JPS60227681A - ジフテリア毒素のシグナルペプチドをコ−ドするヌクレオチド配列、このヌクレオチド配列を含有するベクタ−、これらによる微生物の形質転換およびこうして得られるペプチド組成物 - Google Patents

ジフテリア毒素のシグナルペプチドをコ−ドするヌクレオチド配列、このヌクレオチド配列を含有するベクタ−、これらによる微生物の形質転換およびこうして得られるペプチド組成物

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JPS60227681A
JPS60227681A JP59158534A JP15853484A JPS60227681A JP S60227681 A JPS60227681 A JP S60227681A JP 59158534 A JP59158534 A JP 59158534A JP 15853484 A JP15853484 A JP 15853484A JP S60227681 A JPS60227681 A JP S60227681A
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microorganism
hybrid
phage
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ミシエル・カクゾレツク
ピエール・チオレ
ニコル・シヤンシネ
ロルフ・ウ・ストレーク
パトリス・ボケ
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Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Institut Pasteur
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Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Institut Pasteur
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、ジフテリア毒素（トキシン）のシグナルペプ
チドをコードしているヌクレオチド配列、好ましくはＤ
ＮＡ、このヌクレオチド配列を含有するベクター、これ
らのベクタ、−を使用する微生物の形質転換およびこれ
らによって得られるペプチド組成物に係る。
ジフテリア毒素の遺伝子がある種のコリネバクテリオフ
ァージ、例えばβｔｏｘ−１−、、ｔｏｘ十のケノは既
に決定されている。
見掛は上全体としては同一の分子構造を有するか、その
人フラグメントが酵素活性を失なっており、かつそのＢ
フラグメントの、活性毒素が侵入し得る（またはこの逆
）細胞の膜受容体認識能力が低下している毒素をコード
しているファージ突然変異体が知られている。しかしこ
のタンパク質は血清学的には活性毒素と区別できない。
このタイプの遺伝子を含有する公知のコリネバクテリオ
ファージの中には、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｌｕｍ　
Ｃ７βｔｏｘ−１−の培養物をＮ−メチル−ｄ−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＧ）で処理して野性のβ
ｔｏｘ−１−リオファージβ。２２８がある（ＵＣＨＩ
ＤＡ、Ｔ。
ＰＡＰＰＥＮＨＥＩＭＥＲ，Ｊｒ、Ａ、Ｍ、およびＧＲ
ＥＡＮＹ、Ｒ，Ｊ、Ｂｉｏｔ、Ｃｈｅｍ、２４８．３８
３８−３８４４（１９７３）参照）。
また、ジフテリア毒素の細胞による産生には、毒素自体
の他に「ペプチドＳ」と命名されたシグナルペプチドを
含む前駆体の合成が含まれることも前記文献に示されて
いる。このペプチドは、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅで合成された毒素が、ペプチ
ドＳが細菌によって酵素的に間装された後、これらの細
胞め・膜を通過し外部培質中に分泌される段階で重要な
役割を果しているものと思われる。
ジフテリア毒素の前駆体にペプチドＳが最初ノ存在する
という仮説は既にＳＭＩＴＨ等が示唆しプＩｓ２　／　
ｖ　ｕａｒ＋　１　Ｊ　１　１　ＱＡ　−Ｉ　ＲＱ　ｒ
ＩＱＲｌｌ）参照）。この仮説は、天然の塩基性アミノ
酸と必メツセンジャーＲＮＡからジフテリア毒素を１ｎ
ｖｉｔｒｏで合成するテストにおける観察に基づいてい
た。
メツセンジャーＲＮＡが利用できるようになったため、
ジフテリア毒素の遺伝子のβファージゲた。しかし、こ
のペプチドシグナルの現実の存在、従ってペプチドＳを
コードしているＤＮＡの「配列Ｓ」の研究および確認は
末だなされていないのである。
発明の概説 本発明の基礎となる発見は、βファージゲノムから切り
出した配列が挿入されているプラスミドで予じめＥ　、
　ｃｏｔｉを形質転換した後に、ジフテリ−ア毒素また
はジフテリアアナトキシンに対して前取って形成された
抗体が認識し得るタンパク質の産生を前記Ｅ　、　ｃｏ
ｔｉ中で誘発し得るということである。この配列は充分
な長さを有しているため、この配列が、シグナルペプチ
ドをコードしているＤＮＡ配列をも、ジフテリア毒素の
遺伝子の転写および翻訳の調節要素を含有する先行ＤＮ
Ａ配列より下流の配列と共に含有しているという仮説が
支持された。すなわち、ジフテリア毒素ＣＲＭ２２８を
コードしている遺伝子を含有するインサートでＩ）ＢＲ
３２２を修飾して得られたプラスミド（ｐＴＤ４４およ
びＩ）ＴＤ７６）で形質転換したＥ　、　ｃｏｚｌを培
養したところ、この毒素に対して形成された抗体が免疫
学的に認識するポリペプチドを合成し得るようになった
。これらの例示プラスミドのインサート（１）ＢＲ３２
２のＢａｍＨ１部位に挿入されている）は、３．９キロ
塩基（ｋｂ）であり両端にＢａｍＨ，Ｉ末端を有する断
片で構成した。この断片はそれ自体ファージβｃ２２８
のゲノムから得たものである。すなわち、ファージゲノ
ムを制限酵素１３ａｍＨ１で加水分解し、得られた制限
断片を単離し、この断片を毒素のメツセンジャーＲＮＡ
の相補放射性ＤＮＡプローブとバイブリプ−ジョンした
。このメツセンジャーＲＮＡは、予じめ毒素を分泌する
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍｄｉｐｈｔｅｒｉａ
ｅの菌株の膜ポリソームから単離した。
トの配向にかかわりなく可能である。特にプラスミドｐ
ＴＤ４４とｐＴＤ７６は、前記ＢａｍＨＩインサートの
挿入方向が反対であるというだけの違いしかない。
このように、形質転換に使用したプラスミド中のインサ
ートの配向に関係なく！よｃｏｔｉ中でＣＲＭ２２８毒
素を発現し得るということは、テリア毒素の転写および
翻訳を調節する調節要素すなわち天然のプロモーターの
制御下で上記の発現が行なわれるということを示す。こ
の仮定は以下の実施例に記載のテストによって確認され
ている。
換イすると、Ｅ　、　ｃｏｚｉの細胞機関がファージβ
由来のジフテリア毒素の転写と翻訳の配列を認識し得る
ということが示された。この結果は、Ｃｏｒｙｎａｅ　
ｂａｃｔｅｒｉａｅとＥ　、　ｃｏｔｉ菌株が系統発生
上屋いに隔離されていることを考えるととりわけ顕著な
ことである。実際、Ｃｏｒｙｎａｅ　ｂａｃｔｅｒｆａ
ｅは単一膜を有するダラム陽性菌であり、Ｅ　、　ｃｏ
ｚｉは二重膜を有するグラム陰性菌である。
この発見により本発明への道が開かれた。すなわち、ジ
フテリア毒素をコードしている遺伝子の完全な配列解析
が可能になったのである。更に、本発明の種々の局面が
導出された。例えばペプチド、すなわち特にシグナルペ
プチド配列（ペプチドＳ）と同一または類似のペプチド
配列を含有するハイブリッドペプチドまたは非ハイブリ
ッドペプチド、前記ペプチドをコードしているヌクレオ
チド配列を含有するＤＮＡ断片およびバイブ・リッドＤ
ＮＡ、ならびに種々のタイプの微生物の形質転換を可能
にしかつ容易にするベクターである。
より詳しくは本発明は、ヌクレオチド対少なくとも７５
個で多くきも１０００個、好ましくはヌクレオチド対を
最大で３７５個含有するＤＮＡ断片に係り、このＤＮＡ
断片は下記ペプチド配列をコードしているヌクレオチド
から成る基底（基本）配列を含有している。
ＭＥＴ　ＳＥＲＡＲＧ　ＬＹＳ　ＬＥＵ　ＰＨＥ　ＡＬ
Ａ　５ＥＲＩＬＥ　ＬＥＵ　ＩＬＥ　ＧＬＹ　ＡＬＡ　
、ＬＥＵ　ＬＥＵ　ＧＬＹＩＬＥ　ＧＬＹ　ＡＬＡ　Ｐ
ＲＯＰＲＯＳＥＲＡＬＡ　ＨＩＳＬＡ より特定的には本発明は下記のヌクレオチド基底配列を
含有する断片に係る。
ＧＴＧ　ＡＧＯＡＧＡ　４ＡＡ　ＣＴＧ　ＴＴＴ　＠９
Ｇ　ＴＣＡ　ＡＴＣまた、本発明は上記定義の１つまた
は別の１つを満たす好ましいＤＮＡ断片に係り、この断
片は上記基底配列ｑｑｈ、、ｉ読方向に関口方向の基底
配列より上流にあるプロモーターを含有する第２配列を
含む混合配列を含有しており、前記基底配列はこのプロ
モーターの制御下にある。この混合配列は以下のヌクレ
オチド構造を有すると好ましい。
ＣＣＣＴＴＡＴＡＡＴ　ＴＡＧＧＡＴＡＧＣＴ　ＴＴＡ
ＣＣＴＡＡＴＴｏ　為 ＡＴＴＴＴＡＴＧＡＧ　ＴＣＣＴＧＧＴＡＡ（、ＧＧＧ
ＡＴＡＣＧＴＴ□　−Ｉ ＧＴＧ　ＡＧＣＡＧＡ企ＡＡ　ＣＴＧ　ＴＴＴ　（ｆｌ
ｃＧ　ＴＣＡ　ＡＴＣＴＴΔＡＴＡ　ＧＧＧ　ＧＣＧ　
９ＴＡ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　４．、’ｐＡ　ＧＧＧＧＣＣ
Ｃ（４ＣＣＴ　ＴＣＡ　ＧＣＣ５Ａ丁（：（Ｃ１０更に
本発明は、βファージの遺伝子ＤＮＡに対しては異種の
配列と共に後記に定義される如き断片を含有するハイブ
リッドＤＮＡにも係る。本明細書中異種のＤＮＡ配列と
は、βファージのゲノムとハイブリッドを形成し得ない
配列、より特定的にはβファージとは異なる微生物の遺
伝的継承物（すなわち遺伝子）に属するＤＮＡ配列を意
味するものと理解されたい。
更に特定的には、この異種ＤＮＡ配列は所定の微生物を
形質転換すべく適応させたベクターのＤＮＡに相当する
。
本発明の好ましいハイブリッドＤＮＡの特徴は、所与の
微生物を形質転換すべく適応させたベクターから成って
おり、前記所与の微生物が認識し得るプロモーターを含
んでいることである０、このベクターは、前記基底配列
の上流部位中に前記プロモーターを挿入することによっ
て修飾されており、基底配列はプロモーターの制御下に
ある。このプロぞ一ターは上記に定義した混合配列のも
のであり得、ジフテリア毒素遺伝子に由来していない異
なるプロモーターでもあり得る。
このベクターは、プラスミドタイプのものか好ましく、
Ｅ、　ｃｏｚｉ菌株またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ菌株を形質転換すべく適応させたものから選択する
のが有利である。
上記プロモーターは形質転換すべき微生物の細胞機関が
認識するものの中から選択し得る。例えば形質転換すべ
き微生物がＥ　、　ｃｏｚｉの場合にはラクトースオペ
ロンのプロモーターである。また、前記基底配列がその
制御下で転写されかつＣｏｒｙｎｅ−ｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ中で発現されるプロモーターが有利である。これには
特に関与するハイブリッドＤＮＡまたはベクターが上述
の如き混合配列を含有する場合かある。
このようなベクターは、特にこれを次いで同様に前記プ
ロモーターの制御下に置かれている付加的なインサート
で修飾する場合に重要であり、この付加インサートは転
写および／または特にこのベクターで形質転換し得る微
生物中で発現させたい所定のタンパク質に翻訳し得る。
以下余白 上述の基底配列または混合配列は、全てのタイプのはフ
タ−、特にＥ、ｃｏｌｔを形質転換し得ることが知られ
ているプラスミド９中に有利に導入される。
上記に定義したインサートで修飾されたばフタ−の特に
興味のある１つのカテゴリーは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　自体を形質転換すべく適応させたものであ
る。このようなはフタ−の例としては、Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ種に属する微生物を形質転換し得る能
力が、ヨーロッパ特許出願第００６４６８０号、第００
７３０６２号、第００７３０６３号および第００７３０
６４号に報告されているプラスミド９またはファージＤ
ＮＡがある。発現したホリハプチト９は、これることが
できる。
また、このタイプの好ましいＤＮＡハイプリッｒまたは
ばフタ−は、そのインサートがジフテリア毒素またはジ
フテリアアナトキシンのＡ鎖もしくはＢ鎖または同時に
双方の全体または一部をコート９しているヌクレオチド
９を上記に定義した如き配列（場合により基底または混
合配列）と組み合わせてか２前記基底配列と位相を合わ
せて含有するものである。このような場合には、前記の
如きベクターで形質転換し得る微生物は、−一方ではジ
フテリア毒素に共通の！１個または２個のはプチト９配
列を有しかつ合成を目指す特定のタン、ｏり質の少なく
とも一部に相当するにプチド配列を有するハイブリッド
タンパク質を合成し得る。以後時にタンノ々り質［ｔＯ
ｘ−ＸＪと相称することがあるが、「ｔｏｘＪは毒素（
トキシン）ζこ相当し、「Ｘ」は上記特定のタン・９り
質に対応する。
、　本発明の他の好ましい（フタ−には、［ｔｏｘＪ遺
伝子を担持しておりかつＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍＬ即ｙｕｒｉａｅ　中でのｌ蒸化またはファージＤＮ
Ａの細菌ゲノム中への挿入のレベルで本質的な役割を果
たすと思われるウィルスの付着部位をコードしている配
列を、上記基底もしくは混合配列のすぐ上流かまたはＡ
鎖もしくはＢ鎖または同時・１つ双方の全部または一部
をコードしているヌクレオチド鎖の上流に有するものか
ある。本発明の特に好ましいはフタ−は次の配列を含有
する。
ＧＡＡＡＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡＴＡＧＣＡＴＧＴＴＴＧ
ＡＧＣＴＧＧＧＧＴＴＴＣまた、特にジフテリア毒素の
Ａ鎖および／またはＢ鎖をコードしているヌクレオチＰ
配列の　゛主要部を欠失している場合でも、Ｂ鎖の親水
性末端部をコーＰしている配列、特に添付図面の１６１
５番目にあるＫｐｎＩ部位より下流の配列を保有してい
るのが有利で奸才しい。
これらのはフタ−は、特にｐ虹Ｌｖす±Ｉ工聾匹。
より特定的にはファージβに対して情態性であるがこの
ファージによって溶原化はされていないＣｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅを形質転換す
べく適応させる場合に重要である。
このように本発明の好ましいばフタ−で形質転換した微
生物は、上記ハイブリット９タンノぐり質を合成し得か
つその培地中に分泌し得、次にこのタンノ々り質を培地
から単離し得る。このようなハイブリット９タンパク質
は、特にこのハイブリッドタン、Ｊり質がＣｏｒｙｎｓ
ｂａｃｔｒｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ　の培養の
場合主としてジフテリア簿素が分泌されるようｔこ、実
際上培地中に分泌される唯一のタンパク質であると、非
常に重要であり得る。このようなハイブリッドタンパク
質は、本質的な利点を有し得る。すなわち、このタンパ
ク質は、その合成が目されている付加タンパク質ｒＸＪ
の特性である本質的な抗原決定基または部位を含有する
ポリハプチｌξ配列とジフテリアアナトキシンの配列と
を同時に含んでおり、前記ポリベゾチｒ配列は、このハ
イブリッジタンパク質がこれを宿主に投与または補強し
、それによって上記付加タンノぞり質ｒＸＪに対して活
性な抗体の産生を誘発した宿主中で発現し得る免疫原性
を有するように適応させた支持体または「担体（ｃａｒ
ｒｉｅｒ　）Ｊとしての役割を果たすのに充分なサイズ
を有している。
本発明が係る特に好ましい分野は、ワクチン接種、特に
前記付加タンパク質が、病原微生物、特にウィルスまた
は毒素に対するワクチン化タンノぞり質の特性である抗
原決定基または部位を担持する場合である。
とのタンノ２り質がジフテリア毒素と共に有するボＩＪ
　ｏプチト９配列が、自然発生の非病原性ジフテリア毒
素の配列に相当していると好ましい。
必要であれば、ジフテリア毒素の無毒化で通常使用され
る非動化法？こよってハイブリッドタン／Ｚり質を無拷
化することができる。
本発明は本質的にかつより特定的には上記に定義した如
きはフタ−またはハイ、ソリッドＤＮＡで形質転換した
微生物、特にそのように形質転換されたＥ、ｃａｌｌ　
およびＣａｒ　ｎｅｂａａｔｅｒｉａｅに係る。好まし
い態様で本発明は、βファージに対して情態性であるが
天然βファージによって溶原化されていないＣｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ　ｌこ係り
、これらのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｌｕｍｄｉｐｈｔ
ｅｒｉａｅは上述のタイプのハイブリッドＤＮＡまたは
はフタ−によって形質転換しである。
また本発明は、下記式のペプチドＳにも係る。
ＭＥＴ　ＳＥＲＡＲＧ　ＬＹＳ　ＬＥＵ　ＰＨＦ２　Ａ
ＬＡ　８ＥＲＩＬＥ０ ＬＥＵ　ＩＩＪ　ＧＬＹ　ＡＬＡ　ＬＥＵ　ＬＥＵ　Ｇ
ＬＹ　ＩＩＪ　ＧＬＹＡＬＡ　ＰＲＯＰＲＯＳＥＲＡＬ
Ａ　ＨＩＳ　ＡＬＡ本発明のばフタ−系を前記に定義の
如きクンノぐり質またはハイブリッドポリはプチト９を
産生するためにＣ’ｏｒｙｎｅｂａｅｔ＠ｒｆｕｍ　ｃ
Ｎｐｈｔｅｒｌａｅで使用すると特に有利である。特１
と、これらの修飾はフタ−中ｌこ存在する配列Ｓによ゛
つて、ごれらのハイブリッド分子が細菌壁を通過し樽１
ｔ１ずであり、その結果タンパク質の精製作業中の細菌
性の可能な汚染が回ｆｉｂ得、タンノ６り質は培地から
単離し得る。更に、これらの形質−転換した微生物によ
ると、産生物が細°胞質内に蓄積するために細菌を溶菌
す）／となｕ（’−ハイブリッドを連続的に産生し得る
。Ｃｂｒｙｎｅｂａｃｔｊｒｉｕｍ月」工賎ユ上り・を
タンノぞり質、特にワクチン成分産生用の微生物として
使用すると、特に有利になるはずである。この微生物の
毒性および細胞学的効果が充分に判明しているだけに特
に有利である。　“ 本発明の他の特徴は以下の記載から明らかＹツなるであ
ろう。以下の記載では、本発明のＤＮＡの特徴部分の同
定条件および本発明のはクターのＤＮＡ配列を使用して
ハイブリッドタンノぞり質産生のために微生物を形質転
換する条件を説明する。以下では唯一の添付図面を参照
して説明する。この図面は一方でジフテリアプロトキシ
ンに対応するヌクレオチド配列とこの配列の転写調節に
必要な要素とを、他方では関連する合ね巻）を示す。
以下余白 （１）対応するジフテリアプロトキシンすなわち対Ｃ７
β２２８の培養物をＵＶおよびＮＧで処理してファージ
β２２８を誘発した。
透明領域に現われるファージβｃ２２８から予じめ単離
したゲノムを制限酵素シψＨＩで処理する。得られた断
片をアガロースゲル電気泳動で分離し、その一部をセル
ロ一段フィルター上に移した。メツセンジャーＲＮＡに
相補的でジフテリア毒素に相当する放射活性ＤＮＡとの
１ｎｓｉｔｕバイブリプ−ジョンテストによって、この
プローブとハイブリット９を形成する３、９ｋｂのＢａ
ｍＨＩ断片の検出が可能であった。
このプローブ自体はＴＡＹＬＯＲ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、４，４２　、３２４−３３
０（１９７６）に記載の技術によって調製した。
次いで、ゲルが含有している残りの対応ＢａｍＨ１断片
を透析バッグ中で電気溶出によってゲルから抽出し、濃
縮精製した。
３．９ｋｂのＢ　、ａ　ｍ　ＨＩ断片と、制限酵素用Ｈ
１で予じめ直線化したプラスミｒｐＢＲ３２２とをファ
ージＴ４のＤＮＡ−リガーゼで処理した。連結した断片
の混合物を用いてＬＢ培地中でＥ、ｃｏｌｉ　の形質転
換し得る菌株、例えばＥ、ｃｏｌｔ　Ｋ１２ＭＭ２９４
を形質転換した。
アンピリン耐性でテトラサイクリン感受性の細菌のコロ
ニーを選択した。このようにして修飾したプラスミドを
単離し、ｐＴＤ、４４およびｐＴＤ７６と命名した。こ
れらのプラスミド９はｐＢＲ３−２２のＢ　ａ　ｍ、Ｈ
Ｉ部位に夫々逆向きで挿入された３、９ｋｂ断片を含有
していた。
次に、これらのプラスミド９を担う細菌をアンピシリン
含有培地中で、この培養物が波長６００ｎｍの放射線を
吸収する程度で測定し得るしはルが０．８　（Ａ６ｏｏ
＝　０．８　）になるまで培養した。
細菌をその培地から分離し、洗浄し、リゾチームで処理
した後菌体壁破砕処理に付した。ジフテリア抗毒素ウサ
ギ抗血清を用いるＥＬＩＳＡ法による免疫沈降テストに
よって、これらの菌体の溶解物中のジフテリアプロトキ
シン（ＣＲＭ２２８）に相当するタンノＺり質の存在を
検出した。合成された毒素の量は培養物１ｍＡ’当たり
５０〜１００　ｎｇのオーダーであった。形質転換して
いない細菌の溶解物に対して類似の条件で検討したとこ
ろ免疫沈降は観察されなかった。
既に観察されたように、受容体プラスミド中での３．９
ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片の配向に関わりなく全ての形質転
換体培養物中で毒素の産生が認められた。
ＵＶおよびＮＧで処理していないＣ７β２２８の培養物
中に自然発生した透明溶菌プレート（ｃｌｅａｒ　１ｙ
ｓ１ｓ　ｐｌａｔｅ　）　から単離したファージβｃ２
２８の自然発生変異体から得た類似の３．９ｋｂ　Ｂａ
ｍＨＩ断片インサートを含有するプラスミドｐＴＤ１３
４を用いても同様な結果がみられた。
（３）本発明のＤＮＡ断片部分の配列解析ｐＴＤ１３４
から再抽出した３、９ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片に対してヌ
クレオチド配列解析を実施した。２本鎖ＤＮＡの９５％
以上をＭＡＸＡＭ−ＧＩＬＢＥＲＴの技術によって解析
した（Ｍｅｔｈ。
Ｅｎｚｙｍ、、６５，４９９−５６０（１９８０）参照
）。同様に、プロモーターおよび配列Ｓを含有する領域
の配列解析をＦ、５ＡＮＧＥＲ等（Ｊ、Ｍｏｌ、旧ｏ１
．　、１４３　、１６１−１７８（１９８０）参照）の
方法によって実施した。
プラスミドｐＴＤ１３４も同様に解析した。
ＤＮＡの配列構造およびこのＤＮＡがコーＰしているポ
リペプチド９の配列構造を添付の図面に示す。ヌクレオ
チドの番号は翻訳される配列の最初のヌクレオチドから
つけである。コーｒ配列および非コード配列の双方でヌ
クレオチｒ１０個ごとに点で印をつけである。オープン
解読枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍ？）から
推定したアミノ酸配列をヌクレオチｒ配列の上に示す。
シよび終止コドンは長方形で囲っである。
このように表わされるＪ　ＩＪ　Ｏブチ）−”ＣＲＭ２
２８のアミノ酸配列は、既に知られている対応の野生型
毒素とはその公知部分の４ブチｒ構造の点でアミノ酸配
列が異なっており、異なるアミノ酸を円で囲って示した
。野生型毒素の対応するアミノ酸は本発明の特定のアミ
ノ酸のすぐ上に表示した。
毒素のＡ鎖およびＢ鎖のＣ−末端アミノ酸は、本発明で
研究したクローンの配列解析結果と、ジフテリア毒素の
構成に関して既に部分的に知られていた配列の解析結果
とを比較して推定した。Ａ鎖をコードしているヌクレオ
チド９配列の上流のオープン読み取り相（ｏｐｅｎ　ｒ
ｃａｄｌｎｇｐｈａｓｅ　）はヌクレオチｒ−２１で終
わっている（添付図面参照）。開始コト９ンＡＴＧが存
在しないこのオープン解読枠の中断から得られるＹ考え
られる結論は、読み取り相の上流末端に位置するコト９
ンＧＴＧのところで翻訳が開始するということである。
このことから、既に上記に示した式を有するシグナルは
プチト９の構造が得られた。このシグナルはプチドは既
に公知のシグナルはプチト９にみられる一定の数の要素
を含んでいることに注意されたい。特に、このはゾチト
９Ｓは第３番目と第４番目のアミノ酸としてアルギニル
残基とリシル残基を有する。そのＣ−末端はヒスチジル
残基とアラニル残基で形成されている。特にシグナルペ
プチドとフラグメントＡとの間の開基部位はアミノ酸ア
ラニルとグリシルのところであり、これも文献に記載さ
れている他のシグナル配列に関して既に知られている結
果と一致している。
はプチドＳをコーｒする領域に先行してＥ。
ａｏｌｉ　の遺伝子の上流で見い出されるものと類似す
る配列が存在する。すなわち： （：）翻訳される最初のコドンの９塩基々Ｃｂ　ｐ　）
前に位置する「Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ　Ｊ配列
Ａ　Ａ　Ｇ　Ｇ。
（ＩＩ）　Ｅ、ｃｏｉｌのプロモーターのコンセンサス
配列「−１０Ｊと全く同等な「ＴＡＴＡＡＴ」配列、 曲）これらの同じプロモーターのコンセンサス配列１’
−−３５Ｊ　（ＴＴＧＡＣＡ）に類似する配列［ＴＴＧ
ＡＴＴＪ、である。
領域ＴＡＴＡＡＴ（［Ｐｒｉｂｎｏｗ　ｂｏｘＪ）は、
毒素の発現の調節に伺らかの役割を果す９ｂｐの逆方向
反復塩基配列の一部を形成してる。
遺伝子の下流に位置するヌクレオチド配列中、転写終了
部位は７個のヌクレオチドから成る逆方向反復塩基配列
中に含まれると思われる。更に下流には他の２次構造が
可能である。すなわちこれは、９個のヌクレオチド９で
中断されている長さ１４ｂｐの逆方向反復塩基配列で構
成されるものである。この構造は、ｄｉｐｈｔｅｒｉａ
ｅの溶原化過程中にファージが取り込まれる付着部位す
なわちａｔｔ　Ｐであろう。この部位ａｔｔ　Ｐはファ
ージ入で示さ−３５− れるのと類似の構造を有している。
このようにして得られたジフテリアプロトキシンをコー
ドしているヌクレオチｒ配列の構造に関する知見を基に
−して、Ｅ、ｃｏｉｌ　中のコード配列を、本発明のプ
ラスミド９中のインサートの３．９ｋｂ　Ｂ上ｍ　Ｔ（
ｒ断片に属する転写と翻訳の調節および開始要素の制御
下で実際に発現させることが再確認し得たのである。
これは、プラスミｒｐＴＤ１３４中のクローン化ｔａｘ
　遺伝子から予じめ単離したシグナル配列の最初の８個
のコドンとプロモーターを含む３６０塩基対のＨａｓｌ
−Ｈａｅｌ断片をクローニングして示された。この断片
は、Ｄｖｉｔｒｏ　の組換えによって、その自身のプロ
モーターとβ−ガラクトシダーゼの最初の８個のアミノ
酸をコードしている配列とが欠失しているβ−ガラクト
シダーゼの遺伝子の前方に予じめ配置しておいた。
−３６− この構築は、シグナル配列とβ−ガラクトシダーゼをコ
ート９している配列との間の融合部位の読み取り相を考
慮するように行なった。
前記断片を、プラスミＦ”ｐｓＫｓ１０７のβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子の開始部に位置する唯一のＳｍａｒ部
位に挿入した。このプラスミＦはＣＡＳＡＤＡＢＡＮ等
（１９８０）によって記載されており、β−ガラクトシ
ダーゼをコードしている遺伝子を担持しているが前記欠
失部を欠いている。こうして得られたプラスミｒをラク
トースを指示するＭａｃＣηｎｋｅｙｄｉｓｈ上で選択
してｐ’ｊ”Ｇ１１３と命名した。
Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１００Ｏ，ｌａｃ　菌株をプラスミ
ｒｐＴＧ１１３で形質転換して得られたクローンは赤色
であり、β−ガラクトシー・′ダーゼ活性の存在を示し
ている。この活性はハイブリッドタンノぞり質「はプチ
ト９〜β−ガラクトシダーゼ」に基づくものである。こ
れば０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシ白こ対す
る１ｎｖｉｔｒｏ　酵素反応で決定した。得られた結果
によると、ｐＴＧ１１３クローンはＥ、　ａｏｌｌの野
生株で検出される活性の約２０〜２５％に和尚する活性
を有していた。
これらの結果が示していることは、プラスミｒｐ　’ｒ
Ｉ）　１３４中でクローン化したジフテリア毒素のプロ
モーターがＥ、ｃｏｌｌ　中でのこの遺伝子の発現を制
御していることである。プラスミドｐＴＧ１↓３中のこ
の同じプロモーターによってハイブリッＦタンパク質「
ベプチｒｓ−ｔｏｘ　−β−ガラクトシダーゼ」のＥ、
ｃｏ目での良好なしはルの発現が可能になる。
上記の系でβ−ガラクトシダーゼをコート９している遺
伝子をあるポリ　ｏプチト９をコードしているＤＮＡ配
列で置き換えると、同様な条件下で特定のタンパク質と
共にこのはゾチドを含むハイゾリットリンノぞり質を産
生ずることが可能である。次いで、このハイブリッドは
ブチＶはＥ、ｃｏｌｉ　の壁を破砕した後にｙユｃａｌ
ｆ　から回収し得る。
上述のように、本発明の好−ましい修飾ばフタ−は、ジ
フテリア毒素（またはアナトキシン）のＡ鎖およびＢ鎖
をコードしている配列の全部または一部を含んでいるの
が好ましい。勿論、これらのヌクレオチド９配列のかな
りの部分を欠失させることもできる。しかし、一般には
、上記に示した理由によってその大部分を保有している
のが好ましい。
以下に、ハイブリット９タンパク質「ｔｏｘ−ＨＢｓ　
断片」をコードシている組換遺伝子のａｌｌについて記
載する。
ｐＴＩ）１３４の遺伝子ｔｏｘ２２８中にＨＢａ抗原の
一部をコート９しているＤＮＡ断片を挿入するために、
制限酵素ＫｐｎＩ（１６１５位）が認識するヌクレオチ
ド９部位を選択した。このＨＢｓ抗原のＢ型肝炎ウィル
スに対する免疫原性は公知である。
この１３０個のヌクレオチＶから成る長所片（ＨＢｓ　
２）は、ＤＮＡ−ＨＢＶのＥｃｏＲＩ部位の位置０に対
して４８８番目と６１８番目のヌクレオチドの位置で制
限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｔＮＩによってＨＢ　Ｖの
遺伝子Ｓを消化して得られた。
この断片をエキソヌクレアーゼで処理して遊離の末端を
形成した。こうして得られた断片末端に、Ｔ４ファージ
の連結酵素の存在下で、化学合成によって得られた２個
のオリコヌクレオチＰ（この−欠配列はＫｐｎＩによっ
て認識されるようにしておいた）を連結した。こうして
修飾した断片にＫｐｎを作用させて接着末端ＫｐｎＩを
再形成した。最後に得られた断片と、制限酵素Ｋｐｎで
予じめ直線化しておいたプラスミドｐＴＤ１３４とをＴ
４ファージのＤＮＡ−ＩＪガーゼで処理した。生成した
プラスミド（ｐＴＨｌ）は融合遺伝子ｔｏｘ２２８−Ｈ
Ｂｓ２を含有しており、これを用いてＥ、ｃｏｌｔを形
質転換した。その後、Ｅ、ｃｏｌｔ　の溶解物から得ら
れる生成したハイブリッドタンパク質の免疫学的性質の
しはルを、ＥＬＩＳＡテストにおける抗ジフテリア血清
および抗ＨＢｓ血清成されたハイブリット９タンパク質
の可能な使用を意図して来た。しかし明らかに本発明は
このタイプの使用に限られるものではない。特に、本発
明は、１組換配列５Ａ−Ｙ（式中、ＳおよびＡは上記の
意味を有し、Ｙは％ｌこ腫瘍細胞由来の特異的膜受容体
が認識するポリはゾチドをコードしている）を含有する
インサートで修飾したばフタ−の使用にも係る。例えば
、このはプチドは工、阻　ＴＲ０ＷＢＲＩＤＧＥ等（Ｎ
ａｔｕｒｅ。
２９４．１７１−１７３（１９８１）参照）こと記載の
ベプチＦのうちの１つに対応する。より一般的な場合Ｙ
は、例えばり、Ｌ、　Ｓ　Ｉ　ＭＰ　Ｓ　ＯＮ等（Ｃ’
ａｌｌ、２９，４６９−４７３（１９７２）参照）が記
載した条件下で、種々のタイプの細胞に対するジフテリ
ア毒素Ａ鎖の挙動の研究に使用し得る他のいずれのポＩ
Ｊ−＜プチドでよい。
以上のことから既にわかるようにかつ自明であるように
、本発明は、より特定的に意図して記載した上記の具体
例および使用に限定されるものではなく、逆にその修正
変更全てを包含するものである。特に本発明は、上記に
より特定的に記載した配列およびハイブリット９とは異
なるヌクレオチド９配列またはＤＮＡノＡイプリツＰの
いずれにも係るものであり、これらのヌクレオチド配列
またはＤＮＡハイブリッドの異なる点は付加的ＤＮＡ断
片の欠失もしくは付加またはコドンの置換であるが、但
し、これらの欠失、付加または修飾によって得られるポ
ＩＪ　Ｓプチドは実質的に同一の特性を保持している。
これらの結果書られるＤＮＡは、当然に、本明細書中特
許請求の範囲に規定する本発明の保護範囲内に入る均等
物と考えるべきである。
このことは特にシグナル４ゾチげに対して当てはまる。
すなわち、シグナルはプチドからいくつかのアミノ酸を
除去することが可能でありまたは他のアミノ酸で置換す
ることができる。
但し、このような除去または修正をしても、バッチｒｓ
の特性は実質的に変化せず、特にこのような修飾にプチ
ト９Ｓをコーｒしている結合したヌクレオチドＤＮＡ配
列がコーｒしているタン、ｏりの分泌を促進する能力に
関しては変化させてはならない。
配列ＳがＣｏｒｙｎｅｂａｅｔｓｒｉｕｍ　ｄ１ｐｈ＄
ｅｒｉａｅに認識され得る他のプロモーターと結合して
いるＤＮＡ配列も本発明の範囲内に包含される。
以上では特にジフテリア毒素の遺伝子またはその断片に
関して詳細に説明して来た。云うまでもなく、同一のボ
ＩＪ　、、？プチドをコードしているまたは類似の特性
を有するＤＮＡまたはＤＮＡ断片の他の任意の形態も均
等物として本発明の範囲内に入ると考えられたい。この
ような均等物として例示すると、ジフテリアプロトキシ
ンに対応するメツセンジャーＲＮＡを酵素的に複製して
得られるｅＤＮＡ配列がある。次いで、このｃＤＮＡを
、別のＤＮＡ配列中に含まれるプロモーターの制御下に
なるように配置し得る。
この際に当業者には周知の遺伝子組換技術を使用する。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ’＋ｕｍ　ｄ１ｐｈｔｅｒｉ
ａｅＣ７β２２８株は、１９８３年７月２８日付で、Ｐ
ａ５ｔｃｕｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｐａｒｉｓ
。
フランス、の「Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａ
ｌｓｄｅｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｄｏ　Ｍｉｃｒｏ−ｏｒ
ｇａｎｉｓｍｓＪ（ＣＮＣＭ）に寄託した（受託番号ｌ
−２３６）。
全ての刊行物、特に特許および特許出願、更に適切なら
ば対応の米国特許または米国特許出願を引用によって本
明細書中に包含するものとする。
Ａ　いも４醗ヰち悦Ｑ０ 外付Ａ　（Ｕ　ｈ　＋８、ンクプシＴプＱトキンン乞つ
−１〜し乙ｉ＋ｍ夕２しオサト翫タ１Ｌ−ｉ弓転宇懺怖
ＩＺ処事勾乎珠に作ジタク乙オカーＬ″＆汐υ函ろ尤９
、　島吟”ｎｆ−ｉ　＜−ｇ　？ミ　）遇疲頂乞りυ寵
イ寸 代理人弁理士今　村　元 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号０発明者
　ビニール・チオレ　フランス国、ル、１６ ［相］発明者　ニコル・シャンシネ　フランス国、■発
明者　ロルフ拳つ・ストレー　フランス国、ク　ビス ０発　明　者　パト　リス　・ボケ　フランス国、ジョ
ルゲ、１ ＠出　願　人　アンステイテユ・パス　フランス国、ト
ウール　ドツトウール ０出　願　人　アンステイテユ・ナシ　フランス国、オ
ナル・ドウ・う・サ　トルビアツク。
ンテ・工・ドウ・う・ ルシエルシュ・メディ カル ７Ｑ ７５０１３・パリ、リス・ドウ・う・ブラシニー７５０
０４・パリ、ケ・プルボン、１１７５１１６・パリ、ア
ヴニュ・フォラシュ、１７・丼０００・クレテイユ、リ
ス・ドユ・ピュイ・７５７２４・パリ、セデクス・１諷
　リス・ドユ・・ルー、２５−２８ ７５６４５・パリ命セデクス・１３・リス・ドウ・１０
１ 手続ネ市正書（方式） 昭和６０年５月２７日 ２、発明の名称　ジフテリア毒素のシグナルペプチドを
コードするヌクレオチド配列、このヌクレオチド配列を
含有するベクター、これらによる微生物の形質転換およ
びこうして得られるペプチド組成物 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　グループマン・ドウ・ジエニ・ジエネテイツク
（ジエー・　３）−， ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象　出願人の代表者を記載した適正な願書
、明細ａ１、図面及び委任状・法人格証明書 ８、補正の内容 （１）出願人の代表者を記載した適正な願書を別紙の通
り補充する。
（２）明細書中、タイプ印書にＪ：り鮮明に浄書した第
４５頁を別紙の通り補充する。（内容に変更なし） （３）部平を用いて鮮明に描いた適正な図面を別紙の通
り補充する。（内容に変更なし）（４）グループマン・
ドウ・ジエニ・ジエネテイツク（ジエー・　３）の委任
状・法人格証明書及び同訳文を別紙の通り補充する。
（５）アンステイテユ・パストウール及びアンステイテ
ユ・ナシオナル・ドウ・う・ザンテ・工・ドウ・う・ル
シエルシュ・メディカルの委任状及び同訳文を別紙の通
り補充する。
２− （ＣＮＣＭ　）に寄託した（受託番号Ｉ　−２３６）。
全ての刊行物、特に特許および特許出願、更に適切なら
ば対応の米国特許または米国特許出願を引用によって本
明細書中に包含するものとする。
【図面の簡単な説明】
４、竿・２・１°゛１カ“・ハ１、ジフテリアプロトキ
シンをコードしているヌクレオチド配列とその転写調節
に必要な要素を示すヌクレオチド配列図であり、同時に
対応するアミノ酸配列を示す。 代Ｃ人弁遅上　今　村　元 ＧＬＮ　ＬＹＳ　ＧＬＹ　ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＬＹＳ　Ｐ
ＲＯＬＹＳＣＡＡ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＡＴＡ　ＣＡＡ　
ＡＡＧ　ＣＣＡ　ＡＡＡ・　・　・ ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＴＲＦ’　Ｌ’ｌ’Ｓ　ＧＬ
Ｙ　ＰＨＥ　１’ＹＲＧＡＣＧＡＴ　ＧＡＴ　ＴＧＧ　
ＡＡＡ　ＧＧＧ　ＴＴＴ　ＴＡＴ・　・　・ ０ ＡＬＡ　Ａｌ−Ａ　ＧＬＹ　ＴＹＲＳＥＲｖＡＬ　ＡＳ
Ｐ　ＡＳＮＬＥＬＩ　ＡＬＡ　ＬＥＵ　ＬＹＳ　ＶＡＬ
　ＡＳＰ　ＡＳＮ　ＡＬＡＧＬＹＬＥＵ　ＳＥＲＬＥＵ
　ＴｔｌＲＧＬＵ　ＰＲＯＬＥＵＳＥＲＬＥＵ　ＰＲＯ
ＰＨＥ　ＡＬＡ　ＧＬＵ　ＧＬＹ　５ＥＲＡＧＣＣＴＴ
　ＣＣＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧ　ＧＣ；Ｇ　ＡＧＴ・　・
５００ ＳＦ’、ＲＧＬＹ　’ＩＨＲＧＬＮ　ＧＬＹ　ＡＳＮ　
ＴＹＲ５ｌ：ＲＴＨＲＡＳＰ　ＡＳＮ　］、ＹＳ　ＴＹ
ＲＡＳＰｌｌｌ） ＴＹＲＰＲＯＧＬＹ　ＬＥＵ　ｒＨＲＬＹＳ　ｖＡ’Ｌ
ＧＬＵ　ＴＨＲＩＬＥ　ＬＹＳ　ＬＹＳ−ＧＬＩＪ、Ｌ
ＥＵＭＥＴ　ＧＬＬＪ　ＧＬＮ　ＶＡＬ　ＧＬＹ　ＴＨ
ＲＧＬ’ＵＧＬＹ　ＡＬＡ　ＳＥＲＡＲＧ　ＶＡＬ　Ｖ
ＡＬ　ＬＥＵ１８０ ＡＳＮ　ＴＲＰ　ＧＬＵ　ＧＬ、Ｎ　ＡＬＡ　ＬＹＳ　
ＡＬＡ　ＩＥｔｌＰＨＥ　ＧＬ［Ｊ　ＴＨＲＡＲＧ　Ｇ
ＬＹ　ＬＹＳ　ＡＲＧＧＬＹ１０ ＭＥＴ　ＡＬＡ　ＧＬＮ　ＡＬＡ　ＣＹＳ　ＡＬＡ　Ｇ
ＬＹ　ＡＳＮＡＴＧ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＧＣ；ＣＴＧＴ
　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ＡＡＴ・　・　・ ＡＡＡ　ＡＣＴ　ＡＡＧ　ＡＣＡ　ＡＡｃ　ＡＴＡ　Ｇ
ＡＧ　ＴＣＴ・ ・　・ ＬＹＳ　ＡＳＮ　ＬＹＳ　ＭＥＴ　ＳＥＲＧＬＵ　ＳＥ
ＲＰＲＯＡＡＡ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＡＴＣＡＧＣＧＡＡ
　ＡＧＴ　ＣＣＣ・　・ ）［Ｉｓ　ＰＲＯＧＬＵ　ＬＥＵ　ＳＥＲＧＬＵ　ＬＥ
Ｕ　ＬＹＳＣＡＴ　ＣＣＴ　ＣＡＡ　ＴＴＧ　ＴＣＡ　
ＧＡＡ　ＣＴＴ　ＡＡＡ・　・ ＧＩＪＪ　ＡＳＰ　ＡＬＡ　ＭＥＴ　ＴＹＲＧＩＵ　１
’ＹＲ６０ ＡＳｔｌ　ＬＹＳ　ＴＨＲＶＡＬ　ＳＥＲＧＬＵ　ＧＬ
Ｕ９０ ＴＨＲＶＡＬ　ＴＨＲＧＬＹ　ＴｌシＲＡＳＮ　Ｉ）Ｒ
０ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＴＹＲＡＬＡ　ＶＡＬ　ＳＥＲＴＲ
ＰＡＲＧ　ＴＨＲＧＬＹ　ＰＨＥ　ＧＬＮ　ＧＬＹ　Ｇ
ＬＵＩＬＥ　ＰＲＯＧＬＹ　ＬＹＳ　ＬＥＤ　ＡＳＰ　
ＶＡＬＡＳＰ　ＶＡＬ　ＴＨＲＰＨＥ　ＣＹＳ　ＡＲＧ
　ＰＲＯＧＬＹ　ＶＡＬ　ＨＴ５　ＡＬＡ　ＡＳＮ　Ｌ
ＥＵ　Ｈｌ５ＧＬｔＪ　ＬＹＳ　ＩＬＥ　ＨＩＳ　ＳＥ
ＲＡＳＮ　ＧＬＬＩＧＡＧ　ＡＡＡ　ＡＴＴ　ＣＡｘ　
ＴＣＴ　ＡＡＣＧＡＡ。 ・　・ ＡＡＣＡＣ丁　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＴＣＧ’　Ａ
ＴＡ　Ａ’ｌＣ・　・　・ ＭＥＴ　ＡＲＧ　ＣＹＳ　ＩＧ　ＡＬＡ　ＩＬＥ　ＡＳ
Ｐ　ＧＬＹＡＴＧ　ＣＧＴ　ＴＧＣＡＧＡ　ＧＣＴ　Ａ
ＴＡ　ＧＡＧ　ＧＧＴ・　・　・ ＧＴＧ　（ＪＣＡ　ＴＴＴ　ＣＡＣＡＧＡ　ＡＧＣＡＧ
Ｃ丁ＣＧ・　・ ・

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）７５〜１０００個のヌクレオチド対を含有し、次
    のペプチド配列： 邸Ｔ　ＳＥＲＡＲＧ　ＬＹＳ　ＬＥＵ　ＰＨＥ　ＡＬＡ
    　ＳＥＲＩＬＥＬＥＵ　ＩＬＥ　ＧＬＹ　ＡＬＡ　ＬＥ
    Ｕ　ＬＥＵ　ＧＬＹ　ＩＬＥ　ＧＬＹＡＬＡ　ＰＲＯＰ
    ＲＯＳＥＲＡＬＡ　ＨＩＳ　ＡＬＡをコードしているヌ
    クレオチドから成る基底配列を含むＤＮＡ断片。
  2. （２）次のヌクレオチド基底配列： ＧＴＧ　ＡＧＣＡＧＡ　＋ＡＡ　ＣＴＧ　ＴＴＴ　Ｇｌ
    ；Ｇ　ＴＣＡ　ＡＴＣＴＴ４　ＡＴＡ　ＧＧＧ　ＧＣＧ
    　ＱＴＡ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　Ａ’Ｊ’Ａ　ＧＧＧＧＣＣ
    ＣＣ番ＣＣＴ　ＴＣＡ　ＧＣＣＱＡＴ　ＧＣＡを含有す
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のＤＮ
    Ａ断片。
  3. （３）前記基底配列とプロモーターを含む第２配列とか
    らなる混合配列を含有しており、前記第２配列が解読方
    向に関して前記基底配列の上流に位置しており、前記基
    底配列が前記プロモーターの制御下にあることを特徴と
    する特許請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ断片。
  4. （４）第２配列が次のヌクレオチド配列：ＴＴＧＡ　Ｔ
    ＴＴＣＡＧＡＧＣＡ　ＣＣＣＴＴＡＴＡＡＴ　ＴＡＧＧ
    ＡＴＡＧＣＴ−一−−・　・　−ｂ ＴＴＡＣＣＴＡＡＴＴ　ＡＴＴＴＴＡＴＧＡＧ　ＴＣＣ
    ＴＧＧＴＡＡＧを含有することを特徴とする特許請求の
    範囲第３項に記載のＤＮＡ断片。
  5. （５）次の配列： ＣＣＣＴＴＡＴＡＡＴ　ＴＡＧＧＡＴＡＧＣＴ　ＴＴＡ
    ＣＣＴＡＡＴＴ−５０ ＡＴＴＴＴＡＴＧＡＧ　ＴＣＣＴＧＧＴＡＡＧ　ＧＧＧ
    ＡＴＡＣＧＴＴＧＴＧ　ＡＧＣＡＧＡ　ＡＡＡ　ＣＴＧ
    　ＴＴＴ　ＧＣＧ　ＴＣＡ　ＡＴＣＴＴＡ　ＡＴＡ　Ｇ
    ＧＧ　ＧＣＧ　ＣＴＡ　ＣＴＧ　ＧＧ（７Ａ’！’Ａ　
    ＧＧＧＧＣＣＣＣＡ　ＣＣＴ　ＴＣＡ　ＧＣＣＣＡＴ　
    ＧＣＡを含有することを４ｆ−徴とする特許請求の範囲
    第４項に記載のＤＮＡ断片。
  6. （６）ファージβのＤＮＡに対して異種のＤＮＡ配列と
    共に特許請求の範囲第１項に記載の断片を含有するＤＮ
    Ａハイブリッド。
  7. （７）ファージβのＤＮＡに対して異種のＤＮＡ配列と
    共に特許請求の範囲第３項記載の断片を含有するＤＮＡ
    ハイブリッド。
  8. （８）特許請求の範囲第３項に記載の断片を含有するＤ
    ＮＡハイブリッドであって、所与の微生物の形質転換に
    適したベクターから成っており、前記所与の微生物か認
    識するプロモーターを含んでおり、前記ベクターは前記
    基底配莢倫位でＤＮＡインサートによって修飾されてお
    り、前記ＤＮＡインサートは前記プロモーターの制御下
    にある前記ＤＮＡハイブリッド。
  9. （９）太陽菌（Ｅ　、　ｃｏｚｊ工）またはコリネバク
    テリウム（、Ｃ＋ダヱと皆３す±エバ叩よ）の形質転換
    に適しｔ、：、ベクター７５）　ラ成っており、次のヌ
    クレオチｌ’配列：′ＴＴＧＡ　；ｐＴＴｃＡｃ；Ａａ
    ｃＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＴＴＡＧＧＡＴＡＧＣＴ　’ｒ
    ＴＡＣＣＴＡＡＴＴ会ＴＴＴＴＡＴＧＡＧ５０ ＴＣＣＴＧＧＴＡＡＣＧＧＧＡＴＡＣＧＴＴ１ を含む第２配列を含んでいるとさを特徴とする特許請求
    の範囲第６項に記載のハイブリッドＤＮＡ。 ００　太陽菌（Ｅ　、　ｃｏｔｉ）またはコリネバクテ
    リウム（立Ｍロユ嬰ジ叶ちり）の形質転換に適したベク
    ターから成っており、次のヌクレオチド配列： ＴＧＡＴＣＴＧＡＧＡ　９Ｃ（ｉＡＴＴＡＡＡＡ泰ＣＴ
    ＣＡＴＴＧＡＧＴＴＡ　ＡＴＡ　ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＣＴ
    Ａ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＡＴＡ　ＧＧＧＧＣＣＣＣＡ　Ｃ
    ＣＴ　ＴＣＡ　ＧＣＣＣＡＴ　ＧＣＡを含む第２配列を
    含んでいることを特徴とする特許請求の範囲第６項に記
    載のハイブリッドＤＮＡ。 αυ　更に、前記基底配列の下流でこれと位相を合わせ
    て、ファージβＤＮＡに対して異種のインサートを含有
    することを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載のハ
    イブリッドＤＮＡ０ａ２　前、記基底配列と位相を合わ
    せてヌクレオチド部をコードしていることを特徴とする
    特許請求の範囲第８項に記載のハイブリッドＤＮＡ０α
    ３）前記基底配列と位相を合わせてヌクレオナト部をコ
    ードしていることを特徴とする特許請求の範囲第１０項
    に記載のハイブリッドＤＮＡ０α荀　所定の異種タンパ
    ク質をコードしているインサートを含有し、前記インサ
    ートは前記ヌクレｐ オチド鎖中に挿入されており前記基底配列と位相が合っ
    ていることを特徴とする特許請求の範囲第１１項に記載
    のハイブリッドＤＮＡ０（１５）　特許請求の範囲第１
    項に記載のＤＮＡ断片を含有するベクターで形質転換さ
    れた微生物。 （Ｉ６）太陽菌（Ｅ　、　ｃｏｚｉ）に由来することを
    特徴とする特許請求の範囲第１５項に記載の微生物。 αη　ファージβに対して溶原化であるが前記ファージ
    によって溶原化されてはいないコリネバクテリウム（（
    ：ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）に由来することを
    特徴とする特許請求の範囲第１５項に記載の微生物。 Ｃ８）所定のペプチド配列からなるタンパク質の取得方
    法であって、ＤＮＡ断片によって形質転換し得る微生物
    を、前記ＤＮＡ断片を含有しかつ前記所定のペプチド配
    列をコードしているインサートで修飾されているベクタ
    ーで形質転換し、前記微生物を培養し、前記タンパク質
    を回収することからなる前記方法。 Ｃ１形質転換し得る微生物が、βファージに溶原化であ
    るがこのファージによって溶原化されてはいないコリネ
    バクテリウム　ジフテリアエ微生物の培地から前記タン
    パクを回収することを含むことを特徴とする特許請求の
    範囲第１８項に記載の方法。 （２１式： ％式％
JP59158534A 1983-07-29 1984-07-27 ジフテリア毒素のシグナルペプチドをコ−ドするヌクレオチド配列、このヌクレオチド配列を含有するベクタ−、これらによる微生物の形質転換およびこうして得られるペプチド組成物 Pending JPS60227681A (ja)

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JP2019512233A (ja) * 2016-03-10 2019-05-16 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー 凝集体を含まない単量体のジフテリア毒素融合タンパク質の生成方法及び治療的使用法
US11203626B2 (en) 2016-03-10 2021-12-21 The Johns Hopkins University Methods of producing aggregate-free monomeric diphtheria toxin fusion proteins and therapeutic uses
US11965009B2 (en) 2016-03-10 2024-04-23 The Johns Hopkins University Methods of producing aggregate-free monomeric diphtheria toxin fusion proteins and therapeutic uses

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4411994A (en) * 1978-06-08 1983-10-25 The President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
ATE25197T1 (de) * 1982-05-12 1987-02-15 Harvard College Hybridproteinekodierende fusionierte gene, sie enthaltende klonierungsvektoren und deren verwendung.

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019512233A (ja) * 2016-03-10 2019-05-16 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー 凝集体を含まない単量体のジフテリア毒素融合タンパク質の生成方法及び治療的使用法
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