JPS60227688A - アクリル酸エステル生産菌によるアクリル酸エステルの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野： 本発明はアクリル酸エステル生産菌を用いたアクリル酸
エステルの製造方法に関する。

従来茨専： エステル合成をエステラーゼの逆反応で行う研究は、古
くから行われている。その一つに、リパーゼを用いる反
応において、酸成分とアルコール成分を種々変えたとき
の研究報告がある（達成。

岩井、奥付ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ。

５７５　（１９７９）　ｐ、１５６−１６５）。そこで
は、酸成分として酢酸、プロピオン酸、酪酸をはじめス
テアリン酸、オレイン酸、リンゴ酸、コハク酸などが検
討され、アルコール成分としては１級アルコール。

１級ジオール、フェノール類、２級アルコール。

２級ジオール、３級アルコール、糖アルコールなどのあ
らゆるアルコール類が検討されている。そこに使用され
ているリパーゼ類は４種であり、それぞれの起源はＡｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ、　Ｒｈｉｚｏｐｕｓ
ｄｅｌｅｍａｒ＋　Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉ
ｄｕｍ、　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｙｃｌｏｐｉｕｍ
である。そのうちの前二者が特に低分子量の酸に対して
もエステル合成能を有することが示されている。しかし
、いずれにしろ、この研究には酸成分として、アクリル
酸が用いられていない。本発明者は上記報告に開示され
たリパーゼ（天野製薬側製および生化学工業■製）を用
いて検討したが、アクリル酸はいかなるアルコール類と
もエステル合成し得ないことを確認した。その他の従来
のエステル合成に関する報告においても酸成分にアクリ
ル酸を用いた反応は報告されていない。

アクリル酸とアルコールとのエステル合成により得られ
るアクリル酸エステルは、ビニル基を有するため９種々
の工業材料となり得る重合体を合成するための単量体と
して極めて有用である。例えば、このアクリル酸エステ
ルを他の単量体と共重合して得られる高分子は、粘着剤
、接着剤、およびフィルムなどとして用いられる。この
ようなアクリル酸エステルの合成は、化学合成により可
能ではある。しかし、化学合成によると１反応条件が過
酷であるため、そのための付帯設備とスペースと費用が
かさむ。しかも２作業環境が汚染されやすく環境公害の
原因にもなる。このエステル合成を微生物を用いた生物
学的反応により行うと。

低温・低圧という温和な条件下で反応できしかも基質特
異性を有するため、環境汚染のおそれがないうえに設備
費なども安くつく。

又皿■旦煎： 本発明の目的は、アクリル酸とアルコールとによりアク
リル酸エステルを生産する新規な微生物を用いた生物学
的反応によるアクリル酸エステルの製造方法を提供する
ことにある。本発明の他の目的は、生物学的反応により
安全かつ安価にアクリル酸エステルを製造する方法を提
供することにある。本発明のさらに他の目的は、アクリ
ル酸エステル生産菌を用いて、工業材料となり得る有用
な重合体を合成するための単量体としてのアクリル酸エ
ステルを製造する方法を提供することにある。

発明の要旨： 本発明のアクリル酸エステルの製造方法は、アルカリ土
類金属に属する菌により、アクリル酸と一般式ＲＯＨ（
ただし、Ｒは炭素数１〜８の直鎖のアルキル基）で表さ
れるアルコールとからアクリル酸エステルを生産するも
ので、そのことにより上記目的が達成される。アルカリ
土類金属菌はアルカリゲネス・フエーカリスであり、そ
のうちでも特に、アルカリゲネス・フエーカリスＴＩ（
８３６株およびアルカリゲネス・フェーカリスＴＫ４９
３５株のうちの少なくとも一方である。アルコールとし
ては炭素数１〜８の直鎖状アルコールであり。

それはメチルアルコール、エチルアルコール、プロピル
アルコール、ブチルアルコール、ペンチルアルコール、
ヘキシルアルコール、ヘプチルアルコールおよびオクチ
ルアルコールである。本発明により生産されるアクリル
酸エステルは原料として用いるアルコールにより規定さ
れ、上記各アルコールに対応して、アクリル酸メチル、
アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ブ
チル、アクリル酸ペンチル、アクリル酸ヘキシル。

アクリル酸ヘプチルおよびアクリル酸オクチルが生産さ
れる。

本発明のアクリル酸エステルの製造に用いられる微生物
は、化学工業原料を扱っている工場などの土壌（茨木布
、豊橋市）から分離・採集した新菌株である。この新菌
株は、後述する菌学的性状をもとにｒＢｅｒｇｅｙ’ｓ
　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｉｌｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
ＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇＶ＋　８ｔｈ　ｅｄｉｔｏｒ、
　１９７４Ｊの細菌分類書を参考にして同定され、アル
カリ土類金属に属する細菌であるところから、それぞれ
、アルカリゲネス・フェーカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｅｓ）７８８３６株（受託番号：
微工研菌寄第７０８３号（ＦＥＲＭＰ−７０８３）　）
およびアルカリゲネス・フェーカリス（Ａｌｃａｌｉｇ
ｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）　ＴＫ４９３５　（受託
番号：微工研菌寄第７０８４号（ＦＥＲＭ　Ｐ−７０８
４））と命名された。

Ｉ学煎性質 本発明のアクリル酸エステルの製造に用いられるＡｌｃ
ａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　７８８３６株と
Ａｌｃａｌ　ｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ　ＴＫ４９
３５株の菌学的性質を第１表に示す。

（以下余白） 沢 状　」　凹　凹　拐釧 佃 側 剥 ビ　嵯嵯浮僻 快 ム ト Ｏ○Ｏ■　■　■＠０■■ 州　州　州　刊 ◎　■ ＋＋＋ １．１．１１１１１１１１１１＋十＋ ＋＋＋ ＋　＋ ＋ １１１１１１１１１１１１＋＋ ±　＋　＋　＋ ＋十干＋ ＋＋＋ 小 ［株］［株］０ ■■ 頂１４８」定 次に本発明のアクリル酸エステルの製造に用いられる菌
株をＡ　ｌ　ｃａ　Ｉ　ｉ　ｇｅｎｅｓ属に属する菌株
であると同定した根拠を以下に示す。

本菌株ＴＨ８３６株およびＴＫ４９３５株はいずれも上
記試験結果より１グラム陰性であり１分裂により増殖す
る好気性細菌であり光合成によっては増殖しない」とい
う特徴を有する。このような細菌は。

Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａ＋によれば第７部に分類
されている。ここに属する科および属は次のようになる
。

１、　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科２、　Ａｚ
ｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科３、　Ｒｈｙｚｏｂｉ
ａｃｅａｅ科 ４、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科５、　Ｈａ
ｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科６、Ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ属 ７、、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属 ８、　Ｂｒｕｃｅｌｌａ属 ９、　Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属 １０、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属 ６ １１、Ｔｈｅｒｍｕｓ属 これら１１の科と属の性状と９本菌株ＴＨ８８６株およ
びＴＫ４９８５株の性状とを以下に比較する。

本菌株はいづれもＡｌ　ｃａ　Ｉ　ｉｇｅｎｅｓ属を除
く１０の科・属とは第２表に示す菌学的性質において全
く異なる。

第　２　表 （１８） 他方９本菌株はいずれも、第３表に示すように。

Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属と多くの点で性質が共通する
。

第　３　表 １、好気性 ２、　グラム陰性 ３、醗酵的でない ４、運動性有、鞭毛（１〜８本） ５、大きさ０．５−１．２　μｍ　ｂｙ　０．５−２．
６　μｍ６、通常単独で存在 ７、　色素を作らない ８、オギシダーゼ：陽性 ９、寒天を分解しない １０、カゼイン、ゼラチンを分解しない　−１１、生育
の適温２０〜３７°Ｃ １２、ｐＨ７，０ですげやく生育する １３、ガス状Ｎ２を固定しない 以上の結果から２本発明のアクリル酸エステルの製造に
用いられる菌株Ｔ■８３６株およびＴＫ４９３５株はＡ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属に属する細菌であると同定され
る。次に本菌株の種を決定するためにこの属の既知の４
種と比較した結果を第４表に示す。

第４表 ０ 本命→４菌株は、いづれもＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆ
ａｅｃａｌｉｓとは、プロピオン酸と醗酵の資化性能を
欠く点が異なるにすぎず、他の特徴はすべてこれと一致
する。よって９本菌株をＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａ
ｅｃａｌｉｓにきわめ株 てＲ４Ｒｅ−の菌株でありＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆ
ａｅｃａｌｉｓと同定した。、培養条件 培地としては格別である必要はなく、肉エキス。

酵ｆｆｌエキス、麦芽エキス、ペプトンなどの有機栄養
源、フモ・よＵ））ジ酸塩□、マグネシウム、ナトリウ
ム。

カリウム、マンガン、鉄々どの無機栄養源等を適宜含有
する通常の培地でよい。

炭素源としては、炭素源資化性試験において基質となっ
た各種アミノ酸、ＴＣＡサイクルメンバーの有機酸など
が用いられる。窒素源としては。

硝酸塩、亜硝酸塩およびアンモニウム塩などの無機窒素
やアミノ基の有機窒素などが用いられる。

培養温度は２０°Ｃ〜８５°Ｃ好ましくは２５°Ｃ〜３
０°Ｃである。培養ｐＨは５〜８好ましくは６゜５〜７
．５であシ、１日〜３日間好気的に攪拌又は振とうしな
がら培養を行なう。

反応組成 本発明めエステル反応は、このような培養条件のもとで
本Ｍ菌株を培養しその休止菌体、菌体抽出液（粗酵素液
）、精製酵素、固定化菌体および固定化酵素状態のうち
の少なくとも一つを適当に選んで用いる。本発明のアク
リル酸エステルの合成に必要な反応系の基本組成は第５
表に示される。なお１合成に当って、媒体としては水媒
体で行なうのが一般的である。

第　５　表 リン酸バッファー（ｐＨ８，０）　０．２Ｍアクリル酸
　１％（ｖ／ｖ） 各種アルコール 水 菌体もしくは菌体抽出液 菌体および抽出液の添加量は，菌体懸濁液として最終濃
度が６６００ｍ　（７）吸光度（ＯＤ６６０）ｆ　Ｏ．
　１以上，通常は１０〜２０の範囲にある。菌体抽出液
は，菌体を超音波破砕機やフレンチプレスで処理して得
られ，　２８０１ｍ　１７）吸光度（Ａ２８０）が０．
１以上，通常は０．５〜２０．０の範囲で用いられる。

反応ｐＨは５〜９の範囲にあればよい。好ましくは６〜
８の範囲に調整される。

酸成分はアクリル酸である。メタクリル酸は使用でき女
い。アクリル酸の使用可能な濃度は，最終濃度が０１％
（／ｖ）〜５％（ｖ／ｖ）であり、好ましくは０．５％
（　／ｖ）〜２％（Ｙ’ｖ）の範囲に選ばれる。アクリ
ル酸の使用により反応系組成のｐＨが低下しアクリル酸
の消費と共にｐＨが上昇する。このようなｐＨ変動を極
小にし反応系のｐＨが常時７前後になるようにするだめ
に本基本組成ではバッファーとして０．２Ｍのリン酸バ
ッファーが用いられる。

リン酸バッファーに代えて重炭酸ζ炭酸Ｎａバッファー
、トリス塩酸バッファーなどを用いることもできる。バ
ッファー濃度も０．　２　Ｍに限定されることはなく．
使用されるアクリル酸量や反応速度などに応じて適宜選
択される。

アルコールの使用量は，アクリル酸１モル当す。

通常，０．１〜１０モル程度とされるが，過剰上ル量使
用するのが好ましく，アクリル酸１モル当り。

１〜５モル使用するのが好ましい。しかし、アルコール
をあまり多く使用すると酵素失活のおそれがあるので，
通常，最終濃度で０．１％（’／ｖ）へ１０％（文ＶＬ
好ましくは０５％（／ｖ）〜２％（／ｖ）の範囲で使用
される。

反応温度は通常２０°Ｃ〜４０°Ｃの範囲内であれば良
い。好ましくは２５°Ｃ〜３５°Ｃである。

反応時間は基質添加量によシ幾分異なるが約１０分以上
であれば生成物の検出が可能である。

反応は均一系で行うことが好ましい。アルコールがブタ
ノールの場合にはその使用量が多くなると水とまざりに
くくなるため，攪拌して系を均一なエマルジョンとする
ことが好ましい。炭素数が５以上のアルコールについて
も同様な理由から攪拌などの手段によシ均ー系にするこ
とが好ましい。

一般的に，反応終了後は系から菌体を遠心分離によシ除
く。その上澄液を直接ガスクロマトグラ（２ｒ） フあるいは液体クロマトグラフにかけ生成物質の検出定
量を行なうか，もしくはその上澄液を必要に応じてさら
に熱処理（例えば１　０　０’Ｃにて１分間）を行い夾
雑する蛋白を除去してからガスクロマトグラフもしくは
液体クロマトグラフにかけ生成物質の検出定量を行なう
。

生成物質の確認は次のようにして行なった。

■．　アクリル酸，アルコールおよび酵素の３者が同時
に存在しただけ，生成物のピークが見られ（液体クロマ
トグラフにて）、そのピークが時間とともに増加する。

２、　ガスクロマトグラフおよび／もしくは液体クロマ
トグラフによシ既知物質と同じリテンションタイムを示
した。（既知物質は化学合成にて入手した） ３、ＧＣ　−　Ｍａｓｓ　（日立槽）によるＣＩ法によ
り生成物質が既知物質と同じ分子量であることを確認し
た。

生成されたアクリル酸エステルを採取するにはＩ２６） 常法の蒸留あるいは溶剤抽出が用いられる。

実　施　例二 次に実施例を例示して本発明を具体的に説明する。

実　施　例１ （菌体懸濁液の調製） 肉エキス１０ｇ、ポリペプトンｌ　Ｑ　ｇ　、　ＮａＣ
１５ｇ、蒸留水１１．そしてｐ　Ｈ７，０の組成の肉汁
液体培地１００ｍ１を調製した。これを５００ｍ１容坂
ロフラスコに入れ殺菌後、これにＡｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ　ｆａｅｃａｌｉｓＴＨ８８６株を植菌した。これを
３０°Ｃにて２４時間振とう培養した。この培養液を遠
心分離（１０，００Ｏｒｐｍ、ｌＱｍｉｎ、）　ｌ、、
沈澱した菌体をｐＨ７，０ノｌＪン酸バッファー０．０
５Ｍにて１回洗浄した。この洗浄菌体を同バッファにて
０Ｄ６６０　＝　１０゜０になるように希釈し、菌体懸
濁液としだ。

（反応系） 次の反応組成にて３０°Ｃで１時間反応させた。

リン酸バッファー　ＩＭ（ｐＨｓ、ｏ　）　Ｑ、２ｍｌ
アクリル酸　１０％水溶液（ｖ／ｖ）　０．１ｍｌ各種
アルコール　１０％水溶液（”’ｖ）、　０４ｍ１菌体
懸濁液　０Ｄ６６０　＝　１０　０．６ｍ　ｌアルコー
ル成分としてメチルアルコール、エチルアルコール、プ
ロピルアルコール、ブチルアルコール、ペンチルアルコ
ール、ヘキシルアルコール、オクチルアルコールが用い
られた。

（分析） 反応終了後、遠心分離にょシ菌体を除去し、その上澄液
をガスクロマトグラフもしくは液体クロマトグラフによ
シ分析し生成物の収量を定量した。

（結果） その結果を第６表に示す。

以下余白 実施例２ 実施例１と同様にして調製しだＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
　ｆａｅｃａｌ　１ｓＴＩ（８３６株の菌体懸濁液２０
ｍ１を１００ｍ１容のガラス製ビー力に入れ、氷冷水で
冷却しながら海上電気■製の超音波破砕機にて１０分間
菌体を破砕した。得られた破砕物を１５．ＯＯＱ　ｒ　
ｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上澄液を粗酵素液
とした。この粗酵素液を菌体懸濁液の代りに用いたこと
以外。

実施例１と同じ反応系にてエステル反応を行なった。そ
の結果を第７表に示す。

以下余白 実施例３ （粗酵素液の調製） 実施例１に示した肉汁液体培地にてＡｌ　ｃａ　Ｉ　ｉ
ｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ　ＴＫ４９３５を３０°Ｃ
で２４時間培養した。

培養液を遠心分離（１００，ＯＯｒｐｍ、　１０ｍ１ｎ
、　）　Ｌ、集めた菌体をｐＨ７，０のリン酸バッファ
ー００５Ｍで１回洗浄した。この洗浄菌体を同バッファ
ーにて。

０Ｄ６６０＝１０．０　になるように希釈して菌体懸濁
液を調製した。この菌体懸濁液２０ｍ１を１００ｍ１容
のガラス製ビー力に入れ、氷冷水で冷却しながら、海上
電機■製の超音波破砕機にて、１０分間菌体を破砕した
。得られた破砕物を１５．００Ｏｒ　ｐｍで２０分間遠
心分離し、得られた上澄液を粗酵素液とした。

（反応系） 次の反応組成にて、３０°Ｃで２時間反応させた。

以下余白 反応組成　添加量 リン酸バッファー■Ｍ（ｐｔ−ｒＢ、０）　０．２ｍｌ
アクリル酸　１０％水溶液（１’ｖ）　０．１　ｍ　ｌ
エチルアルコ−／ｌ／２０％水溶液（％）　’　０．１
ｍｌ粗酵素液　Ａ２８０　＝　１４．０　０，６ｍｌさ
らに、上記エチルアルコールの代りに、ブチルアルコ−
）ｖ、ヘキシルアルコールもしくはオクチルアルコール
をそれぞれ最終濃度が１％（％）になるように用いた。

また、各種アルコールに対し。

アクリル酸に代えてメタクリル酸を用いた反応も行なっ
た。反応は１００°Ｃの水浴水に１分間浸漬することに
より停止させた。沈澱した蛋白質は５０００ｒｐｍで１
０分間の遠心分離にて除去し、その上澄液を液体クロマ
トグラフにて分析し、生成エステルの収量を定量した。

（結果） その結果を第８表に示す。

第８表 発明の効果： 本発明のアクリル酸エステルの製造方法では。

菌株Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ＴＨ
８３６およびＴＫ４９３５を用いて、アクリル酸とアル
コールとを含有する反応系にアクリル酸エステルを製造
蓄積させることができる。エステル化に必要な酵素は、
培地の種類に無関係に、菌体増殖に比例して生産される
。

この生成物アクリル酸エステルはビニル基を有するため
、工業材料となりうる重合体を合成するための単量体と
して極めて有用である。これを他の既知の単量体と共重
合させることにより、より多くの有用な用途に利用でき
る。本発明によれば生４ 物学的にエステル反応を行うため、化学合成に比較して
極めて安全でかつ安価であるという利点もある。

以上 代理人　弁理士　山本秀策 ５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アルカリ土類金属に属する菌により、アクリル酸と
   一般式ＲＯＨ（ただし、Ｒは炭素数１〜８の直鎖のアル
   キル基）で表されるアルコールとからアクリル酸エステ
   ルを生産する。微生物によるアクリル酸エステルの製造
   方法。 ２、前記アルカリ土類金属菌がアルカリゲネス・フェー
   カリスである特許請求の範囲第１項に記載の製造方法。 ３、前記アルカリゲネス・フェーカリスがアルカリゲネ
   ス・フェーカリスＴＨ８３６株およびアルカリゲネス・
   フェーカリスＴＫ４９３５株のうちの少なくとも一方で
   ある特許請求の範囲第２項に記載の製造方法。