）に対してプロットした相対的活性を示すグラフで
ある。酵素濃縮液はｐＨ４，５で約７５℃の活性最適を
有し、そのｐＨ最適は３〜５の範囲にあることが判る。

例１に記載したようにして製造した酸安定性α−アミラ
ーゼの耐熱性を、濃縮液ＩＩｌ当たりＣａ＋＋１００■
を添加し、ｐＨを５．０に調節した後、測定した。残留
アミラーゼ活性を前記の方法で測定した。結果を下記の
表に示ず： 第１表 温度（℃）　１準分裁ｐ漫留活性％ ７０　１００ ７５　８２ ８０　１０ 中性α−アミラーゼ ハシラス・サチリス及びハシラス・リチェニフォーミス
から得られるα−アミラーゼの酵素化学的性質は良く知
られている〔フォガーティ　（Ｗ、Ｍ。

Ｐｏｇａｒｔｙ　）の前掲文献参照〕。

トランスフェラーゼ及びグルコアミラーゼ活性の産生株
を精製又は突然変異により除去したにもかかわらず、酸
安定性アスペルギルスα−アミラーゼ自体を可溶性形で
使用すると、前記の如き高転換シロップは製造されない
。また、ハシラス・サチリス及びハシラス・リチェニフ
オーミスから得られる、可溶性形の中性α−アミラーゼ
、例えば商標サーマミル及びパンの下に市販されている
ものは、それぞれ高転換シロップを生成しない。

ところで、固定化形の前記α−アミラーゼが、高転換シ
ロップの直接形成を触媒しうろことが意外にも判明した
。種々のα−アミラーゼを用いて得られた代表的実験結
果を以下に記載する。可溶性酸安定性α−アミラーゼの
加水分解スペクトルと固定化酵素のそれとの間の顕著な
差異を第■表に示す。

基質は、ロケット・フレレス（ＲｏｑｕｅｔｔｅＦｒｅ
ｒｅｓ）から得られる４０〜４２ＤＥ酸液化澱粉シロツ
プであった。このシロップのｐＨを４．５に調節し、乾
燥物質含有率を４５％に調節した。実験を６０℃で実施
した。使用量は、バッチ実験で可溶性酵素については０
．１６　ＰＡＵ／ｇＤｓ　（後に定義される如＜）、固
定化酵素については０．１６ＩＦＡＵ／ｇＤＳであった
。バッチの糖化時間は２４時間であうた。

以下余白 第■表 Ｗイ七ｍ バッチ実験　３２　３４　１２　２２　６４中性α−ア
ミラーゼは、可溶性酵素の加水分解スペクトルと固定化
酵素のそれとの間に差異を示ずく例１２参照）。

固定化α−アミラーゼが担体物質内部に存在し、担体物
質表面に吸着又は共有結合によって酵素が固定化された
ものではないことは既に述べた〔ヒャシダ（Ｈｙａｓｈ
ｉｄａ）ら著、＾ｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

４６　（６）１６３９〜ｌ　６４５　（１９８２）参照
）。

固定化技術自体は、本発明の一部をなすものではなく、
担体物質中に酵素を共有結合するため文献に示唆されて
いる多数の酵素固定化方法が、実際に本発明の固定化酵
素を形成するのに適当であると考えられる。西ドイツ特
許出願箱Ｐ３３３６２５７．２号及び同第Ｐ　３３３６
２３５．１号明細書に記載されている固定化方法は好ま
しい。

本発明者は、固定化酵素に比較して可溶性酵素からの加
水分解スペクトルにおけるＤＰＩ　、ＤＢ３の差異が顕
著である（上記の第■表参照）理由は、浸漬された担体
物質の内部に存在する微小環境に起因すると考えている
。担体中に拡散する比較的高分子量のデキストリンであ
るＤＰ４＋フラクションは、特に立体的に内部に保有さ
れ、担体物質内部に固定された酵素に粒子内のＤＰ４十
分子をリミットデキストリン（はとんど、ＤＰＩ及びＤ
Ｐ２Ｉ！類である）に加水分解する機会を与える。この
場合に、酵素中にトランスフェラーゼ活性及びグルコア
ミラーゼ活性が存在しないことは、極めて重要である。

固定化α−アミラーゼの化学的性質 固定化酸安定性α−アミラーゼ 固定化酸安定性α−アミラーゼの活性の温度及びｐ）Ｉ
依存性を、温度及びｐＨを所定の値に調節した酸液化シ
ロップを使用して、下記の固定化α−アミラーゼ活性の
測定方法によって測定した。ＤＳ４５％の４２ＤＥ酸液
化シロップ１５ｍ１に１４１ＦＡＵの量の固定化酵素を
添加し、０．ＯＩＭ＃酸塩緩衝剤で緩衝し、サーモスタ
ンドを付けた振盪水浴中に２時間保持した。完成シロッ
プを分析し、ＤＢ−値を活性の表現として採用した。

次に、図面に基づいて本発明を説明する。図面において
、第４図は例３及び５に記載した２種の異なる固定化製
剤について６０℃で９Ｈに対してプロットした相対的活
性を示すグラフであり、第５図は例３及び５に記載した
２種の異なる固定化製剤についてｐＨ４，５で温度に対
してプロットした相対的活性を示すグラフである。

固定化酵素は、ｐＨ４，５で７０〜８０℃の範囲に最適
活性を示し、そのｐｔ＋最適は３．５〜４．５の範囲に
あることが判る。

固定化酵素活性の測定 化　性α−アミラーゼ Ｉ　ＩＦＡＵは、デキストリン基質から、下記の条件で
測定したときにＩ　ＦＡＵの可溶性酸安定性α−アミラ
ーゼと同じＤＰ４＋の減少を生じる固定化酸安定性α−
アミラーゼの量と定義される。

固　し　安定性α−アミラーゼに関する分析条孔 基質：　３０％ｗ　／　ｗマルトデキストリンＭＤ０３
　Ｌ、ＣＰＣ 温度：　６０℃ ｐｌ：　４．５ 反応時間：水浴振盪装置中で１時間。

固定化酵素粒子をｉ１取することによって反応を停止さ
せる。可溶性酵素との反応は、ｐＨを約９に変え、沸騰
することによって停止させる。

走化　α−アミラーゼ １　１ＫＮＵは、デキストリン基質から、下記の条件下
に測定したときに１にＮＵの可溶性中性α−アミラーゼ
と同じＤＰＱ＋の減少を生じる固定化中性α−アミラー
ゼ製剤の量と定義される。

固定化中性α−アミラーゼに関する分析条件り質：　３
０％ｗ　／　ｗマルトデキストリンＭＤ０３　Ｌ、ＣＰ
Ｃ 温度＝　６０℃ ｐｔｔ：　４．５ 反応時間：水浴振盪装置中で１時間。

固定化酵素粒子をｒ去することによって反応を停止させ
る。可溶性酵素との反応は、ｐＨを約９に変え、沸騰す
ることによって停止させる。

炭水化物スペクトルをＨＰＬＣによって測定する。

基質 本発明を実施するには、１２〜５５のＤＥ範囲の液化澱
粉が好ましく、更に好ましいＤＥ範囲は３０〜５５であ
る。合理的に高いＤＥ３０のレベルはシロップに対して
、デキストリン分子を担体物質に浸透させうる粘度及び
拡散特性を確実にする。他方、ＤＥ５５の上限は、基本
的には、高すぎるか、又は低すぎ、シロップの性質に左
右される任意限界である。例えば、ＤＥ約４０の酸で加
水分解した澱粉のランダム・スペクトルは本発明の実施
に最も便利であり、酸加水分解澱粉は本発明の実施に好
ましい液化澱粉基質である。もちろん、酵素で液化した
澱粉を使用することもできる。

処理パラメータ ｍｊＬ： 選択する操作温度は、高い活性、良好な安定性と微生物
汚染の危険との間の調和点である。第５、図に示したよ
うに、活性は５０〜７０℃の温度範囲にわたって増加す
るが、他方、半減期は、温度が上昇すると、減少する。

微生物汚染の危険は高温で最も低い。我々は、６０℃で
生産性が良好であり、微生物汚染の危険が低いことを見
いだした。

工業的規模では、最も低い転換コスト及び微生物的に安
全な工程を生じる温度は、特許請求の範囲に記載した５
５〜７０℃の範囲にある蓋然性が最も高く、プラント毎
に変動する。

ｌ： 第４図から判るように、酸安定性α−アミラーゼの良好
な操作範囲はｐＨ３〜５であり、更に好ましい範囲は４
〜５である。それというのは、酵素の安定性はｐＨ範囲
の高い部分で一層大きいことが判ったからである。

中性α−アミラーゼについては、良好な操作範囲はｐＨ
４，５〜７であり、更に好ましい範囲はｐｌ５．５〜６
．５である。

憂！乾爆隻ｌ α−アミラーゼを高い基質含有率によって安定させる。

酵素又は酸液化工程に通常使用される０３３０〜５０％
の高い乾燥物質は、固定化α−アミラーゼを用いる糖化
工程に好適である。

本発明を更に理解するため、下記の実施例を示す。

■１ 酸安定性α−アミラーゼの製゛ 接種用タンク中で下記の培地３００１を製造した： コーンスティープリカ−７，２＆ｆ グルコース　？、　２　ｋｇ ＣａＣＯ３０，９ｋｇ プルローソク（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）　Ｌ　６１　３０Ｉ
Ｉｌｌ水　全量３０ｏ１にする。

ＣａＣＯ３の添加及び滅菌の前に、ｐｉを５．５に調節
した。混合物に、３０℃で約７日間培養したＣ−１寒天
（脱イオン水中、蔗糖３％、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、Ｎ
ａＮＯ３０，３％、ＭｇＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ０，５％、
ＦｅＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ０，０１％、ＫＣｌ０．０５％
及び寒天２．５％）を含むフェルンバッハ（Ｆｅｒｎｂ
ａｃｈ）フラスコからのＤＳＭ２７６１株の胞子を接種
した。

攪拌（３００ｒｐｍ　）及び曝気（３０ＯＮ１／分）を
開始し、３４℃で約５１時間培養を実施した。

次に、タンク内容物１５０ｊ！を下記の成分を含む主培
養タンクに移したニ ゲルコース　３４０　ｋｇ 大豆粉　８５蹟 ＫＨ２ＰＯ４５，１１＋ｇ Ｎａ２ＨＰＯａ　・１２　Ｈ２Ｏ６，８ｋｇプルロニッ
クＬ６１　１５０ｍ１ 水　全量１７００ｍｌにする。

初めの１８時間の培養の間に、曝気を５０ＯＮ１／分か
ら１７０　ＯＮＩ／分に徐々に増加し、攪拌を０から２
５０ｒｐｍに増加した。培養を３４℃で実施した。接種
前には、ｐｎは６．２であり、２４時間培養後には亜燐
酸の添加により徐々に３．２〜３．５に低下した。残り
の培養の間、ｐＨを３．２〜３．５に保持した。合計培
養時間は１４０〜１６０時間であった。

１、３　Ｆ　Ａ　Ｕ／ｍｌを含む培養液をｐＨ４，０で
３％クラライト（Ｃ１ａｒｉｔ）　ＢＷ　１００　（ベ
ントナイト）で前処理し、プリコートとしてＨ２Ｏ［Ｈ
２Ｏは、ジョーン・マンビル（Ｊｏｈｎ　Ｍａｎｖｉｌ
ｌｅ　）社から得られる珪藻土〕を有するプリコート真
空ドラム−過器で一過した。ドラムｒ過液をザイツ平板
１００以上の上で一過し、ロミコン（Ｒｏｍｉｃｏｎ　
）　ＰＭ　−１０膜で限外−過した。

限外−過酸、濃縮液を一過助剤としてＨ２Ｏ及びＣＢＬ
／３　（ＣＥＣＡから得られる珪藻土）を有スるフレー
ムフィルタープレス〔シューレ（Ｓｃｈｕｌｅ）　）で
−過した。最後にｒ液をＲＤ（屈折計乾燥固体）が３８
％になるまで蒸発させ、安息香酸ナトリウム（０，１％
）及びソルビン酸カリウム（０，１％）で防腐した。

得られた酵素濃縮液は６７　Ｆ　ｆｉ、　Ｕ／ｍｌの酵
素活性を有していた。糖アルコールの含有率は１．３重
量％であり、濃縮液はマルターゼ活性を有しなかった。

ｐ１１２．５．３７℃で３０分培養した後、１００％の
残留酸安定性アミラーゼ活性が認められ、これは前記の
培養工程の間に中性α−アミラーゼが生成しなかったこ
とを示す。

肛 可溶性酸安定性α−アミラーゼを用いる　化基質として
４２ＤＥ酸液化シロツプを使用し、４５％の乾燥物質含
有率になるように脱イオン水で希釈した。ｐＨを４．５
に調節し、酵素を乾燥固形分１ｇ当たり０．１６ＦＡＵ
に相当する量で添加した。フラスコを撹拌しながら６０
℃の水浴中に置いた。０．２．２４及び４８時間の後に
２５ｍ１を採取し、ＨＰＬＣで分析した。結果を下記の
表に示す。

第■表 反応　ＤＰＩ　ＤＰ２　ＤＰ３　ＤＰ４＋　ＤＥ時間ｈ
　％　％　％　％ ０　１８　１１　１１　５９　４２ ２　１９　１７　１９　４５　４６ ２４　２２　３３　２４　２１−　５６４８　２５　３
６　２０　．１９　５８剌」− 例１に記載したようにして製造し、部分的に精製したア
スペルギルス・ニガー酸安定性α−アミラーゼを下記の
操作により更に精製した。

１ｋｇの酵素含有溶液に３ｋｔｒの水及び２００ｇのク
ラ−セル（Ｃ１ａｒｃｅｌ　’）　ＣＢＬ　３　（ｊ濾
過助剤）を添加した。ｐＨを４．５に調節した。混合物
を加圧実験室用−過器で一過した。沈澱を捨てた。

Ｆ液ニ（ＮＨ４）２ＳＯ４１４３４ｇを添加した。４℃
で１．５時間後、混合物を３５０Ｏｒｐｍで３０分遠心
分離した。上澄液を捨て、沈澱をｐｌ（４，５の０．０
５Ｍ酢酸塩緩衝液７９５ｍ１に溶解させた。次に、再溶
解した沈澱をイオン交換水に対して透析し、アミコン（
静１ｃｏｎ）中空繊維透析装置で濃縮した。

濃縮液は１４％のＤＳを含み、アスペルギルス・ニガー
酸安定性α−アミラーゼ活性は１１５ＦＡＵ／ｇ（前記
方法により測定）であった。

酵素濃縮液の一部を真空中で０３１４％からＤＳ　２２
．５％に更に濃縮した。Ｄ　Ｓ　２２．５％の酵素溶液
１２．５　ｇを、西ドイツ特許出願第Ｐ３３３６２３５
．１号明細書例６に記載されているようにして製造した
乾燥担体粒子１５ｇと混合した。１時間真空吸引するこ
とにより担体粒子中の空気を酵素溶液と交換した。

酵素含有粒子をＮａ２ＳＯ４２２％、酢酸ナトリウム２
％及び活性グルタルアルデヒド０．１５％を含む溶液（
ｐＨ６，０）　３７５ｍｌに移した。この操作によりア
スペルギルス・ニガーは担体粒子に架橋結合された。

４時間後、粒子をｐＨ４，５の３％酢酸ナトリウム溶液
１００ｍ１で５回洗浄した。湿った粒子を凍結し、解凍
した後、カラムに充填した。この生成物をＳＡＭ−１０
と記す。

同様に、前記のようにしてＳＡＭ−１、ＳＡＭ−２及び
ＳＡＭ−１４を製造したが、その際使用したグルタルア
ルデヒド濃度は、ＳＡＭ−１の製造の際には０．１％、
ＳＡＭ−２及びＳＡＭ−１４の製造の際には０．２％で
あった。

炎↓ ＤＳ１４％の酵素濃縮液（例３に記載）３５．７ｇをイ
オン交換水でＤＳＢ％に希釈した。ｐ）ｌを６．０に調
節し、酵素を架橋結合させるために５０％グルタルアル
デヒド溶液１．５ｍｌを添加した。１時間後、架橋結合
した酵素を１．５ｍｌのスーパーフロック（Ｓｕｐｅｒ
ｆｌｏｃ　）　Ｃ５２１を用いて溶液から７゜キュレー
ションさせる。綿状沈澱物を実験室用−過器でｒ遇し、
その後、綿状沈澱物から過剰の水を手で絞りだす。湿っ
たフィルターケーキを１龍の篩で造粒し、室温で一夜乾
燥する。活性は１４ＩＦＡＵ／　ｇであった。この生成
物をＳＡＭ−３と記す。

鼾 ＤＳ、１４％の酵素濃縮液（例３に記載）４７．８ｇを
０．６ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２０を含む水３０Ｉ１１１
に溶解したアルブミン７ｇと混合した。

４　Ｎ　ＮａＯＨを用いて叶を６．０に調節した。５０
％グルグルアルデヒド溶液２．５ｍｌを添加した後約５
分に、物質は硬いゲルにゲル化していた。ゲルを１ｆｉ
の篩で造粒し、水１００ｍ１で洗浄した。過剰の水を排
出させ、顆粒を室温で一夜乾燥した。

活性を前記の方法で測定したところ、１２．６１ＦＡＵ
／ｇであった。

この生成物をＳＡＭ−５と記す。ＳＡＭ−４、ＳＡＭＩ
Ｉ及びＳＡＭ−１６を同し方法で製造した。

鼾 予備試験として、４種の異なる固定化アスペルギルス・
ニガー酸安定性α−アミラーゼを使用して、バッチ条件
下に４２ＤＥ酸液化シロツプを糖化した。製剤は、ＳＡ
Ｍ−１及びＳＡＭ−２（例３に記載”）　、ＳＡＭ−３
（例４に記載）及びＳＡＭ−４（例５に記載）であった
。温度は６０”Ｃであった。ｐＨは４．５で、ＤＳは４
５％であった。ＨＰＬＣ及びＤＥ分析のために、２４時
間及び４８時間後に、試料を採取した。結果を下記の表
に示す。

（以下余白） 第■表 ２４時間　４８時間 シ氏ＩＩＮα　ＤＰＩ’　ＤＰ２　ＤＰ３　ＤＰ４→　
ロＥ　ＤＰＩ　ＩＦ５　０Ｐ３　０Ｐ４÷　ロＥ％　％
　％　％　％　％　％　％ ＳＡＭ−１２９３５１６２１６２３８３５９１８６７５
ＡＭ−２２８３４１６２２６１３７３４１０１８６７Ｓ
ＡＭ−３３２３４１２２２６２４３３２６１８７１３Ａ
Ｍ−４２５３４１６２５５７３３３６１０２１６４鼾 ＳＡＭ−５乾燥粒子８．８ｇを４２ＤＢ酸液化澱粉シロ
ツプ中に２時間浸漬した。乾燥粒子の粒径は３００〜８
５０μｍの範囲内であった。予め、シロップのｐＨを４
．５に調節し、乾燥物質含有率をＤＳ約８０％から４５
％に減少させた。微生物汚染を避けるため、１１００ｐ
ｐのカソン（Ｋａｔｈｏｎ）８８６をシロップに添加し
た。粒子を直径１．５ｃ１１１の水冷ジャケット付きカ
ラムに充填した。カラムを６０℃に保持し、酸液化澱粉
シロ・ノブを酵素床を通して連続的にポンプで送入した
。生成シロ・ノブを約６２のＤＢに保持するために、流
速を制御した。酵素の活性の表現としてＤＥ−値を使用
すると、酵素の半減期は、約１５００時間と算出された
。粒子の初期活性は、すべて乾物基準で計算して２．５
ｇ生成物／ｈ／ｇ粒子であることが判った。

以下余白 シロップの組成 出口のｐｉは４．３〜４．４であり、カラムは２０００
時間より長く運転された。

鼾 ＳＡＭ−１１の乾燥粒子８．５ｇを浸漬し、例７に記載
したようにカラムに充填した。乾燥粒子の粒径分布は下
記の通りであった二 立′　粒子の量 ＞１０００μｍ　５８％ ７１０〜１０００μｍ　２２％ ４７５〜７１０μｍ　１２％ ２７０〜４２５μｍ　８％ 酸液化澱粉シロップを例７と同じ条件下にポンプで送入
した。ＤＢを６２に保持するために、再び、流速を制御
した。半減期は約１３５０時間と算出され、初期活性は
乾物基準で２．Ｏｇ生成物／ｈ／ｇ粒子であることが判
った。出口シロップの組成は下記の通りであった。

３１　３４　１４　２１　６２ この結果は、例６に比べて、同じＤＥでＤＰＩがわずか
に少なく、ＤＢ２は少し多かった。出口のｐ）Ｉは４．
２〜４．３であった。

鼾 例３に記載したようにして製造した湿潤ＳＡＭ−１０粒
子１７．５　ｇをカラムに充填し、前記の例と同じ条件
下に実施した。同じＤＥでの生成物シロップは、前記の
例における組成とは若干具なる組成を有した。即ち、Ｄ
　Ｐ　、は少なく、Ｄ　Ｐ　２は多い。

３０　３７　１４　１９　６２ 書土度 ハシラス・サチリスからの固定化中性α−アミラーゼ（
商標、パンの下に市販されているα−アミラーゼを例５
に記載したようにして固定化）８ｇを４２ＤＢ酸液化澱
粉シロツプ中に２時間浸漬した。予め、シロップのｐＨ
を６．０に調節し、乾燥物質含有率をＤＳ約８０％から
４５％に減少させた。微生物汚染を避けるため、１１０
０ｐｐのカセン（Ｋａｔｈｅｎ）　８８６を添加した。

粒子を直径１．５０の水冷ジャケット付きカラムに充填
した。カラムの温度を６０℃に保持し、液化澱粉シロッ
プを酵素床を通してポンプで送入した。生成シロップを
約６２のＤＥに保持するために、流速を制御した。粒子
の初期活性は、乾物基準で約０．７ｇ生成物／ｈ／ｇ粒
子であることが判った。出口シロップの組成は、下記の
通りであった。

ハシラス・リチェニフオーミスからの固定化中性α−ア
ミラーゼ（商標、ターマミルの下に市販されているα−
アミラーゼを例５に記載したようにして固定化）１３ｇ
を例１０に記載したのと同じ方法で処理した。出口シロ
ップの組成は下記の通りである。

３５．１　２Ｂ、５　１４．０　２２．２　６２例１２
（比較例） 例１０におけるのと同じ基質を６０℃で可溶性中性α−
アミラーゼ、例えば商標、パン及びターマミルの下に市
販されているものでそれぞれ試験した。

結果は、下記の通りであった。

以ｉ　１’、３ｉ １）ψ燥物實１ｇ当たり 前記の結果から、可溶性形の中性α−アミラーゼは、高
転換シロップの一層厳密な規定を満たすには、グルコー
ス含有率が低すぎることが判る。

更に、高度の加水分解を達成するには、極端に高い使用
量の中性α−アミラーゼ及び長い反応時間が必要となり
、工業的生産には全く不適当である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＨ４，５におけるα−アミラーゼ活性一温
度曲線図、第２図は３７℃におけるα−アミラーゼ活性
−ｐｉ曲線図、第３図は６０℃におけるα−アミラーゼ
活性−ｐＨ曲線図、第４図は、例３及び例５に記載した
２種の固定化α−アミラーゼの６０℃における活性＝ｐ
Ｈ曲線図、第５図は、例３及び例５に記載した２種の固
定化α−アミラーゼのＰＨ４，５における活性一温度曲
線図である。 以ｌＡ１−一 相対活性（’／、） ０ ｐＨ＝４．５ 第１図 相対活性（’／、） Ｔ＝３７°Ｃ 第２図 Ｔ＝６０’Ｃ 相対活性（’／、） Ｔ＝６０’ 第４図 相対活性（’１０　’） ｐＨ＝４．５ 第５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、担体物質の内部に共有結合により固定化されたα−
   アミラーゼと液化澱粉を５５〜７０℃の温度で、３〜７
   のｐＨで接触させることによって液化澱粉を加水分解す
   ることからなり、該α−アミラーゼはこれらの条件下で
   加水分解を実施するのに充分に安定であることを特徴と
   する高転換シロップの製造方法。 ２、加水分解を３〜５のｐＨで実施する特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ３、　液化澱粉が１２〜５５のＤＢを有する特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ４６　液化澱粉が３０〜５５のＤＥを有する特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ５、担体中のα−アミラーゼが、アスペルギルス（Ａｓ
   ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）属菌から誘導されうる酸安定性
   のα−アミラーゼ製剤から固定化されたものであり、該
   製剤がトランスフェラーゼ及びグルコテミラーゼ活性を
   ほとんど有しない特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、酸安定性α−アミラーゼがアスペルギルス・ニガー
   （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　）から誘導さ
   れうるものである特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、酸安定性α−アミラーゼがアスペルギルス・ニガー
   （＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　）　ＤＳＭ　
   ２７６１株から誘導されうるちのである特許請求の範囲
   第６項記載の方法。 ８、α−アミラーゼがバシラス（Ｂａｃｉ　ｌ　１ｕｓ
   ）属菌から誘導されうるα−アミラーゼである特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ９、　α−アミラーゼがバシラス・サチリス（Ｂａｃｉ
   ｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）から誘導されうるα−
   アミラーゼである特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、α−アミラーゼがバシラス・リチェニフォーミス
   （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）か
   ら誘導されうるα−アミラーゼである特許請求の範囲第
   ８項記載の方法。 １１、担体物質内部に共有結合により固定化されたα−
   アミラーゼを含み、特許請求の範囲第１項による高転換
   シロップの製造方法に使用するのに適当な固定化α−ア
   ミラーゼ生成物。 １２、担体物質内部に共有結合により固定化され、アス
   ペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）属菌から誘導
   されうる酸安定性のα−アミラーゼを含み、トランスフ
   ェラーゼ及びグルコアミラーゼ活性をほとんど有しない
   固定化α−アミラーセ生成物。 １３、酸安定性α−アミラーゼがアスペルギルス・ニガ
   ー（＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　）から誘導
   されうるものである特許請求の範囲第１２項記載の固定
   化α−アミラーゼ生成物。 １４、酸安定性α−アミラーゼがアスペルギルス・ニガ
   ー（八ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｌｇｅｒ　）　ＤＳＭ
   　２７６１株から誘導されうるちのである特許請求の範
   囲第１３項記載の固定化α−アミラーゼ生成物。 以下余白